The role of Toll-like receptors in the pathogenesis of bronchial asthma

Texto integral

Введение

Ни значимые достижения в диагностике бронхиальной астмы (БА), ни внедрение в практику современных методов лечения и профилактики бронхиальной обструкции так и не привели к снижению заболеваемости, особенно у детей. Достижение контроля наблюдается в менее чем 30% случаев [15]. Помимо этого своевременная диагностика и лечение хронической формы патологии дыхательных путей в младшей возрастной группе – является важной проблемой. В конце ХХ – начале XXI века исследователи убедительно показали, что Т-хелперы второго типа (Th-2) играют важнейшую роль в развитии аллергической БА, и с их активацией связаны воспаление и гиперреактивность дыхательных путей [30, 41].

Сформированное представление, что БА – это аллергическое, эозинофильное, Th-2-опосредованное заболевание, обусловленное экспозицией к аллергенам, стало основой упрощенного понимания сложных патогенетических звеньев. Предполагается, что сложность в поддержании контроля над течением заболевания обусловлено эндогенными факторами, что диктует необходимость сосредоточиться на исследовании биологических причин заболевания.

Обсуждение

Чаще всего БА начинается в детстве, как правило, на фоне респираторных вирусных инфекций и проявляется эпизодами свистящего дыхания, одышки, чувства стеснения в груди, кашля [10, 29, 52, 53]. Механизмы связи вирусной инфекцией с последующим развитием аллергического воспаления в респираторном тракте изучены недостаточно. Существует большое количество разнообразных причин, которые вызывают патологические процессы, соответствующие БА [6]. Известно деление БА на атопическую – связанную с сенсибилизацией к аллергенам, и неатопическую – обусловленную вирусными инфекциями, ожирением, приемом лекарственных средств, физической нагрузкой [62]. Также выделяют два фенотипа в зависимости от участия Th-2 иммунного ответа в патогенезе астмы:

1. БА с ведущей ролью иммунных реакций 2 типа, эта группа включает в себя аллергическую, аспириновую, позднюю эозинофильную и связанную с физической нагрузкой;
2. БА с минимальным участием Th-2 ответа, а именно связанная с ожирением, нейтрофильная, малогранулоцитарная и имеющая очень поздний дебют [13].

Таким образом, БА не объединяется по принципу единого патогенеза, включая в себя различные фенотипы, гетерогенность данного заболевания подчеркивает, что в патофизиологии астмы могут участвовать разнообразные механизмы [61].

БА формируется в результате совместной работы врожденного и адаптивного Th-2 иммунных ответов [17]. Врожденный иммунный ответ – первая линия защиты организма от патогенов, он быстро реализуется за счет стереотипных структур – рецепторов распознавания паттернов или PRRs (Pattern Recognition Receptors) [42]. Данные рецепторы распознают устойчивые молекулярные паттерны патогенов (PAMPs – Pathogen Associated Molecular Patterns), например, липополисахариды, липотейхоевую кислоту, зимозан грибов, вирусную и бактериальную ДНК или РНК [2]. Сигналы, полученные за счет связывания рецептора и молекулярного паттерна, не только запускают противомикробную защиту, но и  активируют адаптивный иммунитет, предоставляя информацию об инфицирующем агенте [39]. В норме в ответ на вирусное или бактериальное инфицирование активируется Th-1 иммунный ответ [40].

Toll-подобные рецепторы (TLRs – Toll like receptor), подсемейство PRRs, являются одним из главных элементов системы распознавания, располагающиеся на клетках врожденной иммунной системы – тучных клетках, эозинофилах, нейтрофилах, базофилах, макрофагах, а также на клетках адаптивной системы иммунитета – на T-лимфоцитах и B-лимфоцитах [1, 5]. Также Toll-рецепторы участвуют в связи врожденного и адаптивного иммунных ответов, например, экспрессируясь на антигенпрезентирующих дендритных клетках [34]. Одна клетка может экспрессировать различные типы рецепторов TLRs, что позволяет ей реагировать на разные патогены [16]. Возбуждение TLRs приводит к активации группы генов, специфических факторов транскрипции или протеолитических путей [23]. Благодаря этому запускается синтез противоинфекционных пептидов, провоспалительных медиаторов (цитокинов, хемокинов, острофазовых белков и др.), антигенов HLA-системы, костимулирующих молекул,  инициирующих Тh-2 иммунный ответ [1]. Известно 13 Toll-подобных рецепторов, 10 из которых обнаружены у человека [23, 26].

Они делятся на две группы:

1. Поверхностные – располагающиеся на плазматической мембране клеток (TLR-1, -2, -4, -5, -6, -10), лиганды – компоненты мембран микроорганизмов, белки бактерий и вирусов;
2. Эндосомальные – локализованные во внутриклеточных везикулах эндоплазматического ретикулума, перед активацией переходящие в эндолизосомную часть клетки (TLR-3, -7, -8, -9), лиганды – нуклеиновые кислоты инфекционных агентов [13, 23, 42].

На современном этапе TLR-рецепторы рассматриваются не только в контексте их участия в инфекционных процессах, но и с позиции их вовлеченности в патогенез хронических воспалительных заболевания, бронхиальной астмы в частности [15, 23]. Помимо распознавания чужеродных структур, Toll-подобные рецепторы осуществляют распознавание молекул, которые высвобождаются при повреждении собственных клеток (DAMPs – Danger Associated Molecular Patterns), примерами таких молекул являются белки теплового шока, мочевая кислота, белок группы высокой мобильности, фибриноген, АТФ и прочее [29]. DAMPs – это эндогенные лиганды, результатом их взаимодействия с Toll-рецепторами является адекватная реакция иммунной системы на сигналы опасности. Так из организма своевременно выводятся модифицированные эндогенные молекулы, и поддерживается антигенный гомеостаз. При чрезмерной активации TLRs эндогенными лигандами может наблюдаться гиперактивная воспалительная реакция и как результат – повреждение клеток и тканей, а это является патогенетическим механизмом различных заболеваний, в том числе БА [16]. Так как в основе бронхиальной астмы лежит, в том числе, нарушение распознавания антигенных молекул, исследование роли Toll-рецепторов, генов, которые регулируют действие этих рецепторов, в патогенезе БА сейчас привлекает внимание исследователей [15, 29].

Бронхиальная астма – это многофакторное заболевание, возникающее как результат взаимодействия генетических и экологических факторов [12]. За последнее время произошли изменения факторов внешней среды, а именно снижение заболеваемости за счет программ вакцинации, очищение продуктов питания, широкое использование антибактериальных лекарственных средств, и поменялось питание – в рационе стали преобладать насыщенные жиры, а потребление ненасыщенных, наоборот, уменьшилось. Предполагается, что в результате произошли изменения совокупного генотипа населения, это в свою очередь проявляется недоразвитием иммунорегуляторных механизмов, нарушением работы адаптивной иммунной системы, преобладанием Th-2 иммунного ответа [15, 50]. Как следствие у генетически предрасположенных лиц развиваются атопия, аллергические заболевания, в том числе бронхиальная астма, это является одним из объяснений увеличения количества случаев БА за последние десятилетия [57].

Высказываются предположения, что повышенный Th-2 ответ связан со снижением Th-1 реакций, а это является следствием влияния окружающей среды [60]. В основе данного явления лежит специфическая активация TLRs во время инфекции, что в дальнейшем может оказывать противоаллергическое действие [63]. Это является основой для гигиенической гипотезы, согласно которой недостаточное воздействие инфекционных агентов в детском возрасте может в дальнейшем повысить вероятность развития БА и других хронических воспалительных заболеваний [35]. Подтверждение заключается в том, что у детей, выросших в сельской местности, на фермах, реже развивается астма (во взрослом возрасте, в том числе) [60]. Так как в такой местности наблюдается повышенное содержание аллергенов, эндотоксинов (например, липополисахаридов бактерий), вирусов, воздействие которых вызывают Th-1 иммунный ответ, сдвиг иммунных реакций происходит в его сторону, а Th-2 ответ подавляется [48, 55]. То же наблюдается при воздействии патогенов в пренатальном периоде, пребывание в подобной окружающей среде беременной женщины снижает вероятность развития БА у ребенка [45]. Также есть исследования, демонстрирующие, что паразитарная инвазия снижает вероятность развития аллергической бронхиальной астмы, за счет снижения уровня интерлейкина-13 при воздействии аллергена (вероятно, это не единственный механизм). Интерлейкин-13 является медиатором Th-2 ответа, но реакция организма наблюдается та же, что и при воздействии бактериальных, вирусных агентов, это можно объяснить подавлением иммунных реакций 2 типа гельминтами, их иммуномодулирующим действием [44]. Однако, респираторные вирусные инфекции и у детей, и у взрослых считаются фактором риска развития бронхиальной астмы, а при наличии БА они являются самым частым триггером обострения, несмотря на то, что в ответ на инфицирование активируется Th-1 иммунный ответ, следовательно, не каждая инфекция защищает от развития и прогрессирования БА [48, 54]. А также, появляются все больше данных, утверждающих, что неадекватная стимуляции Toll-подобных рецепторов играет определенную роль в генерации чрезмерного иммунного ответа 2 типа [50]. Аллергены также являются молекулами, стимулирующими TLRs, то есть Toll-рецепторы играют непосредственную роль в формировании и обострении БА [63].

В патогенезе бронхиальной астмы наибольшее внимание привлекают поверхностные TLR-2 и TLR-4, потому что они распознают большое количество лигандов [13, 15]. TLR-2 – основной рецептор, идентифицирующий элементы клеточной стенки грамположительных бактерий (в частности липотейхоевую кислоту и пептидогликан), компонентов микоплазм, зимозан дрожжей [15, 20]. TLR-2 выделяется своей способностью к кооперации с другими представителями Toll-подобных рецепторов, образованием гетеродимеров TLR-2/TLR-1, TLR-2/TLR-6, TLR-2/TLR-10 во время распознавания, за счет этого расширяется спектр распознаваемых лигандов [3, 38]. TLR-2 присутствуют на поверхности моноцитов, макрофагов, нейтрофилов, Т- и В- лимфоцитов, базофилов, натуральных киллеров. Результаты исследований на мышах демонстрируют, что данные рецепторы контролируют течение разнообразных инфекций, вызванных бактериями [26].

Имеются исследования, показывающие, что у новорожденных детей с дыхательными расстройствами экспрессия TLR-2 превышала экспрессию TLR-4, что можно объяснить димеризацией и большим количеством лигандов [8]. Имеются противоречивые данные о роли TLR-2 в патофизиологии бронхиальной астмы. Существуют исследования, указывающие как на повышение их экспрессии при БА  (исследование Krespo-Lesmanna и соавторов), так и снижение (работа Pace и соавторов) [9]. Если говорить о провоспалительном действии рецептора, TLR-2 участвует в поддержании хронического воспаления и обострениях астмы за счет вовлечения в инфекционные процессы, вызванные Chlamydophila pneumoniae и Mycoplasma pneumoniae [28]. Утверждается, что TLR-2, а также TLR-1 и TLR-10 играют важную роль в развитии детской БА, особенно возникающей после перенесенного бронхиолита [37].

TLR-2 участвует в воспалительных процессах, в том числе посредством рецептора NLRP-3 (nod-like receptor with pyrin domain containing-3), который запускает формирование соответствующей инфламмасомы [13, 19]. Инфламмасома NLRP-3 выполняет защитную функцию в ответе на патоген, но также она может быть вовлечена в процесс инициации и усугубления хронических воспалительных заболеваний, из-за аномалий ее активации [31]. Изменения со стороны TLR-2 или NLRP-3 может привести к гиперсекреции цитокинов, приводя к обострению БА. Другой механизм участия TLR-2 в воспалении реализуется за счет увеличения продукции стромального лимфопоэтина тимуса, что может стать причиной запуска Th-2 иммунного ответа [13]. Уровень данного рецептора влияет на хемотаксис базофилов в легкие с помощью связывания с С-С-хемокин лиганд-2 [42]. При дефиците TLR-2 или введении антагонистов этого рецептора наблюдалось снижение образования хемокинов, лимфопоэтина, что угнетало симптоматику аллергической БА [13, 42]. Но при этом через сигнальные пути TLR-2 изменяется число T-регуляторных клеток, за счет чего снижается вероятность обострения БА [17].

TLR-4 экспрессируется на плазматической мембране макрофагов, моноцитов, дендритных клеток, эозинофилах, Т- и В-лимфоцитов и т.д. [16, 26]. У данного рецептора имеется множество лигандов, в первую очередь, это липополисахариды грамотрицательных бактерий, а также пневмолизин Streptoccocus pneumoniae, шаперон 60 Chlamydia pneumoniae и другие [3, 63]. Липополисахариды повсеместно встречаются в окружающей среде, большинство аллергенов в своем составе имеют липополисахариды, а некоторые из них структурно гомологичны TLR-4, например, антигены клеща домашней пыли [13, 63]. Вдыхание липополисахаридов вызывает чрезмерный Th-2 иммунный ответ, следовательно, аллергическую астму [20, 27]. TLR-2, TLR-4 могут модулировать Th-ответ в зависимости от генетических особенностей человека и инфицирующей нагрузки, попадание в организм низких уровней липополисахаридов играет более значимую роль в развитии астмы, чем высокие, как правило, вызывая Th-2 ответ [22, 42, 45, 59]. В добавление к этому, есть исследования, утверждающие, что высокие дозы липополисахаридов при воздействии на организм не только не вызывали проявления бронхиальной астмы, но и защищали от эозинофилии, гиперпродукции цитокинов Th-2 ответа, одновременно увеличивая продукцию гамма-интерферона и реализуя Th-1 ответ [22, 27, 45]. А также есть работы, в которых повторное введение низких доз липополисахаридов, наоборот, оказывало защитное действие, снижая выработку цитокинов в дыхательных путях [45]. Формирование аллергической астмы, опосредованной клещами домашней пыли, связывают с блокированием апоптоза нейтрофилов с помощью TLR-4  [36, 51]. Наличие липополисахаридов в домашней пыли усугубляет течение астмы, вызывая ее обострение [28, 58].

Утверждается, что TLR-4 является обязательным звеном в патогенезе аллергической бронхиальной астмы [46]. Вероятно, тучные клетки влияют на течение аллергического процесса в дыхательных путях посредством TLR-4, то есть активация этих рецепторов приводит к инициации или обострению бронхиальной астмы [20]. То же касается TLR-2 и TLR-4, имеющихся на поверхности моноцитов, макрофагов [22]. Помимо вовлечения данных рецепторов в патофизиологию БА с высоким Th-2 ответом, TLR-2 и TLR-4 участвуют в патогенезе БА с низким уровнем иммунного ответа 2 типа [13]. Имеются работы, указывающие на наличие повышенной экспрессии TLR-4, а также TLR-2 TLR-3 у пациентов с тяжелой астмой [9, 28]. В то же время, у новорожденных детей с респираторной патологией, наоборот, наблюдалось снижение экспрессии TLR-2 и TLR-4 на моноцитах, что в дальнейшем может привести к хроническим заболеваниям дыхательных путей, за счет снижения иммунной реакции в ответ на патоген [7]. В подтверждение есть и другие исследования, демонстрирующие пониженную экспрессию TLR-2, TLR-4 у пациентов с БА [21, 49]. Возможно, противоречивые результаты исследований обусловлены разной выборкой пациентов с БА, отличающихся по тяжести заболевания, так как есть данные, что тяжесть заболевания влияет на уровень экспрессии Toll-подобных рецепторов [21]. Генетический полиморфизм TLRs также может обуславливать различия в экспрессии Toll-рецепторов [17]. Еще одним важным фактором разных ответов Toll-рецепторов на один и тот же причинный фактор, является возраст [4]. Обычно сигнальные пути TLR-4 приводят к активации Th-1 ответа, в раннем же возрасте наблюдается снижение экспрессии TLR-4 и смещение иммунного баланса в сторону Th-2 ответа, также иммунный ответ является недостаточно интенсивным для элиминации патогена, в результате чего ребенок становится подвержен аллергической бронхиальной астмы [4, 11, 13].

TLR-2, TLR-4 участвуют в контроле целостности внеклеточного матрикса, распознавая гиалуроновую кислоту, которая является активным модулятором воспалительного процесса. При повреждении дыхательных путей наблюдается разрушение внеклеточного матрикса и выход низкомолекулярных фрагментов гиалуроновой кислоты, эти элементы распознают TLR-2 и TLR-4, вызывая воспаление, что может усугублять течение БА. Высокомолекулярные фрагменты гиалуроновой кислоты принимают участие в защите от острого повреждения и апоптоза клеток дыхательных путей также посредством TLR [2, 25, 51]. Таким образом, через TLR-2 и TLR-4 в зависимости от первичного сигнала реализуется и провоспалительный, и противоспалительный ответ, в обоих случаях нарушения со стороны рецепторного восприятия могут привести к формированию или усугублению бронхиальной астмы за счет чрезмерного воспалительного ответа или недостаточного защитного действия.

Дефекты работе Toll-подобных рецепторов могут быть обусловлены мутациями, полиморфизмом генов, отвечающих за экспрессию рецепторов. В результате нарушается структура TLR-4, а за этим и регуляция врожденного иммунного ответа, предполагается, что это может играть важную роль в дисбалансе между иммунными ответами 1 и 2 типа. Это подтверждается исследованиями, в которых показана зависимость наличия мутации гена, кодирующего TLR-4, и количеством эпизодов бронхобструкции [11]. Полиморфизм TLR-2 также связан с аномальным иммунным ответом, приводящим к развитию БА [17]. Полиморфизм генов, отвечающих за формирование атопии, которая в большинстве случаев предшествует развитию БА у детей, также представляет интерес [15]. Сейчас больше внимания уделяется роли провоспалительного действия в патогенезе БА, реализуемого с помощью TLR-2, TLR-4, поэтому в качестве будущей терапевтической тактики рассматриваются антагонисты данных рецепторов [33, 51].

Другие поверхностные Toll-рецепторы также принимают участие в патогенезе БА. TLR-1 можно обнаружить на большом количестве клеток, в том числе дендритных и В-клетках [16]. Полиморфизм генов TLR-1 проявляется повышенной продукцией некоторых цитокинов и предрасположенностью к БА [10, 17]. Утверждается, что при БА наблюдается высокий уровень продукции TLR-1 [21]. Но и в данном случае есть информация, что при введении агонистов рецептора наблюдалось снижение симптоматики БА, что говорит и о защитной функции TLR-1 [13].

Одним из важных лигандов TLR-5 является флагеллин – компонент жгутикового аппарата бактерий, который присутствует, в том числе, в домашней пыли [3, 40]. Флагеллин присутствует в составе структур Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila, Bordetella bronchiseptica, которые вызывают воспаление дыхательных путей. В ответ на инфицирование перечисленными бактериями в респираторной системе индуцируется Th-2 ответ [3, 17]. С другой стороны, у пациентов с тяжелой астмой наблюдается уменьшение экспрессии TLR-5, что может приводить к большей уязвимости в отношении инфекционных заболеваний, а это в свою очередь повышает вероятность обострения БА [17, 56].

TLR-6 активируются при аллергической астме, при которой аллергеном выступают элементы грибов, так как рецептор участвует в распознавании зимозана. Причем эти рецепторы играют защитную функцию, инициируя Th-1 и Th-17 иммунные ответы. При нарушении функции, дефиците TLR-6 значительно повышается вероятность развития аллергической БА Таким образом, агонисты данных рецепторов могут рассматриваться в качестве лекарственных средств при БА[17].

Про TLR-10 известно не много, они экспрессируется в основном на В-клетках, но какие лиганды распознает рецептор пока не открыто. Предполагается, что генетический полиморфизм данного рецептора также играет роль в формировании БА [2, 16, 17].

Эндосомальные Toll-рецепторы также активно исследуются в контексте патогенеза бронхиальной астмы. TLR-3 пока единственный из известных Toll-подобных рецепторов, обеспечивающий распознавание двухцепочечной РНК. Во время инфекции, вызванной вирусом гриппа, респираторно-синцитиальным вирусом, увеличивается экспрессия TLR-3 для противовирусного ответа [3]. Несмотря на то, что в данном случае запускается Th-1 ответ, обострения БА часто связаны с острыми респираторными вирусными инфекциями, следовательно, TLR-3 играет роль в патогенезе заболевания [26, 28]. У мышей активация TLR-3 вызывала воспаление и нарушение дыхательной функции [50]. В другой работе показывается, что цитокины, вырабатывающиеся при активации TLR-3, вызывают эозинофильное воспаление [17]. Также есть исследования, указывающие, что при БА легкой степени тяжести наблюдается повышенное количество TLR-3 [28].

TLR-7 на 43% гомологичен TLR-8, поэтому данные рецепторы часто исследуются вместе [2]. Рецепторы локализуются в эндосомах, находящихся в нейтрофилах, моноцитах, TLR-7 присутствует в эозинофилах и В-клетках, а TLR-8 – в Т-клетках [26], они участвуют в распознавании одноцепочечной РНК [3]. Было предложено, что данные рецепторы также вызывают обострения БА, за счет своего участия в противовирусном ответе и установлено, что, как минимум, полиморфизм TLR-7 связан с развитием БА [24, 50]. У подростков и взрослых с БА TLR-7 снижены, что может способствовать частым вирусным инфекциям и обострениям астмы [43, 56]. Но при исследовании установили, что у пациентов с астмой наблюдалась сниженная экспрессия TLR-7 [32], на животных моделях агонисты TLR-7 уменьшали гиперреактивность дыхательных путей, эозинофилию, ремоделирование, а у нокаутных по данному рецептору мышей после респираторной вирусной инфекции наблюдались симптомы БА. Помимо этого есть исследование, которое показывает вовлечение TLR-7 в процесс расслабления дыхательных путей, что в дальнейшем может быть использовано в качестве терапевтической стратегии [24]. Вместе с тем агонисты TLR-7 предлагают использовать, основываясь на его способности снижать воспаление при БА [17]. TLR-8 исследуется в меньшей степени, чем TLR-7, из-за общности функции [13].

TLR-9 распознает фрагменты ДНК вирусов, бактерий и грибов [3]. Исследования показали, что активация TLR-9 приводит к снижению аллергического воспаления у пациентов с БА. Также происходит стимулирование действия Т-регуляторных клеток, в результате чего подавляется чрезмерный иммунный ответ 2 типа. Противоаллергическое действие TLR-9 связывают с его способностью восстанавливать иммунный баланс между Th-2 и Th-1 ответами. Это реализуется посредством продукции моноклональный антител, которые нейтрализуют противовоспалительные медиаторы. При взаимодействии с лигандом TLR-9 может напрямую снижать синтез IgE и интерлейкина-4 [17]. Мутации в генах TLR-9 повышают риск развития БА во взрослом возрасте [14], но есть исследование, показывающее, что однонуклеотидная замена в одном из генов, ответственных за экспрессию TLR-9, наоборот, приводит к формированию БА, легче поддающейся контролю [15]. Синтетические лиганды – агонисты TLR-9 являются перспективным лекарственным средством в борьбе с БА [18, 47].

Заключение

Toll-рецепторы играют в патогенезе БА двоякую роль. С одной стороны, являясь одними из главных звеньев системы распознавания патогенов, они запускают иммунный ответ на инфекционные агенты. Полиморфизм генов, кодирующих TLRs, приводит к развитию чрезмерного иммунного ответа, что в свою очередь часто становится причиной развития или обострения БА. С другой стороны, Toll-рецепторы выполняют и защитную функцию, регулируя активность ответа иммунной системы, снижая воспаление, поддерживая баланс между Th-1 и Th-2 ответами. Имеются противоречивые данные о роли отдельных TLRs в патофизиологии БА, но их участие в патогенезе заболевания является установленным по данным многих исследований. Так как бронхиальная астма и сейчас представляет собой актуальную проблему, более детальное изучение патогенетических механизмов может привести к усовершенствованию диагностики, лечения и профилактики. Ведется поиск лекарственных средств для поддержания контроля над БА, основываясь на эффектах, развивающихся при стимуляции рецептора, Так, исследуется применение антагонистов TLR-2 и TLR-4 и агонистов TLR-9. Воздействие на более глубокие патогенетические звенья, рецепторы, вероятно, должно привести к разработке новых эффективных стратегий лечения и поддержанию качества жизни пациентов с БА на высоком уровне. Поэтому дальнейшее изучение Toll-подобных рецепторов может привести к большему пониманию механизмов развития заболевания и появлению новых методов борьбы с ним.

Sobre autores

A. Mineeva

Omsk State Medical University

Autor responsável pela correspondência
Email: alminal4466@gmail.com

студентка 5-го курса лечебного факультета

Rússia, Omsk

L. Makarova

Omsk State Medical University

Email: alminal4466@gmail.com
ORCID ID: 0000-0002-5508-6679
Código SPIN: 6932-9968

кандидат медицинских наук , ассистент кафедры педиатрии

Rússia, Omsk

Bibliografia

Arquivos suplementares