Microviscosity of tumor cell membranes

Full Text

Введение

Микровязкость мембран играет важнейшую роль в функционировании живых клеток, так как является одним из ключевых параметров регуляции ее биофизического и морфологического состояния. Микровязкость цитоплазматической мембраны контролирует множество процессов, таких как трансмембранный транспорт молекул, проницаемость для молекул, каталитическая активность ферментов. Изменения вязкостных и эластических свойств мембран живых клеток зачастую связаны с развитием тех или иных патологий в организме, в том числе онкологических заболеваний. Однако, связь между микровязкостью мембраны, её липидным составом и ответом опухолевых клеток на лечение, изучена мало. В первую очередь, это связано с отсутствием адекватных методов, позволяющих с высокой точностью измерить микровязкость и липидный состав мембран клеток в реальном времени. Поэтому актуальной задачей является прижизненный анализ изменений микровязкости мембран живых клеток.

Особый интерес представляет исследование микровязкости опухолевых клеток и тканей ввиду повсеместного распространения онкологических заболеваний. Злокачественные опухоли занимают второе место как в общей статистике заболеваний, так и в статистике смертности пациентов. Известно, что вязкость опухолевых клеток отличается от нормальных, теоретически, этот параметр может служить диагностическим показателем. С другой стороны, известно, что микровязкость опухолевых клеток изменяется в процессе терапии (ФДТ, химиотерапии) и, следовательно, может служить инструментом для оценки эффективности проводимой терапии.

Понятие вязкости и её роль в жизнедеятельности клетки

Вязкость, с точки зрения физики, – одно из явлений переноса, свойство текучих тел (жидкостей и газов) оказывать сопротивление перемещению одной их части относительно другой. Микровязкость - это трение, испытываемое одной частицей при её взаимодействии в процессе диффузии с окружающей средой в масштабе микрометра длины. Данная величина измеряется в Паскалях (Па) или Пуазах (1 пуаз=Па*с).

Микроскопическая вязкость является одним из ключевых биофизических параметров, контролирующих скорость диффузии молекулярных частиц и, следовательно, влияющих на скорость реакции диффузионно-контролируемых процессов на микроскопическом уровне. Таким образом микровязкость мембран играет ключевую роль в функционировании здоровой клетки, а изменения значений данного параметра с сопутствующим воздействием на активность мембранных белков и клеточную коммуникацию часто сопровождают трансформацию нормальной клетки в злокачественную.

Изменение значения микровязкости в живой клетке может существенно отразиться как на скорости чисто химических реакций, так и на ряде физических явлений, имеющих первостепенное значение для процессов, происходящих в клетке [15]. Например, изменение микровязкости влияет на диффузию химических веществ, скорость Броуновского движения, электропроводность и др. [37, 47, 62]. Вязкость вносит большой вклад в такие процессы, как внутриклеточный сигналинг и транспорт, диффузия короткоживущих интермедиатов и метаболитов (например, активных форм кислорода и азота), синтетические процессы, каталитическую активность многих ферментов и др. [75, 72].

Вязкость является одним из важнейших свойств жидкого содержимого клетки - цитоплазмы. Вязкость цитоплазмы обусловлена структурой составляющих её биополимеров и субклеточных образований и зависит от степени дисперсности и гидратации коллоидов, содержания воды в клетке, температуры и других факторов. Это свойство цитоплазмы тесно связано с обменом веществ: чем выше вязкость, тем обычно менее интенсивно идут обменные процессы [17]. Цитоплазма представляет собой сложную многокомпонентную среду, влияющую на диффузию биомолекул, и, как следствие, скорость реакций в клетке [54, 55, 76]. Существует предположение, что цитоплазматическая вязкость изменяется во время разных фаз клеточного цикла [8, 28, 45]. Однако в недавних исследованиях показана парадоксальная стабильность вязкости цитоплазмы клеток Hela-EGFR во всех фазах в отличие от мембранной вязкости [76]. Единственное значительное изменение вязкости было замечено в S-фазу, но не превышало 20% от среднего значения. Также исследователи установили отсутствие зависимости между цитоплазматической вязкостью и типом ткани, степенью злокачественности, полом и возрастом пациента [41].

Важным параметром, характеризующим состояние живой клетки, является вязкость мембраны. Вязкость мембран существенно отражается как на скорости чисто химических реакций, так и на ряде физических явлений, имеющих первостепенное значение для жизненно-важных процессов в клетке, в частности на подвижности химических веществ, интенсивности Броуновского движения, электропроводности и др. Поэтому вязкость влияет на такие процессы, как сигнализация, внутриклеточный транспорт, диффузия короткоживущих интермедиатов и метаболитов (например, активных форм кислорода и азота), синтетические процессы, взаимодействие между биомакромолекулами [75]. Вязкость мембран клеток во многом обусловлена качественным и количественным содержанием жирных кислот мембранных липидов [51, 61, 80]. Известно, что именно содержание ненасыщенных жирных кислот в мембранах придает им жидкостные свойства, вязкость при этом снижается [81]. Увеличение в мембранах содержания холестерина и насыщенных жирнокислотных радикалов в фосфолипидах, наоборот, повышает вязкость мембран [64]. Также, было показано, что чем выше подвижность хвостов фосфолипидов, тем меньше вязкость мембран, и тем лучше их проницаемость для диффундирующих веществ [1]. Кроме того, липидный бислой является матриксом для мембранно-связанных ферментов, активность этих ферментов во многом регулируется вязкостью липидной фазы мембран, составом липидов [46].

Интенсивность обновления фосфолипидов зависит от скорости синтеза ДНК в клетке. Имеется связь синтеза ДНК с составом липидов, перераспределением фракций фосфолипидов, степенью ненасыщенности жирнокислотных радикалов (насыщенные жирные кислоты тормозят синтез ДНК). Установлено, что вязкость мембран отличается в разных фазах клеточного цикла: максимальная вязкость достигается в митозе (3.5 пуаз), минимальная в S-фазе (1.9 пуаз) [14]. Все эти данные свидетельствуют о важной регуляторной роли фосфолипидов мембран.

Сложное взаимодействие между всеми этими факторами позволяет живым клеткам поддерживать вязкость мембран в узких пределах, специфичных для каждого типа клеток, что является ключевым моментом клеточного гомеостаза и выживаемости. Известно, что нарушенный липидный обмен – характерная особенность опухолевых клеток [19]. Активно пролиферирующие раковые клетки имеют повышенную потребность в липидах и холестерине, которая удовлетворяется через потребление экзогенных липидов. Накопление липидов и холестерина в мембранах раковых клеток рассматривается как признак агрессивности опухоли [44]. Кроме того, измененный липидный состав мембран опухолевых клеток сказывается не только на биохимических параметрах мембраны, но и влияет на её биофизические свойства, в частности на вязкость.

Актуальную задачу представляет собой исследование взаимосвязи между нарушением вязкостных характеристик мембран и развитием онкологических заболеваний. Однако эта проблема на сегодня мало изучена.

Микровязкость и вязко-эластические свойства мембран опухолевых клеток

Особое значение представляет исследование вязкости опухолевых клеток. Попытки измерения вязкости опухолевых клеток предпринимались ещё в прошлом столетии с использованием традиционных механических методов. Так, в работах М. Гаера использовался метод центрифугирования гомогенатов клеток опухолевых и нормальных тканей. Было установлено, что вязкость опухолевых клеток выше, чем нормальных, что предположительно связано с накоплением молочной кислоты в них [23]. В более поздних работах, например, в исследовании P. Fuchs была показана разность в вязкости мембран нормальных фибробластов мыши и фибробластов, инфицированных вирусом, вызывающим развитие полиомы, причем вязкость последних оказалась больше [21].

Вязко-упругие свойства клеток напрямую связана с физиологическими и патологическими состояниями клетки. Вязкоупругие свойства отдельных клеток влияют на то, как они взаимодействуют со своим микроокружением, их различия могут влиять на механосигнальные пути и, в свою очередь, влиять на клеточное поведение [39] и рост [4, 16].

Изменения механических свойств клеток, в частности эластичности, связаны с организацией цитоскелета, которая изменяется в различных фазах клеточного цикла. Так, известно, что во время митоза клетки становятся круглыми и сжатыми, а после возвращаются к привычной продолговатой форме, что отражается на вязко-упругих свойствах [63].

С помощью таких методов, как атомно-силовая микроскопия и аспирация микропипеткой становится возможным изучение вязко-упругих свойств, что в свою очередь приводит к пониманию механических свойств патологических состояний [40, 56, 20].

Позднее с появлением флуоресцентных молекулярных роторов и развитием метода флуоресцентного имиджинга, стало возможным измерение вязкости отдельных компартментов опухолевых клеток. Интересно, что микровязкость цитоплазмы опухолевых клеток оказалась ниже, чем у нормальных клеток [25], а микровязкость мембран варьирует в разных клеточных линиях [24]. Разница в значениях вязкости у опухолевых и нормальных клеток также подтвердилась с применением метода атомно-силовой микроскопии в культуре [59]. Кроме того, были выявлены отличия в вязкости клеток доброкачественных и злокачественных опухолей. С помощью метода электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), авторами работы было установлено, что вязкость клеток доброкачественных опухолей составляет 0.99 кПа, а клеток злокачественных опухолей 1.97 кПа [18]. С использованием атомно-силовой микроскопии в модели прогрессивного рака яичников было показано, что клетки яичников мышей более вязкие в ранней стадии развития рака [36]. В то же время мембраны злокачественных клеток обладают более высокой текучестью, чем доброкачественные [73, 74]. Эти данные подтверждены исследованиями на культурах опухолевых клеток [78, 33]. Некоторые из них, например, лимфомы и карциномы легких [67, 74, 9] отличаются более высокой текучестью в отличие от их доброкачественных аналогов. Однако некоторые раковые клетки могут иметь более низкие значения текучести мембран вследствие более низкой степени ненасыщенности жирных кислот и повышенного содержания холестерина, например, клетки гепатомы.

Вязкостные изменения в мембранах опухолевых клеток оказывают существенное влияние на антигены и рецепторы [13, 34], также на способность к метастазированию и проникновению в базальную мембрану [78, 48].

Также было установлено, что микровязкость опухолевых клеток изменяется в процессе фотодинамической терапии. В работе М. Kuimova et al. было показано резкое увеличение вязкости окружения молекулярного ротора при фотоиндуцированной гибели клеток в процессе фотодинамической терапии [38].

Более того, показаны отличия микровязкости мембран у опухолевых клеток, обладающих разной чувствительностью к химиотерапии. Например, V. Cherhun в своей работе обнаружил, что плазматическая мембрана клеток резистентной карциномы Генера отличается от мембраны чувствительной карциномы большей микровязкостью [11]. Z. Huang установил, что микровязкость плазматической мембраны резистентных А549 / DDP клеток увеличилась (1.8 - 2.2 пуаз), а у A549 уменьшилась (1.7 - 1 пуаз) [32]. Поэтому вязкость также может служить для оценки эффективности терапии.

Однако, долгое время работы по измерению микровязкости выполнялись исключительно на модельных мембранах и клетках in vitro, в то время как исследования на более сложно организованных моделях не выполнялись совсем. Впервые в работе Shirmanova et al. было показано, что микровязкость мембран клеток опухолевого сфероида HeLa Kyoto не меняется в процессе его роста и не отличается для клеток внешнего и внутреннего слоя сфероида [72]. Попытки измерения на опухолях животных были предприняты в работе Shimolina et al. Так, впервые были получены значения микровязкости клеток опухолей колоректального рака на моделях опухолей животных [72]. Отмечается, что данные, полученные в in vivo экспериментах хорошо согласуются со значениями микровязкости, полученными для in vitro работ.

Таким образом, микровязкость мембран опухолевых клеток может служить предиктором развития онкологических заболеваний, определять степень злокачественности опухолей и потенциал их метастазирования.

Микровязкость мембран опухолевых клеток при химиотерапии и химиорезистентности

Вязкость имеет фундаментальное значение для клеточных биофизических процессов, однако ее роль в патогенезе рака и ответе на химиотерапию, которая на сегодняшний день остается одним из основных методов его лечения, до конца не изучена. Также еще не полностью описаны процессы проникновения и действия лекарственного препарата в живой клетке. Множество исследований показывают, что ответ раковых клеток на химиопрепарат напрямую зависит от биофизических свойств мембраны, таких как вязкость.

На сегодняшний день известно, что вязкость мембран опухолевых клеток изменяется в процессе терапии [59], а также отличается у чувствительных клеток и у их резистентных аналогов [32, 11, 7].

Клеточная мембрана и лекарственные вещества оказывают друг на друга влияние. С одной стороны, препарат изменяет мембранную вязкость за счет прямого взаимодействия с липидным слоем или опосредованно, через перекисное окисление липидов, например. С другой-плазматическая мембрана влияет на активность и токсичность лекарственных препаратов [66]. За счет своих биофизических характеристик, в частности, вязкости, мембрана непосредственно влияет на проникновение, локализацию препарата внутри мембраны и влияние его на терапевтическую мишень [66]. В то же время мембранные липиды могут являться ключевыми мишенями в преодолении химиорезистентности [26].

Понимание роли цитоплазматической мембраны в ответе раковых клеток на химиотерапию чрезвычайно важно, так как мембрана непосредственно вовлечена во внутриклеточный транспорт лекарственных веществ и регуляцию различных биологических процессов в клетке. Множественная лекарственная устойчивость является основной причиной неэффективности химиотерапии. В особенности это связано с повышенной жесткостью клеточной мембраны, которая ослабляет проникновение лекарственных препаратов в клетку [82].

Цисплатин и другие химиопрепараты на основе платины являются наиболее часто назначаемыми в современной онкологии, их получают около 50% больных раком толстой кишки, шейки матки, молочной железы и др. Их противоопухолевая активность основывается на препятствии репликации и транскрипции ДНК, что в свою очередь приводит к подавлению клеточной пролиферации и индуцированной гибели клеток.

Недавние исследования показывают, что мембранная вязкость раковых клеток меняется под воздействием цисплатина [22, 10]. Ранее было продемонстрировано, что при лечении цисплатином достаточно быстро уменьшилась вязкость в мембранах, а также в липидных рафтах в клетках колоректального рака HT29 при инкубации с препаратом в течение 15 мин - 4 ч [42, 62, 72]. Авторы работы предполагают, что основным механизмом повышения вязкости является активация сфингомиелиназы, которая приводит к образованию церамида.

В исследованиях Lacour и др. и Rebillard и др. на клетках колоректального рака при лечении цисплатином было продемонстрировано быстрое временное увеличение текучести плазматической мембраны вследствие инициации апоптоза [69]. В исследованиях на нескольких линиях раковых клеток говорится об инициированном цисплатином апоптозе посредством транслокации и/или активации рецептора Fas в клеточных липидных рафтах [42]. То есть определенная терапевтическая концентрация цисплатина снижает вязкость мембран клеток HT29 с сохранением в течение 4 часов (измерено с помощью метода ЭПР) [42], что сопровождалось образованием крупных агрегатов CD95 и их перераспределением вместе с Fas-ассоциированными белками с доменом смерти FasL и прокаспазой-8 в липидные рафты. В исследованиях Lacour, Rebillard было показано, что опосредованное цисплатином ингибирование NHE1 вызывает каскад изменений - снижение внутриклеточного pH, в ответ на что происходит быстрая временная активация aSMase и стимуляция агрегатов CD95. С использованием метода ЭПР также было показано, что индуцированное цисплатином снижение мембранной вязкости вызывает активацию пути рецептора смерти Fas, что, в свою очередь, приводит к быстрой и временной реорганизации микрофиламентов F-actin [62].

Были показаны отличия микровязкости мембран у опухолевых клеток, обладающих разной чувствительностью к химиотерапии. Например, было обнаружено, что мембраны клеток резистентной карциномы Генера обладают большей вязкостью по сравнению с чувствительной карциномой [12].

С использованием флуоресцентного зонда TMA-DPH было установлено, что вязкость плазматической мембраны резистентных к цисплатину А549/DDP клеток увеличилась до 2.2 пуаз, а у чувствительных A549 уменьшилась до 1 пуаза при апоптозе, это показано на рис. 5 [32]. Также было обнаружено, что микровязкость плазматической мембраны клеток с множественной лекарственной устойчивостью более гетерогенна по сравнению с не резистентными опухолевыми клетками [7].

В исследованиях на клеточных линиях CT26 (колоректальный рак мыши) и Hela Kyoto (рак шейки матки) было показано изменение вязкости в процессе химиотерапии цисплатином: значительное увеличение к 24 ч инкубации с препаратом. Данные подтвердились в исследованиях на более сложных моделях - клеточных сфероидах Hela Kyoto: к 24-48 ч инкубации наблюдалось повышение вязкости до 425 сП и 325 сП, соответственно. Интересно отметить, что размеры сфероидов увеличились за счет наличия мертвых клеток и структурной дезорганизации. Исследователи сделали вывод, что это не был временный ответ на лечение, так как повышенная вязкость сохранялась в течение 48 ч после отмены препарата. Также были проанализированы вязкостные изменения при индукции химиорезистентности к цисплатину. Было показано, что при увеличении дозы препарата значения вязкости повышаются в сравнении с контрольными (407 сП и 301 сП, соответственно). Для подтверждения зависимости вязкостных изменений во время химиотерапии от липидного состава мембраны был получен липидный профиль СТ26 с использованием ToF-SIMS. После 24 ч воздействия цисплатина было зарегистрировано повышенное содержание сфингомиелина, фосфатидилхолина и холестерина [70].

Несколько исследований предполагают, что измененный липидный состав и физические свойства клеточной мембраны способствуют развитию химиорезистентности. Наиболее распространенными изменениями липидов в устойчивых к лекарствам раковых клетках являются увеличение содержания сфингомиелина и холестерина, а также более высокая степень насыщения жирными кислотами. Эти перестройки должны сделать мембрану более вязкой и, следовательно, могут уменьшить проникновение препарата в клетки путем пассивной диффузии.

В недавних исследованиях на линии HCT116 (колоректальный рак человека) проводилось сравнения влияния химиотерапии на изменения вязкости мембран чувствительных клеток и их резистентных аналогов – HCT116-OXAR. При воздействии оксалиплатина у чувствительных к химиотерапии клеток наблюдалась схожая динамика вязкостных изменений с таковой у CT26 и Hela Kyoto при действии цисплатина. В то время как у HCT116-OXAR воздействие оксалиплатина не влияло на вязкость мембраны, на всем протяжении инкубации значения вязкости составляли примерно 450 сП. Проведенный с помощью ToF-SIMS липидный анализ показал незначительное снижение фракции мононенасыщенных ЖК и повышение полиненасыщенных, а также более высокий сигнал от холестерина у клеток HCT116.

Резистентная линия HCT116-OXAR демонстрировала более низкий сигнал от мононенасыщенных жирных кислот, более низкий уровень фосфатидилхолина и более высокий уровень холестерина, что характерно для клеток, устойчивых к препаратам платины. Для дополнительного определения реакции оксалиплатин-чувствительных и резистентных клеток НСТ116 в более естественной среде были проведены эксперименты in vivo на опухолевых ксенотрансплантатах мыши, полученных из клеточных линий HCT116 и HCT116-OXAR. В отличии от клеточных культур ротор в опухолях располагался как в мембране, так и диффузно в цитоплазме. Так как внутриклеточная среда характеризуется более низкой вязкостью, значения in vivo оказались ниже чем in vitro. Вязкость в мембрана клеток HCT116 и HCT116-OXAR была сходной и составляла 268 сП и 272 сП. Было показано, что, как и в моделях in vitro, в резистентных опухолях вязкость не менялась после лечения оксалиплатином. В то время как чувствительные опухоли показали схожую динамику с клеточной культурой – увеличение вязкости до 357 сП. Таким образом, результаты, полученные in vivo, коррелируют с результатами in vitro и говорят о вовлеченности вязкости мембран в ответе на химиотерапию [70].

Взаимосвязь микровязкости мембран с липидным составом опухолевых клеток

Как правило, различные значения вязкости у опухолевых и нормальных клеток связаны с различием липидного состава мембран этих клеток. При этом, часто нарушается метаболизм холестерина, что приводит к уменьшению или увеличению его содержания в мембранах, что, в свою очередь, влияет на вязкость.

В недавних исследованиях было показано, что мембраны с преобладанием холестерина имеют более высокую вязкость, чем мембраны с низким содержанием холестерина [27, 50], а его содержание сильно зависит от происхождения клетки. Также показано, что высокое содержание холестерина напрямую связано с увеличением количества липидных рафтов [26, 12], домены которых участвуют в клеточной пролиферации, дифференцировке, апоптозе и миграции и, соответственно, вовлечены в злокачественную трансформацию, неконтролируемый рост, инвазивность и метастазирование [2]. Повышенная вязкость мембран создает обилие белков интегринов, адгезинов, рецепторов CD44 и CD24, которые участвуют в прогрессии опухоли и ее инвазии и локализуются в липидных рафтах [49], [50, 58, 53]. Таким образом, можно сказать, что повышенная вязкость мембраны способствует плохому проникновению лекарственных препаратов в клетку.

Метаболизм липидов при онкологических заболеваниях может быть настолько изменен, что повышенный уровень некоторых из них, таких как фосфатидилсерины, рассматривают как биомаркеры рака [77]. Однако точного липидного профиля, который бы отличал злокачественные клетки от доброкачественных, не существует [52]. Более того, липидный состав раковой клетки может колебаться во времени. Например, если клетка готовится к метастазированию, содержание холестерина в ее мембране снижается для повышения текучести мембран, что способствует лучшему проникновению в кровеносное русло [81].

Однако не только содержание холестерина изменяется в опухолевых клетках. Например, внеклеточные мембраны в клетках гепатоцеллюлярной карциномы содержали в четыре раза больше сфингомиелина и большее количество ненасыщенных жирных кислот, чем их нормальные аналоги [65]. В мембранах клеток колоректального рака повышены все фракции фосфолипидов [27]. Кроме того во многих опухолевых клетках наблюдается снижение сфингомиелина, и его содержание коррелирует с опухолевым генезом [5].

Некоторые липиды, например, фосфатидилсерины выполняют защитную функцию на поверхности раковых для уклонения от аутоиммунного ответа: NK-клеток и других цитотоксических иммунных клеток [6, 43].

При изучении устойчивости раковых клеток к химиотерапии было показано, что клетки с более высоким содержанием холестерина в мембране проявляют большую лекарственную устойчивость [2; 52].

Инвазивность раковых клеток также зависит от липидного состава. Повышение инвазивности в частности связывают с большим содержанием ганглиозидов [57].

Таким образом липидный профиль мембраны опухолевой клетки можно рассматривать как важнейший прогностический фактор у онкологических больных. Кроме того, значительную роль в механизмах устойчивости к химиотерапии и метастазировании играет холестерин, посредством регуляции текучести мембран. Современные представления о липидном составе мембраны позволяют модифицировать лечение онкологических заболеваний, однако в этой области еще многое подлежит изучению.

Заключение

Лечение онкологических заболеваний на сегодняшний день представляет собой актуальную задачу. Большое внимание уделяется разработке новых и усовершенствованию уже существующих методов лечения, поиску новых мишеней, например, отдельных клеточных компартментов.

Клеточная мембрана может служить таргетной мишенью для терапии, так как является первым барьером для химиопрепаратов. Следует подчеркнуть, что вязкость имеет большое значение в озлокачествлении и метастазировании клетки, а также отличается у доброкачественных клеток и их злокачественных аналогов.

Изменения в вязкости мембран обуславливают не только ответ опухолевой клетки на терапию, а также развитие химиорезистентности. Кроме того, вязкость может служить диагностическим показателем, так как вязкость опухолевых клеток отличается от нормальных.

Таким образом, данные литературы показывают, что вязкость может служить полезным инструментом для оценки функционального состояния опухолевых клеток и мониторинга проводимой терапии.

About the authors

A. E. Khlynova

Volga Region Research Medical University

Author for correspondence.
Email: sashahlynova@list.ru

студент 5 курса лечебного факультета

Russian Federation, 10/1, pl. Minin and Pozharsky, 603005, Nizhny Novgorod

M. V. Shirmanova

Volga Region Research Medical University

Email: sashahlynova@list.ru

кандидат биологических наук , зав. лаб., зам. директора по науке НИИ Экспериментальной онкологии и биомедицинских технологий

Russian Federation, 10/1, pl. Minin and Pozharsky, 603005, Nizhny Novgorod

References

Supplementary files