Features of Nf-kb expression in the outer granular and outer pyramidal layers of the motor cortex of rats with experimental type I diabetes mellitus

Full Text

В настоящее время сахарный диабет является одним из числа самых распространенных хронических заболеваний, приводящих к ранней инвалидизации и увеличению летальности среди населения. В 2021 г. зарегистрировано около 600 млн человек, страдающих СД, согласно данным Международной Федерации Диабета (Inter-national Diabetes Federation, IDF) [1].

Длительная гипергликемия приводит к метаболическим нарушениям и формированию различных осложнений при СД. Поражение центральной нервной системы (ЦНС) при СД проявляются развитием диабетической энцефалопатии (ДЭ). Диабетическая энцефалопатия – это снижение когнитивных функций на фоне нейродегенеративных нарушений в головном мозге при длительном течении СД [2].

Моторная кора человека участвует в регулировании поведения и социализации человека, планировании и выполнении произвольных движений. По данным литературы, головной мозг человека при СД характеризовался атрофией моторной коры и гиппокампа [3]. Моторная кора грызунов отвечает за определения своего пространственного положения за счет импульсов, поступающих при раздражении проприорецепторов, расположенных в мышцах, сухожилиях, суставах и связках [4].

Известно, что многие хронические заболевания, в том числе и СД, запускают процессы нейровоспаления в головном мозге по средствам активации микроглии. Нейровоспаление в головном мозге может нести как нейропротективную функцию, так и иметь повреждающий характер. Клетки микроглии участвуют в метаболизме нейронов, осуществляют иммуный надзор, регулируют синаптическую пластичность. Микроглия в ЦНС, по сути, представлена резидентными макрофагами, которые, при индукции нейровоспаления, могут трансформироваться в М1 (провоспалительные) и М2 (противовоспалительные). Однако длительная активация цитокинов приводит к более усиленной активации М2, что, наоборот, опосредует нейропротективный эффект [5].

Высокий уровень глюкозы оказывает отрицательное влияние на жизнеспособность микроглии. При колебании уровня глюкозы происходит активация сигнального пути МАРК/PI3K/Akt/Nf-kb, что ведет к высвобождению провоспалительных факторов. Провоспалительные факторы, такие как каспаза-3, Р2х7, интерферон-8 являются индукторами активации микроглии [5]. У крыс, страдающих СД, было выявлено повышение объема микроглии, что свидетельствует о прямой связи гипергликемии и нейровоспаления. Экспрессия ядерного фактора-Kb (NF-kb) обнаружена во всех типах клеток головного мозга. Наиболее выраженная экспрессия NF-kb была выявлена в церебральных кровеносных сосудах и глиальных клетках. NF-kb – это универсальный фактор транскрипции, который регулирует экспрессию генов иммунного ответа, клеточного цикла и апоптоза. В неактивированном состоянии NF-kb в комплексе с белками «ингибиторами kB» (IkB) локализуется в цитоплазме клеток, при индукции процессов нейровоспаления происходит связывание белка IkB с белками ряда киназ IkB, образуя комплекс IKK, что приводит к высвобождению NF-kB и его транслокации в ядро. В ядре происходит взаимодействие NF-kB с kb в промоторной зоне генов, отвечающих за инициацию воспаления, и активирует их транскрипцию [6]. Данные литературы по отношению роли NF-kB в головном мозге противоречивы. В нейронах Nf-kb регулирует рост синапсов, усиливает синаптическую активность и пластичность, тем самым оказывая нейропротективный эффект.

Ингибирование NF-kB в нейронах приводит к их апоптозу. Благодаря этому повышается выживаемость нейронов в ответ на патологические стимулы [7]. И, наоборот, при длительной активации NF-κB усиливает апоптоз нейронов в ЦНС за счет его провоспалительного действия, вызывая процессы нейровоспаления и гибели нейрональных клеток [8].

Цель работы

Характеристика особенностей экспрессии Nf-kb в наружном зернистом и наружном пирамидном слоях моторной коры головного мозга при диабетической энцефалопатии.

Методика исследования

Экспериментальное исследование было произведено на 50 белых беспородных крысах-самках, достигших 12-месячного возраста. Животные содержались в стандартных условиях вивария с естественным 12-часовым циклом дня и ночи при температуре воздуха (20 ± 2) ºС, влажности 60 %, свободным доступом к воде и пище. Для изучения отдаленных последствий влияния сахарного диабета I типа на кору головного мозга, моделирование СД I типа проводили в течение 6 месяцев. Было произведено однократное введение растворенного в цитратном буфере (0,1 М, рН 4,5) стрептозотоцина (Sigma, США) в дозе 60 мг/кг после 48-часовой пищевой депривации внутрибрюшинно. В исследование были включены животные с уровнем тощаковой (отсутствие корма в течение 4 часов до измерения) гликемии ≥15,0 ммоль/л. Контроль гликемии был произведен через 3 дня и 6 месяцев после инъекции стрептозотоцина. В эксперимент были включены 5 групп животных: группа № 1 – группа интакта (крысы без СД), группа № 2 – СД I типа (СД I + физ. р-р), группа № 3 фармакокоррекции аминалоном (СД I + аминалон), группа № 4 фармакокоррекции мефаргином (СД I + мефаргин), группа № 5 фармакокоррекции сукцикардом (СД I + сукцикард). Через 6 месяцев после моделирования патологии в течение 30 дней перорально в виде водных растворов вводили исследуемые производные ГАМК: мефаргин (20 мг/кг), сукцикард (50 мг/кг), а также аминалон (1000 мг/кг). Группе СД I типа без лечения вводили 0,9%-й раствор натрия хлорида. В качестве позитивного контроля использовали крыс без СД (интактных) той же партии животных. После курсового лечения исследуемыми соединениями у наркотизированных хлоргидратом животных был произведен забор образцов тканей коры головного мозга.

Головной мозг был фиксирован в течение 24 часов в 10%-м растворе нейтрального забуференного формалина (pH 7,4). После чего образцы тканей головного мозга обезвоживали и заливали в парафин по общепринятой гистологической методике. Расположение моторной кopы в гистологических препаратах головного мoзга крыс определяли с помощью стepeoтаксического атлaca. Выявление ядерного фактора транскрипции (Nf-Kb) проводили с помощью иммуногистохимического исследования с использованием первичных антител к белку Nf-Kb (transcription factor of the nuclear factor-kappaB) в соответствии с инструкциями производителя, (разведение 1 : 50) (Affinity Biosciences. China) и визуализирующей системы LSAB Kit (DAKO, Glostrup, Denmark). Определяли относительную площадь, занимаемую иммунопозитивным материалом в наружном зернистом и наружном пирамидном слоях моторной коры. Гистологические срезы фотографировали цифровой камерой AxioCam 305 color (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия) на базе микроскопа AxioImager A2 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия) с использованием объективов ×20, ×40.

Статистическую обработку полученных результатов проводили методами описательной и аналитической статистики с применением программного обеспечения Prism 6 (GraphPad Software Inc., США). Для каждого показателя определяли значения медианы (Ме) и интерквартильного диапазона (IQR).

Результаты представлены в виде Me (LQ; UQ), где Me – медиана, LQ – значение нижнего квартиля; UQ – значение верхнего квартиля. Распределение количественных показателей оценивали с использованием критерия Шапиро – Уилка. Межгрупповые различия оценивали с помощью критерия Краскела – Уоллиса и апостериорного критерия Данна. Различия признавали значимыми при p < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

При оценке результатов иммуногистохимического (ИГХ) исследования моторной коры крыс № 1 (интакт) обнаружена от умеренной до выраженной экспрессия ИРМ Nf-kb в цитоплазме и в вертикально расположенных отростках неповрежденных нейронов наружного зернистого и наружного пирамидного слоев, во внутреннем пирамидном слое экспрессия ИРМ была менее выраженной.

В единичных нейронах определялась ядерная экспрессия ИРМ Nf-Kb. В микроглии – слабовыраженная экспрессия.

При ИГХ-исследовании моторной коры головного мозга крыс группы № 2 (СД I + физ. р-р) с применением антител против Nf-kb была отмечена слабовыраженная экспрессия ИРМ Nf-kb в цитоплазме перикарионов и ядер в виде гранул. Более выраженная экспрессия ИРМ Nf-kb в ядрах нейронов определялась в поврежденных нейронах (сморщенных). В отличие от группы интакта в вертикально расположенных отростках нейронов наружного зернистого и наружного пирамидного слоев преобладала иммунонегативная реакция. В отдельных периваскулярно расположенных глиоцитах определялась умеренно выраженная цитоплазматическая и ядерная экспрессия Nf-kb.

Группа № 3 (СД I + аминалон) характеризовалась умеренной экспрессией ИРМ Nf-kb в нейронах и в их вертикально расположенных отростках в наружном зернистом и наружном пирамидном слоях моторной коры головного мозга, в остальных слоях была отмечена слабая экспрессия ИРМ, в том числе и вертикальных отростках нейронов.

В группе № 4 (СД I + мефаргин) была отмечена слабовыраженная экспрессия во всех слоях коры головного мозга, преимущественно экспрессия ИРМ Nf-kb определялась в ядрах поврежденных нейронов. В группе № 5 (СД I + сукцикард) отмечалась от слабой до умеренной экспрессия ИРМ Nf-kb в нейронах и их отростках во всех слоях моторной коры (рис. 1).

 

 

Рис. 1. Снижение экспрессии Nf-kb в наружном зернистом, наружном пирамидном слоях моторной коры при экспериментальной диабетической энцефалопатии: а – интакт-экспрессия ИРМ в цитоплазме перикарионов, в вертикальных отростках нейронов; б – СД I типа без лечения – макрофаг с экспрессией ИРМ; в – аминалон – наличие ИРМ в цитоплазме перикарионов и в вертикальных отростках нейронов; г – мефаргин – наличие ИРМ в поврежденных ядрах нейронов; д – сукцикард – наличие ИРМ в цитоплазме неповрежденных нейронов, в ядрах поврежденных нейронов. Иммуногистохимическое исследование, антитела против Nf-kb, докраска гематоксилином. Увеличение ×400. Черные стрелки – экспрессия ИРМ в нейронах. Белые стрелки – экспрессия ИРМ в вертикальных отростках нейронов

 

У крыс группы № 1 (интакт) в наружном зернистом слое моторной коры относительная площадь ИРМ составила 10,91 % (7,17–19,34), в группе № 2 (СД I + физ. р-р) – 4,65 % (3,06–8,76), что продемонстрировало достоверное снижение относительной площади ИРМ в группе № 2 (СД I + физ. р-р) на 6,26 % (p < 0,05). Относительная площадь ИРМ в наружном зернистом слое в группе № 3 (СД I + аминалон) составила 10,03 % (5,28–15,97).

Отмечается достоверно значимое увеличение площади ИРМ Nf-kb в группе № 3 (СД I + аминалон) в сравнении с группой № 2 (СД I + физ. р-р) на 5,38 % (p < 0,05). В группе № 5 (СД I + сукцикард) относительная площадь ИРМ в наружном зернистом слое Nf-kb составила 10,02 % (6,45–15,44), что достоверно выше значений площади ИРМ Nf-kb группы № 2 (СД I + физ. р-р) на 5,37 % (p < 0,05). В группах № 3 (СД I + мефаргин) и группах № 2 (СД I + физ. р-р) достоверно значимой разницы выявлено не было (рис. 2).

 

Рис. 2. Динамика изменения относительной площади Nf-kb-иммунореактивного материала в наружном зернистом и наружном пирамидном слоях моторной коры головного мозга: ** – различия между группами СД I типа и интакта статистически значимы (Anova-Тест), p < 0,01; *** – различия между группами СД I типа и интакта статистически значимы (Anova-Тест), p < 0,001; # – различия между группами фармакокоррекции в сравнении с группой СД I типа статистически значимы (Anova-Тест), p < 0,05; ## – различия между группами фармакокоррекции в сравнении с группой СД I типа статистически значимы (Anova-Тест), p < 0,01

 

В наружном пирамидном слое моторной коры крыс группы № 1 (интакт) относительная площадь ИРМ составила 11,86 % (6,43–14,63), в группе № 2 (СД I + физ. р-р) – 4,1 % (2,11–7,87), что продемонстрировало достоверное снижение относительной площади ИРМ на 7,76 % в группе № 2 (СД I + физ. р-р) (p < 0,05). Относительная площадь ИРМ в наружном зернистом слое в группе № 3 (СД I + аминалон) составила 9,94 % (7,97–15,03). Отмечается достоверно значимое увеличение площади ИРМ Nf-kb в группе № 3 (СД + аминалон) в сравнении с группой № 2 (СД I + физ. р-р) на 5,84 % (p < 0,05). В группах № 3 (СД I + мефаргин), № 5 (СД I + сукцикард) и группе № 2 (СД I + физ. р-р) достоверно значимой разницы выявлено не было.

Большинство исследований для изучения морфофункциональных изменений при СД I типа проведены на молодых крысах-самцах в возрасте 4–5 месяцев, и длительность экспериментального СД I типа не превышает 3–4 месяцев [1, 4, 5]. Для повышения достоверности нашего исследования эксперимент был проведен с участием старых крыс-самок, которые характеризуются на момент исследования уже имеющимися морфофункциональными нарушениями структур головного мозга.

Таким образом, у нас появляется возможность оценки совокупности влияния длительной гипергликемии при СД I типа и старения на кору головного мозга крыс-самок.

В группе № 1 (интакт) была выявлена цитоплазматическая и ядерная экспрессия ИРМ Nf-kb в нейронах. Экспрессия ИРМ Nf-kb преобладала преимущественно в цитоплазме неповрежденных нейронов и в вертикально расположенных аксонах нейронов наружного зернистого и наружного пирамидного слоев.

В группе № 2 (СД I + физ. р-р) выявлено отсутствие экспрессии Nf-kb в вертикально расположенных отростках нейронов наружного зернистого и наружного пирамидного слоев. Мы предполагаем, что Nf-kb в нормальных физиоло-гических условиях находится в свободном состоянии в цитоплазме нейронов и микроглии в неактивированном состоянии с целью нейропротекции, а в отростках нейронов – с целью улучшения синаптических связей и увеличения скорости передачи нервного импульса, что подтвержается данными литературы [10].

И, наоборот, в группе № 2 (СД I + физ. р-р) наблюдалась экспрессия ИРМ Nf-kb в ядрах поврежденных нейронов, что говорит о вероятной транслокации Nf-kb из цитоплазмы в ядро и активации процессов нейровоспаления. Выраженная экспрессия ИРМ Nf-kb была отмечена в ядре и цитоплазме глиальных клеток, располагающихся в околососудистом пространстве. Это также согласуется с данными литературы о том, что выраженная экспрессия Nf-kb в глиоцитах является причиной нейродегенеративных повреждений [9].

В наружном зернистом слое в группах № 3 (СД I + аминалон) и № 5 (СД I + сукцикард) экспрессия Nf-kb была более выраженной по сравнению с группой № 2 (СД I + физ. р-р) и ИРМ локализовался в цитоплазме нейронов, что может являться основанием полагать, что исследуемые препараты обладают нейропротекторными свойствами. В наружном пирамидном слое в группе № 3 (СД I + аминалон) экспрессия ИРМ Nf-kb более выражена в сравнении с группой № 2 (СД I + физ. р-р). В группах № 3 (СД I + мефаргин), № 5 (СД I + сукцикард) и группе № 2 (СД I + физ. р-р) достоверно значимой разницы выявлено не было.

Наше исследование продемонстрировало морфологические изменения в моторной коре головного мозга при СД I типа, которые характеризовались увеличением экспрессии Nf-kb в ядрах поврежденных нейронов, что опосредует нейровоспалительные реакции. Лечение СД I типа аминалоном и сукцикардом способствовало снижению патологических изменений и показало нейропротективный эффект.

About the authors

Ivan N. Tyurenkov

Volgograd State Medical

Author for correspondence.
Email: fibfuv@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7574-3923

Doctor of Medical Sciences, Professor, Corresponding Member of the Russian Academy of Sciences, Honored Scientist of the Russian Federation

Russian Federation, Volgograd

Alexey V. Smirnov

Volgograd State Medical; Volgograd Medical Reseach Center

Email: alexeysmirnov.volggmu@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-5351-6105

Doctor of Medical Sciences, Professor

Russian Federation, Volgograd; Volgograd

Aislu I. Bisinbekova

Volgograd State Medical; Volgograd Medical Reseach Center

Email: eaandm08@mail.ru

Assistant of the Department of Pathological Anatomy

Russian Federation, Volgograd; Volgograd

Dmitry A. Bakulin

Volgograd State Medical

Email: mbfdoc@gmail.com

Candidate of Medical Sciences, Senior Researcher

Russian Federation, Volgograd

Maxim A. Galkin

Volgograd State Medical

Email: maxner.2001@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0001-8816-0927

student 5’th year Faculty of Dentistry

Russian Federation, Volgograd

References

Supplementary files