M proteins are the major pathogenicity factors of Streptococcus pyogenes

Full Text

Список сокращений

СГА — стрептококки группы А; СГА-инфекция — инфекционное заболевание, вызываемое стрептококками группы А; IgG и IgA — иммуноглобулины G и А; Mga-регулон — Multiple gene regulator of streptococcus group A (множественный регулятор гена стрептококка группы А); OF — фактор опалесценции — энзим, расщепляющий α-липопротеиды, вызывая опалесценцию сыворотки; MLST — мультилокусное секвенирования генов.

Введение

Streptococcus pyogenes (стрептококки серологической группы А — СГА) вызывают ряд гнойных инфекций у человека. В результате неэффективной антибактериальной терапии или ее отсутствия у 3–5 % людей, перенесших СГА-инфекцию, могут развиться такие осложнения, как острая ревматическая лихорадка, ревматическое поражение сердца, острый постстрептококковый гломерулонефрит, и инвазивные осложнения: некротизирующий фасцит и миозит, септицемии и синдром токсического шока, высоко летальные из-за быстрого развития процесса и системного поражения органов (рис. 1). По последним оценкам, ежегодно в мире происходит по меньшей мере 517 000 смертей из-за заболеваний, вызываемых S. pyogenes [1, 2].

 

Рис. 1. Типичный внешний вид Streptococcus pyogenes на поверхности 5 % кровяного агара после 18-часовой инкубации в аэробных условиях

Fig. 1. Typical appearance of Streptococcus pyogenes on the surface of 5% blood agar 18-hours incubation under aerobic conditions

 

Способность S. pyogenes выживать в инфицированном организме связана с М-белками, которые обеспечивают микробу устойчивость к фагоцитозу полиморфноядерными лейкоцитами в отсутствие типоспецифических антител. М-негативные мутанты не способны выживать в крови [3]. Устойчивость макроорганизма к стрептококковой инфекции напрямую связана с наличием типоспецифичных антител к М-белку [4, 5]. Поскольку существует >200 различных М-серотипов, человек может заразиться более чем одним типом стрептококка группы А в течение жизни [5]. Таким образом, М-белок — основной фактор, определяющий патогенность S. pyogenes. Впоследствии было обнаружено, что защита от заражения этими микроорганизмами зависела от присутствия антител, направленных на N-концевую область M-белка [6, 7], специфичный для М-типа сегмент молекулы [8, 9]. Известно, что область молекулы, ответственная за типовую специфичность СГА, ограничена примерно 50 аминокислотами на N-конце. Однако механизм, с помощью которого последовательность в этой области изменяется для получения нового серотипа, неизвестен [1].

Роль М-белка в патогенности S. pyogenes подробно рассмотрена в ряде обзоров [10–13].

М-белок впервые был идентифицирован R.C. Lancefield почти 90 лет назад [14]. В обзоре 1962 г. R.C. Lancefield [5] четко описала исследования, проведенные в течение 35-летнего периода, в которых этот белок определен как основной фактор вирулентности S. pyogenes.

Структура, функция, иммунохимия и особенности антигенной изменчивости М-белка СГА уникальны среди известных факторов патогенности белковой природы [15]. Все человеческие изоляты S. pyogenes экспрессируют поверхностный М-белок, который при просмотре с помощью электронной микроскопии выглядит как пушок на теннисном мяче [1].

Цель обзора — рассмотреть современные данные о структуре М-белков СГА, строении белковой молекулы, методах их типирования, проявлениях патогенности, механизмах защиты и генетической регуляции.

Структура M-белка

М-белок локализуется на поверхности бактериальной клетки, закрепляясь через свою С-концевую область на клеточной стенке бактерии, придавая ей волокнистый вид. Фибриллы М-белка на всем протяжении скручены попарно в плотные α-спиральные структуры, выступающие на 500 ангстрем над клеточной стенкой и состоящие из 330–440 аминокислотных остатков [16, 17].

В экспериментах по исследованию синтеза и локализации М-белка на клеточной стенке микроба J. Swanson и соавт. [18] обнаружили, что после трипсинизации (для удаления существующего М-белка на живых стрептококках) вновь синтезированный М-белок при электронной микроскопии был впервые замечен на микробной клетке в месте вновь формирующейся перегородки. В экспериментах A. Raz и соавт. [20], осуществленных после классических экспериментов R.M. Cole и J.J. Hahn (1962 г. [19]), у трипсинизированных стрептококков, помещенных в свежую питательную среду на 10 мин, также выявили M-белок во вновь формирующейся перегородке. У стрептококков, исследованных после 40 мин или более инкубации, M-белок не наблюдался в положении «старой стенки», а это позволяет предположить: молекула M-белка образуется только там, где синтезируется новая клеточная стенка, что и подтверждают наблюдения J. Swanson и соавт. [18]. Эти результаты демонстрируют тесную взаимосвязь между регуляцией клеточного деления и закреплением М-белка на клеточной стенке микроба.

Особенность молекулы М-белка, как и многих поверхностных белков бактерий, — ее многодоменная структура. Так, было показано, что стрептококковый белок M6 состоит из четырех доменов: A, B, C и D (рис. 2) [1, 21]. Каждый домен А состоит из 14 аминокислот, где центральные блоки идентичны, а концевые блоки немного отличаются от центральных. Состоящие из 25 аминокислот каждый домен B расположен аналогично доменам А. Домены C, состоящие из 2,5 блоков по 42 аминокислоты в каждом, не так идентичны, как домены A и B. Есть также 4 коротких домена D, демонстрирующих некоторую гомологию. Эти повторяющиеся сегменты составляют центральную область спирального стержня молекулы M-белка [16, 22]. Было показано, что рекомбинация внутри доменов вызывает изменение размера среди и внутри М-белков одного и того же и разных серотипов, даже у штаммов, выделенных из одной и той же вспышки [23–25]. Было высказано предположение, что это стратегия, с помощью которой микроорганизм может избежать иммунного распознавания макроорганизмом.

 

Рис. 2. Характеристика полной последовательности белка М6 Streptococcus pyogenes [1]. A, B, C и D — домены из которых состоит белок M6 S. pyogenes; N — концевой фрагмент M-белка; C — конец, область прикрепления М-белка к клеточной стенке микроба; LPXTG — якорная последовательность прикрепления М-белка

Fig. 2. Characterization of the complete sequence of Streptococcus pyogenes M6 protein [1]. The M6 protein of S. pyogenes consists of four domains: A, B, C and D; N — terminal fragment of the M protein; C is the region of attachment of the M protein to the cell wall of the microbe; LPXTG — anchor sequence pattern

 

Изучение последовательности в области спирального стержня молекулы M-белка СГА серотипа М6 выявило повторяющуюся периодичность из 7 остатков неполярных аминокислот, характерную для α-спиральных белков, таких как тропомиозин и миозин млекопитающих. Как правило, молекулы α-спиральной белковой структуры построены из повторяющихся аминокислотных остатков (a–b–c–d–e–f–g), которые в положениях a и d становятся гидрофобными и образуют «ядра» в спиральной молекуле, а промежуточные аминокислоты в основном образуют саму структуру спирали [1]. В то время как M6 и молекулы ряда M-белков СГА соответствуют этому общему расположению аминокислот, другие М-белки несколько отличаются от этой конфигурации. Недавний анализ 1086 изолятов стрептококков из 31 страны, представляющих 175 типов M-белка, выявил различия в области центрального стержня молекулы, в некоторых случаях демонстрирующие меньшее количество повторов и, как следствие, более короткий стержень [26]. Было обнаружено, что домены A отсутствовали в большинстве М-белков, которые принадлежали к стрептококковым паттернам типа D и E. Штаммы паттернов A–C считаются «глоточными», в то время как штаммы паттерна D относятся к «кожным». На изоляты паттерна E приходится почти равная доля вызываемых ими инфекций — верхних дыхательных путей и кожи (52 и 42 % соответственно) [27].

J. Swanson и соавт. в 1969 г. впервые опубликовали электронные микрофотографии белка M на поверхности S. pyogenes [18]. Это было первое доказательством того, что молекула М-белка представляет собой удлиненную структуру. В случае М-белка именно его α-спиральная структура позволила провести такую визуализацию, хотя известно, что и другие белки находятся на поверхности стрептококковой клетки, однако они не были обнаружены в электронно-микроскопических препаратах. Таким образом, прямая визуализация поверхностных белковых молекул ограничена молекулами с определенными физико-химическими характеристиками.

Несмотря на несколько попыток кристаллизовать всю молекулу M-белка, был успешно кристаллизован только N-концевой фрагмент белка СГА типа М1, содержащий как A, так и B-повторы [28]. Анализ подтвердил наличие значительных отклонений в структуре α-спирали. Высокое структурное сходство α-спирали у М-белков СГА с тканевыми белками, такими как миозин и тропомиозин миокарда, а также с компонентами базальной мембраны капилляров почечных клубочков позволило ряду исследователей выдвинуть гипотезу о патогенетической роли перекрестно реагирующих антигенов СГА, в механизме развития аутоиммунных осложнений, обусловленных СГА-инфекцией [10, 29].

В настоящее время существуют убедительные данные о многих белках грамположительных бактерий, которые прикрепляются к клеточной стенке через их С-концевую область [1]. В С-концевой области все они имеют сходное расположение аминокислот. На С-конце находятся до семи заряженных аминокислот, которые состоят из смеси как отрицательно, так и положительно заряженных остатков. Непосредственно на конце этой коротко заряженной области находится сегмент из 15–22 преимущественно гидрофобных аминокислот, которых достаточно, чтобы охватить цитоплазматическую мембрану бактерии. Во всех исследованных М-белках последовательности, обнаруженные в гидрофобной и заряженной областях, необязательно идентичны, но химические характеристики аминокислот одинаковы.

Около восьми N-концевых аминокислот из гидрофобного домена представляют собой гептапептид, который посредством LPXTG якорной последовательности ковалентно «встроен» в клеточную стенку бактерий. Эта последовательность чрезвычайно консервативна среди всех исследованных белков с С-концевым прикреплением [30]. В то время как в положении 3 гептапептида происходит несколько аминокислотных замен (преимущественно A, Q, E, T, N, D, K и L), положения 1, 2, 4 и 5 сохраняются почти на 100 %. Сохранение этого гептапептида и высокая гомология в гидрофобных и заряженных областях предполагают, что механизм закрепления этих молекул на клеточной стенке бактериальной клетки также высоко консервативен. Экспрессия и закрепление поверхностных белков строго регулируются у S. pyogenes. Например, как упоминалось ранее, синтез М-белка происходит исключительно в перегородке [18–20] наряду с биосинтезом клеточной стенки [31]. Возникающее соединение синтеза М-белка и синтеза клеточной стенки приводит к тому, что вся поверхность клетки покрывается М-белком.

Прежние представления о СГА как носителях только одного М-белка со специфической функцией типового антигена сегодня сменились пониманием определяющей роли семейства М-белков и многообразия их функций в развитии стрептококковой патологии. Речь идет, как минимум, о трех белках M-семейства: Emm, Mrp и Enn — ведущих факторах патогенности S. pyogenes. Белок Emm встречается во всех штаммах СГА, между тем как два других белка, отнесенных к М-подобным белкам, присутствуют у 85 % всех изолятов СГА [32]. Все белки, относящиеся к семейству М-белков, кодируются генами Mga-регулона (Multiple gene regulator of group A streptococci) [33–36]. Пример генетической организации Mga-регулона S. pyogenes представлен на рис. 3 [35].

 

Рис. 3. Генетическая организация Mga-регулона Streptococcus pyogenes [35]: Mga — регулятор ряда генов СГА, наиболее заметные из них семейство М-белков, гены которых тандемно связаны: emm кодирует типоспецифический белок Eмм, mrp и enn — М-подобные белки, scpa кодирует пептидазу C5a. Некоторые серотипы содержат только mga, emm и scpa (паттерн A). Другие серотипы содержат один или несколько оставшихся генов (паттерны B–E)

Fig. 3. Genetic organization of the Mga-regulon of Streptococcus pyogenes [35]: Mga is a regulator of a number of GAS genes, the most notable of which are the family of M proteins whose genes are tandem linked: emm encodes a type-specific Eмм protein, mrp and enn encode M-like proteins, scpa encodes peptidase C5a. Some serotypes contain only mga, emm and scpa (pattern A). Other serotypes contain one or more remaining genes (patterns B–E)

 

M-белок состоит из трех областей: гипервариабельной, вариабельной и консервативной (рис. 4, левая часть) [10, 32]. При этом белок Enn оказался менее вариабельным, чем Emm. Еще менее вариабелен по аминокислотной последовательности белок Mrp. Из всех этих белков в штаммах СГА разных М-типов постоянно присутствует белок Emm, кодируемый геном emm, принятый стандартом emm-генотипирования СГА [37]. Последовательности аминокислот в гипервариабельной части белка Emm кодируют первые 90 пар нуклеотидов с 5ʹ-конца гена emm; в вариабельной части — следующие 60 пар нуклеотидов.

 

Рис. 4. Способность М и М-подобных белков Streptococcus pyogenes связывать белки плазмы человека [32]. Слева — схема молекулы М-белка, ковалентно прикрепленной к клеточной стенке микроба; справа — М и М-подобные белки на поверхности клеточной стенки стрептококка. М и М-подобные белки связывают неиммунным путем IgG и IgA человека, С4b-связывающий белок (C4BP), фактор H (FH), фибриноген (Fg), плазминоген (Pla); они способны блокировать отложение опсонинов, таких как C3b и типоспецифические антитела

Fig. 4. The ability of M and M-like proteins Streptococcus pyogenes to bind human plasma proteins [32]. On the left is a diagram of the M protein molecule covalently attached to the streptococcal cell wall; on the right — M and M-like proteins on the surface of the streptococcal cell wall. M and M-like proteins bind non-immune human IgG and IgA, C4BP, factor H (FH), fibrinogen (Fg), plasminogen (Pla); they are also able to block the deposition of opsonins such as C3b and type-specific antibodies

 

Изменение молекулярного веса — уникальное свойство молекулы стрептококкового М-белка. Используя перекрестно-реагирующие моноклональные антитела как зонд, определили молекулярный вес М-белка, выделенного путем солюбилизации клеточной стенки стрептококков фаголизином, с последующим исследованием методом вестерн-блоттинга. Белок M, полученный из 20 различных серотипов, демонстрировал различия от 41 до 80 кДа по молекулярной массе, в зависимости от штамма стрептококка [23].

Такое же изменение молекулярного веса наблюдалось, когда аналогичным образом исследовали штаммы стрептококков одного и того же серотипа (M6), выделенные в течение 40 лет. Это различие в размере может быть объяснено тем, что последовательность M-белка содержит обширные повторы как на уровне белка, так и на уровне ДНК. Длинные повторяющиеся последовательности ДНК, вероятно, служат субстратами для рекомбинационных изменений, вызывая делеции и дупликации в гене М-белка и приводя к образованию М-белков разного размера [1].

Функциональная активность М-белков

Одна из основных функций М-белка — обеспечение устойчивости микроба к элиминации средствами врожденного и адаптивного иммунитета. Формирование устойчивости определяется взаимодействием ряда белков плазмы человека с поверхностью клеток S. pyogenes, что препятствует опсонизации бактерий белком комплемента С3b и специфическими антителами. Это позволяет СГА избежать поглощения и последующего переваривания фагоцитами.

Таким образом, сегодня следует говорить об М и М-подобных белках, ответственных за выработку протективных антител, типовую специфичность иммунитета, защиту от фагоцитоза полиморфноядерными нейтрофилами, взаимодействие со многими белками плазмы человека. Устойчивость бактерий к фагоцитозу происходит при экранировании М-белков от связывания с Fab-фрагментами специфических антител и при блокаде активации комплемента.

М-белки могут связываться со многими белками плазмы «хозяина», механизм действия и структурное их взаимодействие с М-белками либо хорошо изучены, либо исследуются и в настоящее время. К числу плазменных белков, взаимодействующих со стрептококковыми М-белками, относятся иммуноглобулины G и А (IgG Fc- и IgA Fc-связывание), кининоген, фибронектин, фибриноген, плазминоген, альбумин, белки системы комплемента, в том числе белок, связывающий C4b, фактор Н, и др. [38]. Наиболее важно в биологии М и М-подобных белков — их взаимодействие с пятью основными плазменными белками (рис. 4, правая часть), это фибриноген (Fg, молекулярный вес 340 кДа) [39, 40] и C4b-связывающий белок (C4BP, 570 кДа) [41, 42]. Третий белок менее изучен, но его роль в патогенности СГА была показана на трансгенных мышах — это фактор Н (FH, 150 кДа) [43, 44]. C4BP и FH, регуляторы активации комплемента, взаимодействуют с другими его белками для снижения уровня C3b с целью защиты собственных тканей хозяина от повреждения. C4BP и FH также конкурируют с опсонизирующими антителам, которые нацелены на их связывающие эпитопы на стрептококковом М-белке [45].

Следует отметить и фибриноген (Fg), белок свертывания крови длиной около 450 Ǻ, который используется СГА как щит для блокировки депозиции компонентов комплемента [45–47]. Четвертый белок, рекрутируемый М-протеином в очаг инфекции, — компонент системы свертывания крови, плазминоген (Pla), который связывается непосредственно с М-белком бактерий [48, 49] или опосредованно через фибриноген. Плазминоген трансформируется в ферментативно активный плазмин под действием стрептокиназы А. Было показано, что плазмин способен вызывать протеолиз С3b-компонента комплемента, приводя к снижению уровня опсонизации бактерий и их фагоцитарного поглощения нейтрофилами [50]. Локализованный на бактериях плазмин способствует переходу локальной стрептококковой инфекции в инвазивную [49, 51]. Наконец, пятая форма взаимодействия белков семейства М-протеинов с белками плазмы — их взаимодействие с Fc-фрагментом IgG и IgA [52–55]. Показано, что ряд типов стрептококковых М-белков связывают человеческие IgG, IgA или оба класса иммуноглобулинов. IgG в основном содержится в плазме, но может быть обнаружен и в лимфе, и (в незначительном количестве) на слизистых поверхностях, в то время как IgA — основной класс антител на слизистых оболочках [56].

Благодаря возможностям своей структуры М и М-подобные белки блокируют классический путь активации комплемента и одновременно подавляют уровень его С3b-белка в крови. Эти формы взаимодействия с белками плазмы не проходят бесследно как для бактерий, так и для организма «хозяина». В частности, связанные с микробной клеткой белки экранируют бактерии от опсонинов (антитела и С3b-белок); препятствуют фагоцитозу; способствуют формированию в организме очага инфекции; повышают адгезию бактерий на ткани; могут приводить к синтезу антител к указанным белкам, тем самым формировать сдвиги в белковых системах организма и повышать риск развития органной патологии.

Способность М-белков неиммунно связывать IgG [32, 54, 55], иммунные комплексы [57] и IgA [32, 52, 58, 59] определяется наличием у них рецепторов Fcγ и Fcα, различающихся по аминокислотной последовательности. Описаны три IgG- и один IgА-рецептор [32]. Стрептококковые белки семейства М-протеинов Emm, Mrp и Enn связывают как IgG, так и IgA, в то время как М-подобный белок (Arp) активен только в отношении IgA человека [32, 59].

Биологическое значение взаимодействия М и М-подобных белков СГА с иммуноглобулинами в инфицированном организме многопланово. Молекулы Fc-связанного иммуноглобулина блокируют опсонизацию бактерий. Помимо этого, «частокол» из Fc-связанного иммуноглобулина на поверхности бактерий участвует в их защите от фагоцитарного поглощения. Связывание микробными клетками плазменных белков может быть чревато их дисбалансом в макроорганизме. Показано также, что стрептококковые IgG Fc-связывающие штаммы способны при введении кроликам индуцировать синтез анти-IgG класса G [60–64], в итоге приводящий к высокой концентрации в крови циркулирующих IgG-содержащих иммунных комплексов. Все последствия этих событий и их роль в стрептококковой патологии еще далеки от полного изучения.

Штаммы S. pyogenes, не обладающие Fc-рецепцией, либо мутанты по данному признаку не вызывают указанных изменений. Повышение в крови концентрации иммунных комплексов типа IgG–анти-IgG и снижение темпа их утилизации может сопровождаться их тканевой депозицией и активацией комплемента, вызывающих локальное воспаление и последующее первичное повреждение в органах (сердце, почки). В надлежащих условиях первичное поражение способно перерасти в аутоиммунный процесс. Эта картина воспроизводится при моделировании в экспериментах на кроликах постстрептококкового гломерулонефрита [65–67], одного из наиболее распространенных аутоиммунных осложнений СГА-инфекций.

Перечисленные выше свойства стрептококковых М-белков варьируют в зависимости от принадлежности стрептококковых штаммов к различным М-белковым паттернам (A, B, C, D и E). К примеру, штаммы паттернов А, B и С связывают почти все перечисленные белки плазмы, между тем как штаммы паттерна Е (М-типы 4, 60, 63) — лишь альбумин, IgA и IgG, и вызываемые ими процессы могут осложниться IgA-нефропатией [68, 69]. Можно допустить, что связывание различных сочетаний белков плазмы — одно из проявлений способности СГА вызывать патологические процессы в разных органах и тканях. Понятно, что штаммы от асимптомных носителей СГА, имеющие делецию в промоторной области Mga-регулона [36], должны быть лишены способности синтезировать М-белки.

М-типы СГА условно подразделяют на «глоточные» и «кожные»; первые чаще вызывают скарлатину, ангину, тонзиллиты, фарингиты, вторые — пиодермии. Среди «кожных» возбудителей часто встречаются М-типы: 2, 4, 9, 11, 13, 22, 25, 28, 48, 49, 58–63, 66, 68. Они отличаются тем, что продуцируют липопротеиназу или фактор опалесценции (OF-фактор) — энзим, расщепляющий α-липопротеиды плазмы крови человека и ряда млекопитающих, вызывая опалесценцию сыворотки [70, 71]. OF-фактор служит вторым типовым антигеном СГА, и распределение штаммов по OF-специфичности коррелирует с таковой по М-типам [72, 73]. Инфекция, вызываемая этими штаммами, чаще осложняется постстрептококковым гломерулонефритом (PSGN) либо IgA-нефропатией. Многие из них условно называют «нефритогенными» в отличие от «ревматогенных», относящихся к «глоточным» М-типам (M1, M3, M5, M6, M18, M19, М24), являющимися OF-негативными М-типами, вызывающими заболевания верхних дыхательных путей и приводящими к ревматической лихорадке или ревмокардиту при несвоевременной либо неадекватной антибиотикотерапии. Большинство исследователей, однако, считает такое разделение условным [74], поскольку один и тот же М-тип (например, М1) может приводить как к острому постстрептококковому гломерулонефриту, так и к ревматическому поражению сердца.

По патогенезу постстрептококковых поражений сердца и почек в научной литературе накоплен значительный материал. Это процессы, при которых происходит переход инфекционного заболевания в иммунопатологическое состояние. Механизм аутоиммунных осложнений как следствия перенесенной СГА-инфекции и сегодня остается предметом научных дискуссий. Примером служат постстрептококковый гломерулонефрит (PSGN) и ревмокардит (RHD). Стрептококковые М-белки, ответственные за неиммунное связывание IgG, по-видимому, способны участвовать в патогенезе этих заболеваний [67]. Имеются достаточно убедительные экспериментальные доказательства такого предположения, особенно в отношении патогенеза постстрептококкового гломерулонефрита [75, 76], IgA-нефропатии [68, 69] и инфекционного миокардита [77, 78]. Вместе с этим высокое структурное сходство М-белков СГА и тканевых белков хозяина, таких как миозин и тропомиозин, позволило выдвинуть гипотезу существования перекрестно-реагирующих антител, направленных против перечисленных выше белков человека, как возможную причину развития ревматической лихорадки и ревмокардита, связанных с инфекцией, вызываемой S. pyogenes [10, 29, 67].

Закономерен вопрос: может ли подобная «мимикрия» стать исходной причиной поражения конкретного органа? Если бы перекрестно-реагирующие антигены могли бы самостоятельно, без внешнего участия, инициировать повреждение ткани, то антимикробными иммунными сыворотками и иммунными сыворотками к соответствующим антигенам микроба можно было бы моделировать патологию в органах экспериментального животного. Однако такая возможность на сегодня вряд ли может считаться доказанной [76].

М-типирование

Распределение М-типов СГА по миру определяется климатическими и эпидемиологическими условиями регионов, плотностью населения в них и показателями коллективного иммунитета. Состав М-типов, циркулирующих в регионе, важно учитывать при конструировании профилактических вакцин на основе М-белков: он должен обновляться при смене М-типов [79].

Существующие лабораторные серологические тесты по М-типированию СГА (реакция преципитации в геле, бактерицидный, опсонофагоцитарный) обычно не используют для оценки напряженности иммунитета, но применяют для определения типовой специфичности анти-М-антител либо для получения штамма, обогащенного М-белком [80]. Наличие в образцах крови анти-М-антител разной типовой специфичности с высокой вероятностью указывают на невосприимчивость индивида к данному кругу М-типов СГА. Перечисленные выше тесты по М-типированию СГА относились к числу тестов, рекомендованных Всемирной организацией здравоохранения [81], и использовались в ее референс-лабораториях практически до 2000 г. Существенный недостаток этих тестов — получение путем иммунизации животных широкого набора анти-М-сывороток к существовавшим на то время М-типам стрептококков группы А, что было под силу только крупным стрептококковым центрам, так как типоспецифические белки Emm обладают слабой иммуногенностью [80]. Тип OF-позитивных штаммов СГА можно установить по способности анти-OF-сывороток к известным OF-типам подавлять активность фермента липопротеиназы в реакции нейтрализации. Анти-OF-тест прост в постановке и может быть использован для выявления М-типа «кожных» штаммов в странах с жарким климатом, где OF-позитивные штаммы СГА наиболее распространены. В крови людей, потенциальных доноров типовых анти-OF-сывороток, долго сохраняется тот или иной «набор» антител. В связи с этим к интерпретации реакции нейтрализации следует подходить с осторожностью [70], используя лишь оттитрованные сыворотки. В идеале внедрение в практику OF- и анти-OF-тестов требует создания коммерческих тест-систем. В 80–90-х годах прошлого века это делали главным образом с исследовательской целью.

Ранее, до эры М- и OF-типирования, для определения принадлежности штаммов к СГА применяли Т-агглютинацию микробных клеток коммерческими наборами антисывороток к Т-белкам S. pyogenes. Сегодня этот тест практически не используется. Интерпретация его результатов нередко бывает сложна по той причине, что один и тот же Т-антиген мог присутствовать в разных М-типах, а конкретный М-тип мог содержать несколько Т-белков. Эту сложность удалось преодолеть путем составления кластеров М-типов, в которых встречалcя один и тот же либо комплекс тесно связанных Т-белков [81]. В настоящее время к Т-типированию прибегают редко, главным образом при трудностях определения М-типа, и его ожидает судьба многих методов диагностики прошлого. Определяющие для своего времени, они, сослужив немалую пользу, сменяются новыми, более точными и порой экспрессными технологиями.

Если сегодня известно около 200 генотипов emm СГА, то еще к 2000 г. было описано не более 100 М-серотипов. «Поправку» в генетическое разнообразие, необходимую с позиций эпидемиологии, внесли новые технологии. Типовый иммунитет к СГА должен определяться антителами к вариабельным участкам белков Emm [80]. Именно в этих областях М-белка происходит изменение антигенной специфичности, приводящей к формированию нового типа emm. В случаях если гипервариабельная нуклеотидная последовательность нового варианта оказывается гомологичной секвенсам известных типов emm меньше чем на 92 %, это становится основанием для регистрации нового типа emm. Новый подтип регистрируют при любых нуклеотидных заменах в области 60 пар нуклеотидов. Природа данного феномена интересна тем, что указывает на реальную возможность возникновения новых типов. Типирование по гену emm отличается высочайшей точностью. Оно позволяет установить единый для всех стран подход для типирования и определения набора генотипов СГА, доминирующих в каждом регионе, а также их связь со структурой стрептококковой заболеваемости. Генотипы emm S. pyogenes, не находящие условий для паразитирования, могут исчезнуть из циркуляции, как и генотипы, к которым сформировался коллективный иммунитет. При его снижении стрептококковые штаммы могут вновь возвращаться и находить новую нишу. Типичным примером служит серотип М1, который перестал высеваться в большинстве стран в 60-е годы прошлого века и вернулся в конце 80-х, вызывая высоколетальные инвазивные заболевания.

Система молекулярного emm-генотипирования S. pyogenes была создана на основе вариаций нуклеотидных последовательностей, которые кодируют вариабельные участки белков Emm. Эта система основана на амплификации и последующем нуклеотидном секвенировании фрагмента гена emm с помощью праймеров, соответствующих его консервативным участкам; гены emm кодируют М-белки и коррелируют с М-типами S. pyogenes по классификации Ленсфильд [80, 82]. Эта методология позволяет определить подтвержденную последовательность гена белка M (от emm1 до emm124) и легко идентифицировать новые типы и подтипы последовательностей белка Emm. Молекулярное типирование с помощью секвенирования гена белка Emm превратилось в молекулярную методологию типирования S. pyogenes [83]. Большая база данных из более чем 200 различных последовательностей генов emm СГА доступна на веб-сайте CDC — Centers for Disease Control and Prevention [84].

Текущее определение типа основано на последовательности 90 нуклеотидов, которые кодируют 30 N-концевых аминокислотных остатков M-белка. Подтипы могут быть определены путем секвенирования 150 нуклеотидов, которые кодируют 50 N-концевых аминокислотных остатков M-белка. В связи с быстро растущей выявляемостью новых секвенированных штаммов S. pyogenes база данных постоянно растет. Однако еще не определено, являются ли новые М-белки, выявляемые исключительно с помощью секвенирования, функциональными. В большинстве случаев потенциальные антифагоцитарные или опсониногенные свойства этих белков до сих пор экспериментально не проверены [85].

Кроме того, следует отметить, что помимо emm-типирования, была разработана технология типирования СГА на основе мультилокусного секвенирования генов домашнего хозяйства (MLST), служащего инструментом для углубленного эпиданализа и изучения популяционной генетической структуры микроорганизмов. В популяционных генетических исследованиях устойчивая связь между типом emm и MLST может быть продемонстрирована для изолятов, полученных с разницей в десятилетия и/или с разных континентов [27, 86]. ST-тип СГА определяют, сравнивая нуклеотидные последовательности внутренних областей 7 генов «домашнего хозяйства» разных штаммов, с целью выявления аллельного профиля этих генов и составления формулы ST-типа СГА [86]. Для этого используют полимеразную цепную реакцию с праймерами на следующие гены: глюкозокиназы (gki), транспортного белка для глутамина (gtr), глутаматрацемазы (murl), белка репарации неправильно спаренных нуклеотидов (mutS), транскетолазы (recP), ксантинфосфорибозил-трансферазы (xpt) и ацетил-КоА-ацетилтрансферазы (yigL). Полученные в полимеразной цепной реакции амплификаты размером в 405–498 пар нуклеотидов используют для секвенирования и последующего сравнительного анализа генов. На сегодня обнаружено почти 600 ST-типов, то есть на каждый генотип emm в среднем приходится по три ST-типа, что указывает на высокий дискриминационный уровень данного подхода. Так, при типировании 212 штаммов СГА удалось выявить 33 генотипа emm; среди 28 из них обнаружены ST клоны либо клональные комплексы, вызывающие конкретную патологию; типы ST15 и ST28 были типичными для инвазивных форм СГА-инфекции. Метод MLST отличается очень высокой точностью и воспроизводимостью результатов [86].

Заключение

Исследование белков семейства М-протеинов S. pyogenes и их участия в патологии с очевидностью указывает на то, что штаммы СГА, по той или иной причине лишенные М-белков, не способны размножаться в макроорганизме и формировать очаг инфекции. Это обстоятельство само по себе еще раз подчеркивает ведущую роль М-белков в патогенности микроорганизма и реализации его многих свойств, в том числе в развитии инфекционного процесса. Не умаляя значения остальных свойств М-белков, на наш взгляд, особого внимания заслуживает феномен неиммунного Fc-связывания иммуноглобулинов, ибо он участвует в подавлении фагоцитоза, нарушениях опсонизации бактерий и активации комплемента по классическому пути, не говоря о возможной причастности этого феномена к генезу постинфекционных осложнений. Особого внимания заслуживает взаимодействие Fc-рецепции с иммунной системой, поскольку все события, преимущественно на начальных этапах, разворачиваются на поверхности глоточного лимфатического кольца и при доминировании неиммунного связывания иммуноглобулинов над иммунным. Следует помнить, что в очаге инфекции продолжается постоянное и интенсивное деление бактериальных клеток, и что СГА синтезируют не менее трех иммуноглобулин-деградирующих ферментов: IgG-деградирующий фермент — IdeS, эндогликозидазу — EndoS и экзотоксин В — SPEB, расщепляющие γ-цепь нативного IgG в шарнирной области молекулы [87, 88]. Данная область отличается от сайта расщепления папаином [89, 90]. При этом образуются фрагменты IgG, которые в совокупности, помимо существующего очага бактериальных антигенов, создадут выраженный очаг аутоантигенного стимула, вызывающий синтез антител к этим фрагментам, а по существу — аутоантител к IgG. Все это в полной мере объясняет появление в крови больных анти-IgG и их комплексов — возможных индукторов постинфекционных процессов в сердце и почках. Масштаб этой проблемы выходит за рамки настоящей статьи: она представлена авторами в отдельном обзоре [67].

Дополнительная информация

Источник финансирования. Обзор написан в рамках государственного задания ФГБНУ «ИЭМ» по теме FGWG-2022-0010 «Направленное изменение микробиоты человека как средство профилактики и лечения социально значимых заболеваний» (рег. № 122020300194-0).

Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объектов животных и людей.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Наибольший вклад распределен следующим образом: Л.А. Бурова — структура обзора, сбор литературы, авторство разделов: «введение», «структура М-белков», «функциональная активность М-белков», списка литературы; А.Н. Суворов — авторство раздела «М-типирование», подбор литературы по Mga-регулону генов стрептококков, редактирование; А.А. Тотолян — авторство раздела «заключение», общая редакция.

Additional information

Funding sources. The review was written as part of the state task of the Federal State Budgetary Scientific Institution “IEM” on the topic FGWG-2022-0010 “Directed change in the human microbiota as a means of preventing and treating socially significant diseases” (reg. No. 122020300194-0).

Compliance with ethical standards. This article does not contain any studies using animals and humans as subjects.

Competing interests. The authors declare the absence of obvious and potential conflicts of interest related to the publication of this article.

Authors̕ contribution. All authors have made a significant contribution to the development of the concept and preparation of the article, read and approved the final version before publication. The largest contribution is distributed as follows: L.A. Burova — structure of the review, collection of literature, authorship of the sections: “introduction”, “structure of M proteins”, “functional activity of M proteins”, list of references; A.N. Suvorov — author of the section “M typing”, selection of literature on the Mga-regulon of streptococcal genes, editing; A.A. Totolian — authorship of the “conclusion” section, general edition.

About the authors

Larisa A. Burova

Institute of Experimental Medicine

Author for correspondence.
Email: lburova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7687-2348
SPIN-code: 6084-1255
Scopus Author ID: 7003982261
ResearcherId: E-5270-2014

MD, Dr. Sci. (Med.), Leading Research Associate, Department of Molecular Microbiology

Russian Federation, Saint Petersburg

Alexander N. Suvorov

Institute of Experimental Medicine

Email: alexander_suvorov1@hotmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2312-5589
SPIN-code: 8062-5281
Scopus Author ID: 7101829979
ResearcherId: J-6921-2013

MD, Dr. Sci. (Med.), Professor, Corresponding Member of the Russian Academy of Sciences, Head Department of Molecular Microbiology

Russian Federation, Saint Petersburg

Artem A. Totolian

Institute of Experimental Medicine

Email: totolyan@hotmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3310-9294
SPIN-code: 1741-9171
Scopus Author ID: 57194530404
ResearcherId: J-4218-214

MD, Dr. Sci. (Med.), Professor, Academician RAS, Chief Research Associate, Department of Molecular Microbiology

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files