CELL AND TISSUE THERAPY OF HEART

Full Text

Введение Сердечно-сосудистые заболевания в настоящее время являются ведущей причиной смерти в мире и, согласно прогнозам, будут оставаться таковыми в течение следующего десятилетия. Отсутствие значимой эндогенной регенеративной способности сердца диктует необходимость разработки терапевтических вмешательств для регенерации или замены поврежденной ткани и восстановления функциональных свойств миокарда. В настоящее время золотым стандартом лечения пациентов с терминальной стадией сердечной недостаточности является трансплантация сердца, но число реципиентов сильно ограничено нехваткой доноров [1, 2], однако донорские сердца часто повреждаются в результате заболевания или реанимационных действий [3]. Поэтому существует большая потребность в разработке методов лечения, которые предотвращают развитие терминальной стадии сердечной недостаточности. Клеточная терапия сердца Учитывая большое количество клеток, утраченных вследствие инфаркта миокарда (ИМ) - до 25% от массы левого желудочка (ЛЖ) в течение нескольких часов после ИМ, существует потребность в разработке методов эффективной и стабильной регенерации поврежденного органа. Для достижения этой цели во многих случаях клеточной терапии при остром ИМ стволовые клетки (СК) имплантировали в сердце через коронарную артерию. Эта стратегия ограничена сложностью регулирования расположения трансплантированных клеток и плохим приживлением [4]. Более15 лет назад предложена инъекция СК непосредственно в миокард (клеточная кардиомиопластика или клеточная терапия сердца). Все типы СК взрослых прошли доклинические исследования, в большинстве случаев проведены крупномасштабные клинические испытания их эффективности и безопасности [1]. Для прямой инъекции в миокард были использованы СК аутологичного костного мозга (КМ), том числе моно-нуклеарные клетки, СК c-kit+, мезенхимальные СК (МСК) и эндотелиальные клетки-предшественники (ЭКП) [5]. Однако положительные эффекты клеток КМ оказались временными вследствие их ограниченной дифференци-ровки в кардиомиоциты. Считается, что улучшение сердечной функции после инъекции таких клеток является результатом их паракринных эффектов, таких как неова-скуляризация и цитопротекция резидентных клеточных популяций. Исследования на животных показали, что ~17% клеток выжили при интрамиокардиальной доставке, причем этот процент увеличился до 75%, когда клетки вводили в течение 1 часа с момента индукции ИМ. В дальнейшем патофизиологическая среда не имеет клинического значения, поскольку пациенты получат трансплантат в течение нескольких дней в лучшем случае. Хотя доклинические исследования дали положительные результаты в отношении включения и механической интеграции СК в миокард реципиента, клинические испытания показали, что улучшение функции миокарда в большинстве случаев временное и ассимиляция донорских клеток тканью реципиента часто приводит к арит-могенным событиям, которые увеличивают заболеваемость и смертность пациентов [1]. Основные успехи последних лет достигнуты благодаря стратегии линейного репрограммирования фибро-бластов (обычно фибробластов кожи) в функциональные кардиомиоциты с помощью ретровирусной трансфекции генов транскрипционных факторов (ТФ) [1]. В рандомизированном клиническом исследовании фазы I инъекции резидентных сердечных СК в сердца пациентов наблюдалось уменьшение фиброзной рубцовой ткани, но к увеличению фракции выброса оно не привело [6]. Недостат № 2-2019 ФИЗИЧЕСКАЯ И РЕАБИЛИТАЦИОННАЯ МЕДИЦИНА, МЕДИЦИНСКАЯРЕАБИЛИТАЦИЯ 77 КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ФИЗИЧЕСКОЙ И РЕАБИЛИТАЦИОННОЙ МЕДИЦИНЕ ком этого типа клеток является низкое постимплантаци-онное приживление [7]. Кардиомиоциты, полученные из индуцированных плюрипотентных СК человека (human induced pluripotent stem cells, iPSC), при трансплантации в моделях ИМ у грызунов показали функциональную интеграцию с тканью хозяина [8], но клинические испытания еще не проведены. «Голая» клеточная кардиомиопластика не приводит к стабильному восстановлению электромеханических свойств сердца из-за низкого приживления клеток в ткани реципиента. Новый подход, позволяющий преодолевать это ограничение, состоит в создании биоинженер-ных трансплантатов сердечной ткани на основе межклеточного матрикса (МКМ), который является посредником при взаимодействии клеток с окружающей тканью и влияет на адгезию, пролиферацию, дифференцировку и миграцию клеток [9]. Тканевая инженерия сердца (ТИС) направлена на воспроизведение микросреды нативной сердечной ткани реципиента путем конструирования и ассимиляции биоинженерной ткани в организме реципиента. МШ миокарда представляет собой уникальный тканевой каркас, который состоит из функциональных и структурных белков, таких как коллаген, эластин, лами-нин, фибронектин, гликопротеины и специфические сигнальные молекулы, пространственно организует ткани и придает цельность органу. Сложная спиральная архитектура коллагеновых и эластиновых волокон связывает кардиомиоциты и обеспечивает слаженные сердечные сокращения, предотвращая чрезмерное растяжение мышечных волокон. Использование МКМ миокарда с сохраненной трехмерной архитектурой облегчит дифференцировку клеток, необходимых для регенерации сердца [10]. Эти свойства делают МКМ привлекательным в качестве опорной конструкции для имплантации регенеративных клеток в поврежденный миокард. Концепция тканевой инженерии сердца Тканевая инженерия направлена на создание жизнеспособной ткани сердечной мышцы, которая может быть трансплантирована в травмированное или неправильно сформированное сердце и восстановить его нормальную функцию. Теоретически она имеет ряд преимуществ над клеточной терапией, в частности в отношении эффективности и безопасности, так как СК являются потенциально онкогенными клетками [11]. Идеальный ТИС-конструкт должен отвечать следующим требованиям [1]: 1) совпадать с тканями реципиента по составу МКМ, быть биологически совместимым с ткан я ми организма, не вызывать иммунное отторжение и воспалительную реакцию in vivo, которая приводит к значительной потере клеток конструкта; 2) иметь морфологические свойства, соответствующие нативному миокарду, и клинически релевантную толщину, биоматериал должен способствовать выравниванию кардиомиоцитов и дифференциров-ке in vitro и in vivo и улучшать сократительные свойства трансплантата; сохранять жизнеспособность до и после имплантации в ткани реципиента; 4) обеспечивать достаточную диффузию кислорода; 5) быть биоразлагаемым с такой скоростью, которая согласуется с уровнем регенерации нативной ткани; 6) способствовать межклеточной адгезии посредством формирования щелевых контактов и мембранных каналов; 7) генерировать силу сжатия в диапазоне нативной ткани, а также поддерживать электрическую интеграцию с тканью реципиента и распространение электрического импульса, синхронно сокращаться с тканями реципиента; 8) обладать механической целостностью, которая обеспечивает механическую поддержку во время трансплантации и регенерации in vivo, и механической жесткостью, кото р ая может немного превышать жесткость фиброзной ткани, чтобы предотвратить разрастание рубца. Кардиомиоциты в тканевом конструкте должны быть удлиненными и выравненными при высокой плотности клеток ~ 108 клеток/см3 и организованы в сосудистой сети с межкапиллярным расстоянием ~ 20 мкм [12]. Этим целям отвечают культивирование клеточного «листа» с носителем или без него с последующим наложением в виде сердечной «заплаты» и децел-люризация нативного сердца с последующей репопуляцией донорскими клетками. Технология клеточного листа. Клеточные листы без каркаса Кардиомиоциты, культивируемые на стандартных пластиковых чашках в течение длительного периода, имеют тенденцию отслаиваться от подложки в виде монослойного клеточного листа. В клеточных листах полностью сохраняются структурные и адгезионные белки МКМ, что делает возможным создание ткани наслоением клеточных листов. Когда листы, состоящие из кардиомиоцитов, наслаивают друг на друга, они образуют щелевые контакты, устанавливают электрические соединения и приобретают способность сокращаться in vitro. При трансплантации клеточных листов (патчей) в сердце реципиента клетки сохраняются почти в 10 раз лучше по сравнению с инъекцией в миокард, при этом наблюдаются уменьшение апоптоза кардиомиоцитов и ангиогенез. Патчи из аутологичных кардиомиоцитов улучшили сократимость ЛЖ и сердечную деятельность и уменьшили фиброз после имплантации в инфарктные сердца крыс и свиней, а также в сердца собак в модели сердечной недостаточности. Трансплантация патчей из кардиомиоцитов приводит к значительному уменьшению желудочковой аритмии по сравнению с интрамио-кардиальной инъекцией клеток [13, 14]. Преимущества использования сердечных патчей: 1) они могут быть нанесены непосредственно на поврежденную ткань реципиента; 2) позволяют избежать протеолитической потери сердечных клеток и белков клеточной поверхности, которые важны для формирования щелевых контактов и электрической связи; 3) облегчают образование диффузных щелевых соединений и в то же время способствуют плотной цитоархитектуре сердечной ткани; 4) способствуют васкуляризации благодаря непосредственному контакту сердечных патчей с тканью реципиента и их ангиогенным свойствам, продемонстрированным в доклинических исследованиях. Использование смешанной популяции кардиомиоцитов и эндотелиальных клеток (ЭК) для формирования патча улучшает сердечную функцию и ангиогенез и уменьшает фиброз, как и многослойные конструкты, в которых листы кожных фибробластов чередуются с листами из ЭК. Фибробласты генерируют МШ, который стимулирует рост кардиомиоцитов желудочка [15]. Кардиомиоциты не только функционируют как сократительные элементы, но и секретируют ангиогенные факторы роста, особенно в гипоксическом состоянии [16]. Наиболее разработанной стратегией является трансплантация листов аутологичных скелетных миобластов (СМ), устойчивых к ишемии и способных дифференцироваться в клетки немиоцитарных линий, эффективность их трансплантации доказана экспериментально при различных видах повреждения сердца [17]. Имплантация 5 четы 78 физическая И реабилитационная медицина, мЕдИцИнскАЯрЕАБИлИТАцИЯ май 2019 КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ФИЗИЧЕСКОЙ И РЕАБИЛИТАЦИОННОЙ МЕДИЦИНЕ рехслойных листов аутологичных СМ в разные участки сердца улучшила сердечную функцию и клиническое состояние пациента с дилатационной кардиомиопати-ей, через год после имплантации было решено удалить кардиостимулятор, который использовался до операции [18]. Используя листы, полученные в совместной культуре сердечных клеток с ЭК, Н. Sekine и соавт. [19] создали трехмерную сердечную ткань путем наложения нескольких клеточных листов и культивирования конструкта в биореакторе. ЭК образуют трубчатые просветы, которые, соединяясь с капиллярами, создают в патчах перфу-зируемые кровеносные сосуды. Такая ткань сокращается спонтанно и может быть успешно имплантирована с прямым анастомозом сосудов. Основным механизмом улучшения сердечной функции являются аутокринно-паракринные эффекты цито-кинов, секретируемых трансплантированными клетками, которые способствуют их приживлению и последующему функционированию. СМ индуцируют ангиогенез и ослабляют избыточное образование фиброзной ткани после ИМ в основном за счет продукции факторов VEGF(vascular endothelial growth factor) и HGF (hepatocyte growth factor). Белок VCAM (vascular cell adhesion molecule), секретируемый сердечными клетками-пред-шественниками, способствует миграции ЭК, предотвращает повреждение кардиомиоцитов оксидантным стрессом и стимулирует приживление клеток после трансплантации в сердце. Листы сердечных клеток, включая кардиомиоциты, эндотелиальные и интрамуральные клетки, способствуют ангиогенезу в инфарктном миокарде, что приводит к улучшению сердечной функции. В клеточных листах, состоящих из кардиомиоцитов, фи-бробластов и ЭК из сердца новорожденных крыс, трансплантированных в подкожную ткань, наблюдали зрелые сосуды, состоящие из ЭК клеточных листов и клеток, происходящих из тканей реципиента [17, 20]. Патчи на основе децеллюризированного миокарда. В качестве альтернативы цельно-органной стратегии ТИС с целью исправления дефекта миокарда используют тонкие срезы полностью децеллюризированного миокарда свиньи, крысы и человека как носителя для репа-ративных клеток. Кардиомиоциты в трехмерной сердечной ткани достигают более высокой степени зрелости, поэтому такая ткань более стабильна, чем клеточный лист [11, 21]. Клеточно-матриксные каркасы, собранные из децеллюризированных листов миокарда и фибринового гидрогеля, засевали МСК КМ и имплантировали крысам с ИМ. Отмечена усиленная миграция МСК в ишемический миокард. Через 4 недели после имплантации в зоне инфаркта заметно усиливается ангиогенез и ар-териогенез, наблюдается увеличение размера и числа кровеносных сосудов. Размеры патча по ширине и длине теоретически не ограничены, однако васкуляризация и перфузия in vitro являются обязательным требованием к мышечной ткани, которая для исправления большого рубца миокарда должна быть несколько миллиметров толщиной. Патч имплантируют таким образом, чтобы его края находились в контакте со здоровым миокардом, при этом происходит электрическое соединение между сердцем реципиента и трансплантатом, достаточное для распространения электрического импульса и для усиления проводимости через зону инфаркта в клетках реципиента, спасенных паракринным эффектом [11]. Патчи из подслизистой основы мочевого пузыря или тонкого кишечника применяют в экспериментальных моделях болезни сердца, однако только тканеспецифич ный МШ, то есть МШ миокарда идеально подходит для регенеративной терапии сердца. МКМ децеллюри-зированного миокарда имеет ряд преимуществ, в том числе сохранение трехмерной архитектуры и элементов сердечной ткани, связанных с поддержкой и дифферен-цировкой клеток. Срезы ЛЖ человека и свиньи 300 мкм толщиной децеллюризировали, затем полученные бес-клеточные каркасы рецеллюризировали in vitro MŒ или мышиными кардиомиоцитами, дифференцированными из iPSC. Кардиомиоциты синхронно сокращались после посева на матрикс, причем сокращение было достаточно сильным, чтобы привести к видимому движению ма-триксных пластин [22]. Однако эти тонкие бесклеточные пластинки обеспечивают лишь ограниченные возможности регенерации. В настоящее время исследователи сосредоточились на оптимизации процедуры децел-люризации более толстых (10-15 мм) пластин из ткани миокарда, сохраняющими васкулатуру. Полученные перфузионной децеллюризацией толстые бесклеточные пластины МКМ свиного миокарда, сохраняющие ультра-структурные свойства нативной ткани и внутренней сосудистой сети, жестче, чем нативные ткани, но заселенные соответствующими клетками, эти каркасы могут служить в качестве биомедицинских конструктов для трансмуральной трансплантации и замены постинфарктного рубца [23]. Сердечный конструкт должен: 1) быть достаточно толстым, чтобы сокращаться с соответствующей силой согласованно с сердечной стенкой, 2) пульсировать синхронно с соседними кардиомиоцитами, 3) не генерировать воспалительные реакции, 4) продуцировать тканеспецифичный МКМ, 5) клинически релевантно улучшать сердечную функцию [24]. На моделях острого и хронического ИМ показано, что патчи на основе бесклеточного МКМ стимулируют значительное улучшение функции сердца, которое коррелирует с привлечением клеток-предшественников, экспрессирующих ранние и поздние маркеры кардиоми-оцитарной дифференцировки. При этом патч быстро ва-скуляризируется и индуцирует процесс конструктивного ремоделирования. Таким образом, бесклеточные патч-имплантаты сами по себе, без добавления биопрепаратов, биологически активны и стимулируют восстановление сердечной функции на основе предшественников кардиомиоцитов даже после того, как сформировалась рубцовая ткань [25]. Децеллюризация сердца Одной из ключевых проблем использования децеллюризированных органов является иммунный ответ реципиента на клеточные белки и ДНК донорского органа. Конечная цель децеллюризации - удаление всего клеточного материала без ущерба для состава, механических свойств и биологической активности МШ. В процессе децеллюризации клетки разрушаются и отделяются от МКМ. Поток детергента вымывает из сердца растворимые биомолекулы и клеточный материал, оставляя только МКМ (структурные белки и сигнальные молекулы, важные для направления регенерации ткани после рецеллюризации). Методы децеллюризации различаются комбинацией ионных и неионных детергентов, хелатирующих агентов и ферментов. Для разрушения клеточных мембран, высвобождения и удаления клеточного содержимого из МШ используют ретроградную аортальную или антеградную коронарную перфузию децеллюризирующих растворов [9], ультразвук [10, 23], встряхивание [23], осмотический шок [9], заморажива № 2-2019 ФИЗИЧЕСКАЯ И РЕАБИЛИТАЦИОННАЯ МЕДИЦИНА, МЕДИЦИНСКАЯРЕАБИЛИТАЦИЯ 79 КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ФИЗИЧЕСКОЙ И РЕАБИЛИТАЦИОННОЙ МЕДИЦИНЕ ние и оттаивание [26]. Обычно для децеллюризации используют анионные детергенты додецилсульфат натрия (SDS) и дезоксихолат натрия, неионный детергент Тритон Х-100 (ТХ100), а также ферменты трипсин и ДНКазу [1, 2, 9, 23, 27]. Обработка ДНКазой - традиционный способ удаления остаточной ДНК из децеллюризированной ткани, но инкубация детергентно децеллюризированного МКМ в среде с телячьей сывороткой является недорогой и удобной альтернативой для устранения остаточной ДНК [22]. Некоторые авторы считают, что достаточно удаления ДНК детергентами и присутствие малых количеств ДНК (<50 нг/мг лиофилизованной ткани) не является препятствием для предотвращения иммуногенности [28]. Технология децеллюризации и рецеллюризации сердца крысы воспроизведена для крысиных [29, 30], мышиных [31], свиных [10, 32] и человеческих сердец [22, 27]. В поиске идеального протокола группа Р. Akhyari [33] провела прямое сравнение различных протоколов де-целлюризации сердца на гистологическом и биохимическом уровне с протоколом, разработанным ими для децеллюризации ткани миокарда. Чтобы исключить различия перфузии, связанные с обработкой ткани, все сердца были децеллюризированы при одинаковых условиях в перфузионной системе, контролируемой с использованием программного обеспечения. Протокол I. Сердца крыс перфузировали гепарини-зированным фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ), содержащим аденозин, затем раствором SDS в деионизированной воде (ДВ), промывали ДВ, перфузи-ровали раствором ТХ100 в ДВ и ФСБ с антибиотиками. Полученные каркасы засеяли кардиомиоцитами новорожденных крысят интрамуральной инъекцией и через 8 дней получили пульсирующие сердца. Протокол II. Сердца свиней замораживали при -80°C, через 16 ч оттаивали в воде для лизиса клеток и помещали в циркулирующий гипотонический раствор. Гипотонический раствор заменяли ФСБ. Затем сердце последовательно перфузировали раствором трипсина/ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА)/№^ в ФСБ, раствором ТХ100, раствором дезоксихолевой кислоты, 0,1% уксусной кислотой. После каждого раствора сердца промывали ДВ для удаления остатков детергентов. Протокол III. После первого этапа перфузии сердца раствором №С/глицерина/№^/ ЭДТА продолжили перфузию раствором дезоксихолевой кислоты/Na^ в ДВ, затем раствором №С/глицерина/№^/ ЭДТА, затем раствором SDS/NaN3, затем раствором TX100 и NaN3 в ДВ. На последнем этапе каркас промывали ФСБ с антибиотиками. Протокол IV. Перфузию начинали гепаринизирован-ным ФСБ с аденозином, продолжали раствором SDS/де-зоксихолевой кислоты/Na^ в ДВ; затем раствором NaCl/ глицерина /Na^/ЭДТА; затем раствором сапонина/Na^ в ДВ; затем снова раствором №С/глицерина/№^/ЭДТА. Эти этапы чередовались с перфузией ДВ между ними. Для завершения процесса децеллюризации сердца пер-фузировали раствором ДНКазы в ФСБ. После децеллюризации анализ стандартных участков сердца (апикальной области, середины желудочка и базальных отделов) обнаружил поразительные различия в микроархитектуре и составе МШ: высокую гетерогенность МШ каркасов, полученных по протоколам I и II, а также интактный, сравнимый с нативным, МШ каркасов, генерируемых по протоколам III и IV. Цитоплазматические остатки полностью отсутствовали только в каркасах, децеллюризированных по протоколу III, небольшие клеточные остатки определены на некоторых срезах МШ-IV. Количество остаточной ДНК - индикатор качества децеллюризации. Протокол I удаляет 43%, протокол II - 80% нативной ДНК, только протоколы III и IV генерируют каркасы с менее 0,5% содержанием ДНК. P. Akhyari и др. [33] пришли к выводу, что каждый протокол имеет свои преимущества и недостатки. Сравнение четырех протоколов демонстрирует необходимость тщательного и осторожного удаления клеток, чтобы избежать повреждения МКМ. U. Sarig и соавт. [23] сравнили эффективность следующих дополнений к детергентно-ферментативному протоколу децеллюризации: 1) децеллюризация при перемешивании и встряхивании; 2) ультразвук, 3) перфузия через коронарную артерию. Все дополнения привели к значительно более эффективной децеллюризации ткани по сравнению с исходным протоколом, особенно 2-й и 3-й варианты. Деградабельный нетоксичный неионный детергент октилглюкопиранозид превосходит SDS и TX100, так как достигает полной децеллюризации, сохраняя структуру и механические функции МКМ, а его способность разрушать мембраны бактерий придает антибактериальные свойства [26]. Человеческие сердца, децеллюризированные коронарной перфузией SDS, сохранили трехмерную геометрию камер, функциональную компетентность клапанов, ориентацию волокон, компоненты МКМ и структуру микрососудов. Децеллюризированное сердце поддерживает прикрепление, выравнивание и выживание МСК КМ на ЛЖ in vitro [34]. В структурно-неоднородных органах, таких как сердце, важно сохранить целостность МКМ в наиболее тонких областях (например, клапанах) во время децеллю-ризации и полностью удалить остатки клеток из более толстых областей. Высокие темпы тока жидкости, необходимые для поддержания физиологического давления, могут растянуть или повредить тонкие ткани, но более низкое давление замедляет процесс и увеличивает вероятность контаминации. Новый ретроградный метод децеллюризации перевернутого свиного сердца уменьшает скорость входящего потока. «Перевернутый» метод показал высокую эффективность коронарной перфузии, лучший отток продуктов распада клеток, более высокое содержание коллагена и эластина в аортальном клапане, более низкое содержание ДНК, а также лучшее поддержание формы сердца после децеллюризации по сравнению с ранее опубликованными методами. Ориентация сердца играет важную роль в оптимизации эффективности децеллюризации и поддержания целостности МКМ. Результаты исследования показывают, что для получения оптимального каркаса для регенерации сердца необходимы непрерывные комплексные измерения в режиме реального времени [35]. Рецеллюризация Децеллюризированное сердце - идеальный каркас для ТИС, так как засеянные клетки оказываются в такой же микросреде, как и в нативном сердце. Для рецеллю-ризации сердца предложены многие типы клеток из аутологичных и аллогенных источников, которые могут дифференцироваться в пульсирующие кардиомиоциты: скелетные миобласты, резидентные сердечные СК, моно-нуклеарные клетки КМ и периферической крови, ГСК и МСК КМ и жировой ткани, iPSC [23, 31, 36]. Кардиомиоциты нужны, чтобы заполнить МКМ сердечной мышцы, фибробласты - для обновления МКМ, ЭК - для выстилки 80 физическая и реабилитационная медицина, медицинскаяреабилитация май 2019 КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ФИЗИЧЕСКОЙ И РЕАБИЛИТАЦИОННОЙ МЕДИЦИНЕ кровеносных сосудов. Клетки гладкой мускулатуры кровеносных сосудов и клетки, которые контролируют сердечный ритм, также должны быть включены в ТИС. Для обеспечения пациентоспецифичности предпочтительно использование аутологичных клеток; аллогенные клетки должны быть тщательно подобраны по антигенам гистосовместимости [9]. Большинство исследователей использует два или более типов клеток, например, ЭКП для кровеносных сосудов и мышечные предшественники для стенок камер. Теоретически этот подход может обеспечить конструкт полным набором клеточных типов, в том числе клетками сосудов и несколькими разновидностями кардиомиоцитов [3]. M.J. Robertson и др. [29] рецеллюризировали децел-люризированные сердца крыс неонатальными кардио-миоцитами и ЭК аорты. ЭК 7 дней инфузировали через брахиоцефальные артерии (БА), или аорту, или нижнюю полую вену (НПВ), затем в стенку ЛЖ инъецировали кардиомиоциты, через сутки к вершине и основанию каркаса присоединяли электроды, чтобы стимулировать сердечную деятельность. Независимо от способа доставки ЭК выстилали коронарные сосуды и пролиферировали на их стенках, не проникая в паренхиму каркаса. В некоторых случаях ЭК, инфузированные через НПВ и БА, локализованы в одних и тех же сосудах, что свидетельствует о наличии единого кровотока между артериальными и венозными коронарными сосудами в этих каркасах. Репопуляция васкулатуры каркаса ЭК перед рецеллюри-зацией кардиомиоцитами повысила давление, создаваемое сердцем при электростимуляции, в 6 раз. Эти результаты показывают, что правильное сочетание клеточных типов и порядок их доставки будут иметь решающее значение для оптимальной функции рецеллюризирован-ных цельных органов [29]. Хотя оптимально децеллюри-зированные каркасы сохраняют биологические сигналы нативного матрикса, важные для рецеллюризации, добавление в среду факторов пролиферации и дифферен-цировки способствует привлечению, пролиферации, повышению жизнеспособности и индукции направленной кардиоспецифичной дифференцировки СК и ангиогенезу. К критически важным относятся факторы bFGF (basic fibroblast growth factor), TGF1 (transforming growth factor b1, VEGF, HGF, BMP (bone morphogenetic protein),SDF-1 (stromal cell-derived factor 1) и ангиопоэтин-1 [9, 29]. Использование клеток, полученных из iPSC реципиента, в регенеративной медицине - альтернативный вариант для регенерации поврежденного сердца. iPSC практически идентичны эмбриональным СК на уровне экспрессии маркеров плюрипотентности, имеют преимущество неограниченного пролиферативного потенциала и высокоэффективной дифференцировки в кардиомиоциты [17, 37]. Следует отметить, что iPSC способны генерировать тератомы, даже после трансплантации терминально дифференцированных клеток, следовательно, при их использовании остается проблема безопасности. Васкуляризация - важный аспект при применении цельных органов или МКМ, без которого конструкт не жизнеспособен. Большинство трансплантированных клеток быстро погибает или мигрирует в пограничную с областью инфаркта зону вблизи коронарных сосудов. Для обеспечения достаточного количества кислорода и питательных веществ метаболически активные трансплантаты должны быть снабжены сосудистой сетью, достигающей кардиомиоцитов в пределах не более 200 мкм [24]. Наиболее перспективными клетками являются ЭКП, поскольку они могут непосредственно участвовать в образовании новых сосудов или стимулировать процесс, высвобождая паракринные факторы, а их выживаемость и пролиферативный потенциал выше, чем у терминально дифференцированных ЭК [24, 38], а также МСК, способные дифференцироваться в клетки сосудистой стенки [24]. Для специфической васкуляризации конструкта применяют смешанные клеточные культуры и добавление ангиогенные факторов. Совместное культивирование, целью которого является использование паракринных эффектов между аллотипическими клетками, показало, что добавление не-миогенных клеток улучшает васку-ляризацию конструктов in vivo в модели ИМ у крыс. Ангиогенные молекулы VEGF, ангиопоэтин-1 и bFGF, ковалентно иммобилизованные на каркасе, синергетически увеличивают пролиферацию засеянных ЭК и способствуют формированию капилляроподобных трубок в модифицированных каркасах [39]. При имплантации в сердце крысы каркасы с иммобилизованным VEGF увеличили ангиогенез по сравнению с неизмененными каркасами и стабильность терапевтического эффекта [40]. Эти исследования показали, что ковалентная иммобилизация ангиогенных факторов роста на каркасах может локализовать и поддерживать активность биомолекул, предотвращая их вымывание или интернализацию клетками, и в конечном итоге повысить эффективность биологически активных молекул. Непрерывная перфузия сосудистой сети ТИС способствует созреванию сосудистой стенки, как это происходит во время эмбрионального развития сосудов. Сочетание пульсирующего перфузионного потока внутри и снаружи сосудистого просвета улучшает транспорт и аэробный метаболизм клеток и способствует продукции МШ, выравниванию кардиомиоцитов и сохранению их дифференцированного фенотипа, формированию ткани миокарда [41]. Критерии оценки ТИС. Критерий механической поддержки учитывает, выдержит ли ткане-инженерный конструкт механическую нагрузку, а также не будет ли он препятствовать нормальному функционированию окружающих тканей. Неадекватные механические свойства могут привести к серьезным последствиям, вызывая чрезмерную нагрузку на пораженное сердце, если трансплантат слишком жесткий, или отторжение трансплантата, если он недостаточно жесткий. В настоящее время прямое сравнение результатов, полученных в разных медицинских центрах, невозможно из-за больших расхождений в сроках трансплантации и экспериментальных оценках. Кроме того, были использованы различные модельные животные, в том числе крысы, кролики и свиньи. Различаются функциональные и морфологические свойства ТИС, которые измеряют и описывают различные исследовательские группы, методы, с помощью которых эти свойства были измерены, и степень регенерации сердца, которую сочли достаточной. Например, величина фракции выброса варьируется от 12 до 77%. Сроки трансплантации и обязательный набор показателей (толщина стенки ЛЖ, клеточность, типы клеток, степень васкуляризации и др.) должны быть четко определены для каждой модели заболевания сердца. А. Byron и др. [42] анализировали белки МКМ методами протеомики, и по их оценкам, в МКМ большинства органов насчитывается более 100 белков. J. Barallobre-Barreiro и др. [43] идентифицировали ряд белков, участвующих в ремоделировании сердца, и описали изменения в сердечном МШ свиньи после ишемии. Перед трансплантацией ТИС важно продемонстрировать, что № 2-2019 ФИЗИЧЕСКАЯ И РЕАБИЛИТАЦИОННАЯ МЕДИЦИНА, МЕДИЦИНСКАЯРЕАБИЛИТАЦИЯ 81 КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ФИЗИЧЕСКОЙ И РЕАБИЛИТАЦИОННОЙ МЕДИЦИНЕ адгезионные свойства МКМ не нарушены в процессе де-целлюризации вследствие денатурации белка. Биосовместимость в контексте ТИС включает в себя функционирование ТИС без цитотоксичности. Следует различать биосовместимость как способность материала к выполнению специфических функций и биодегра-дабельность как механизм, который предопределяет продолжительность жизни имплантируемого материала, однако эти понятия рассматриваются в тандеме, так как мало пользы от биосовместимого материала, который разлагается на токсичные компоненты. Трансплантат на основе децеллюризированного МКМ должен соответствовать этому двойному критерию, а его клетки -заменять МШ собственными компонентами, тем самым ре-моделируя свое окружение по мере необходимости [2]. Клиническое применение ткане-инженерных де-целлюризированных сердечных клапанов Клиническая адаптация регенеративных заменителей клапанов зависит от их функциональности и долговечности. Благодаря хорошей функциональности и отсутствию дегенерации, кальцификации и иммунореактивности, использование децеллюризированных аллотрансплантатов для легочного и аортального клапанов является перспективным, с минимальным возникновением повторных операций и возможностью адаптивного роста [44]. Легко доступные ксеногенные клапаны на основе децеллюризированных свиных клапаны приводят к структурной недостаточности, тяжелому стенозу и необходимости повторной операции у >50% пациентов по причине остаточной иммуногенности [45, 46]. Эти драматические результаты подчеркивают предпочтительность аллогенного материала для клинического применения. Однако, несмотря на огромный прогресс в развитии тканевой инженерии и регенеративный потенциал, продемонстрированный в доклинических исследованиях, клинически значимый продукт еще не реализован. Потребуются дополнительные клинические исследования для выявления потенциальных рисков, таких как канце-рогенность и генотоксичность, определения качества (стабильности, пороговых значений для примесей) и эффективности продукта [47]. Заключение Биомиметическая парадигма ТИС открывает новые перспективы тканевой терапии сердечно-сосудистых болезней. «Реконструированное» сердце может быть использовано для ортотопической трансплантации всего органа или в качестве источника тканей для определенных хирургических операций (замена сердечных клапанов, стенки желудочка и т.д.). В случае ИМ может быть предпочтительным использование патчей миокарда с сохранением толщины и структуры ткани, что позволит упростить операцию, обеспечивая в то же время надлежащую функциональную поддержку. Такие конструкты в состоянии поддерживать засеянные клетки ex vivo и in vivo и анастомоз с васкулатурой реципиента после трансплантации. Биоинженерный клапан может работать дольше, чем искусственный или донорский, благодаря способности расти вместе с пациентом. Считается, что частичный подход может помочь пациентам с тяжелыми пороками сердца, такими как синдром гипоплазии левых отделов сердца, при котором половина сердца недоразвита [3]. Что касается цельного сердца, текущее состояние этой работы характеризуется тем, что полная атромботи-ческая реэндотелизация ТИС, обеспечивающая функциональное восстановление, еще не достигнута. Основными проблемами ТИС являются необходимость получения больших количеств иммунологически совместимых пациентоспецифичных клеток, реиннервация сердечной мышцы, развитие хирургических методов имплантации ТИС в организм реципиента, предотвращение тромбо-образования [9]. Открытыми остаются вопросы: 1) какие типы клеток и их комбинации лучше подходят для ТИС, 2) электромеханическая связь клеток в ТИС для синхронной и стабильной сократительной функции, 3) васкуля-ризация и интеграция конструкта с тканями реципиента [48].Таким образом, тканевая инженерия сердца находится сегодня на стадии доклинических исследований.

About the authors

S G Scherbak

SPbSU; St. Petersburg City hospital №40

Email: kreml74@mail.ru
Department of postgraduate medical education, Faculty of Medicine St. Petersburg, Russia

D G Lisovets

St. Petersburg City hospital №40

St. Petersburg, Russia

A M Sarana

SPbSU; St. Petersburg City hospital №40

Department of postgraduate medical education, Faculty of Medicine St. Petersburg, Russia

S V Makarenko

SPbSU; St. Petersburg City hospital №40

Department of postgraduate medical education, Faculty of Medicine St. Petersburg, Russia

T A Kamilova

St. Petersburg City hospital №40

St. Petersburg, Russia

A S Golota

St. Petersburg City hospital №40

St. Petersburg, Russia

M A Snegirev

St. Petersburg City hospital №40

St. Petersburg, Russia

References

Supplementary files