Generation and characterization of SARS-CoV-2 pseudoviruses

Full Text

Обоснование

В настоящее время в мире идет активная разработка вакцин, моноклональных антител и химиопрепаратов против SARS-CoV-2. Важнейший инструмент для оценки их эффективности in vitro — тесты нейтрализующей или ингибирующей активности, которые позволяют выявить и определить перспективные разработки. Анализы нейтрализации с использованием живого вируса SARS-CoV-2 трудоемки и требуют повышенных мер биобезопасности, поэтому для преодоления этих ограничений в настоящее время активно применяются альтернативные технологии, направленные на получение псевдотипированных вирусов, экспонирующих на своей поверхности гликопротеин S SARS-CoV-2. Псевдотипированные вирусы обеспечивают тот же механизм проникновения в клетку, что и SARS-CoV-2, и широко используются для исследования механизма проникновения вируса, клеточного тропизма, а также для проведения анализа вируснейтрализации. Такие псевдотипированные вирусы для анализа нейтрализации имеют два явных преимущества перед живым вирусом SARS-CoV-2. Во-первых, псевдотипированные вирусы позволяют проводить анализ в обычной лаборатории BSL-2, что упрощает и удешевляет эксперименты. Во-вторых, псевдотипированные вирусы несут маркерные гены, например люциферазу или гены зеленого флуоресцентного белка (GFP), которые обеспечивают более легкую и точную количественную оценку, чем если бы анализ проводился с живым вирусом SARS-CoV-2, в том числе в формате микронейтрализации. Для получения псевдотипированных вирусов SARS-CoV-2 используют несколько вирусных платформ, таких как вирус лейкемии мышей, вирус везикулярного стоматита и вирус иммунодефицита человека. Во многих работах отмечается корреляция между экспериментальными результатами, полученными с использованием живого вируса и псевдотипированных вирусов SARS-CoV-2 [1, 2].

Цель работы — получение псевдотипированных вирусов SARS-CoV-2 и оценка их трансдуцирующей активности.

Материалы и методы

Для получения псевдовирусов использованы следующие плазмиды: упаковочная плазмида — psPAX2 (Addgene #12260); оболочечная плазмида — ph-SΔ18, кодирующая гликопротеин S SARS-CoV-2, которую получали путем вставки соответствующей нуклеотидной последовательности (GenBank:MN908947) в вектор phMGFP. При проектировании генетической конструкции удаляли участок, кодирующий последние 18 аминокислот последовательности S-белка, а затем оптимизировали кодонный состав с помощью инструмента GeneOptimizer (https://www.thermofisher.com/ru/en/home/life-science/cloning/gene-synthetic/geneart-gene-synthetic/geneoptimizer.html). Итоговую нуклеотидную последовательность синтезировали в ООО «ДНК-Синтез». Вставку гена S-белка в акцепторный вектор осуществляли по сайтам рестрикции NheI и AsiGI. Дополнительно с помощью сайт-направленного мутагенеза в аминокислотную последовательность S-белка вносили мутацию D614G. Репортерная плазмида pLenti-Luc-GFP получена на основе лентивирусного вектора pCDH-EF1a-GaussiaSP-MCS-IRES-copGFP (любезно предоставленного Т.Н. Беловежец, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН) путем замены последовательности люциферазы Gaussia на последовательность люциферазы светлячка. Для этого проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)-амплификацию нуклеотидной последовательности люциферазы светлячка с использованием праймеров Lenti-Luc-F 5ʹ-aaaaaatctagctagccaccatggaagatgcca-3ʹ и Lenti-Luc-R 5ʹ-aaaaaaggatccttacacggcgatcttgccg-3ʹ и матрицы — плазмиды pCAG-Luc (Addgene #55764). Затем ПЦР-продукт встраивали в плазмиду pCDH-EF1a-GaussiaSP-MCS-IRES-copGFP по сайтам рестрикции XbaI и BamHI. Целостность генетических конструкций подтверждали с помощью секвенирования и рестрикционного анализа.

Плазмиду pDUO-hAce2-TMPRSS2 приобретали в коммерческой фирме InvivoGen (США).

Для получения псевдовирусных частиц, экспонирующих на своей поверхности S-белок SARS-CoV-2, проводили трансфекцию культуры клеток HEK293 плазмидами psPAX2, pLenti-Luc-GFP и phS-Δ18 с использованием липофектамина 3000 (InvivoGen, США). Псевдовирусные частицы собирали путем фильтрации культуральной среды через фильтр 0,45 мкм и последующего концентрирования в 20 % растворе сахарозы; делали аликвоты по 500 мкл и хранили при температуре –80 °C.

Трансдуцирующую активность псевдовирусов в отношении клеток-мишеней, определяли с использованием клеточных линий HEK293 (коллекция культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора), HEK293-hACE2 (коллекция культур клеток Института молекулярной и клеточной биологии СО РАН) и HEK293-hACE2-TMPRSS2 (t), полученной путем транзиентной трансфекции клеточной линии HEK293 плазмидой pDUO-hAce2-TMPRSS2. Краткое описание: 50 мкл трипсинизированной суспензии клеток HEK293, клеток HEK293-hACE2 и HEK293-hACE2-TMPRSS2 в концентрации 1 · 10⁶ клеток/мл среды высевали в 96-луночный планшет. Затем к клеткам добавляли по 10 мкл супернатанта, содержащего псевдовирусы, в трех повторах. Через 48 ч определяли уровень люминесценции с помощью системы анализа люциферазы (Promega, США). После удаления ростовой среды с клеток, инфицированных псевдовирусом, их лизировали однократным буфером для лизиса клеточных культур (50 мкл/лунку) (Promega, США). Затем 35 мкл лизата переносили в черные оптические планшеты, добавляли субстрат люциферазы светлячка (Promega, США) и измеряли уровень люминесценции на приборе Varioskan LUX (Thermo Scientific, США).

Анализ вируснейтрализации проводили с моноклональными антителами по методике [3]. Для этого использовали рекомбинантные моноклональные антитела DA, 6B3 и M6N, которые взаимодействуют с рецепторсвязывающим доменом (RBD) гликопротеина S SARS-CoV-2 (МКА любезно предоставлены Д.В. Шаньшиным, ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора). Как отрицательный контроль использовали моноклональное антитело VRC01, мишень которого — CD4-связывающий сайт поверхностного гликопротеина ВИЧ-1.

Статистическую обработку полученных результатов проводили в программе GraphPad Prism 9.

Результаты и обсуждение

В настоящее время псевдовирусная система широко применяется для изучения клеточного тропизма и рецепторной специфичности, механизмов проникновения вирусов и ингибирования данного этапа, а также для тестирования антител, химиопрепаратов и вакцин [4].

В данной работе для получения псевдовирусных частиц взята лентивирусная платформа второго поколения на основе ВИЧ-1, которая подразумевает сочетание нескольких плазмид: упаковочной плазмиды, экспрессирующей белки Gag и Pol и обеспечивающей формирование лентивирусных частиц; трансферной, или репортерной, плазмиды, содержащей репортерные гены; оболочечной плазмиды, обеспечивающей синтез поверхностного гликопротеина [5]. Как упаковочную плазмиду использовали psPAX2; как оболочечную плазмиду — ph-SΔ18, несущую кодон-оптимизированный ген гликопротеина S SARS-CoV-2 с мутацией D614G и делетированным участком из 18 а. о. на С-конце. Эти модификации дают более высокие титры инфекционности по сравнению с полноразмерным гликопротеином S дикого типа [3]. Кроме того, продемонстрировано, что усечение 18 или 19 С-концевых аминокислот, включающих предполагаемый сигнал удержания в эндоплазматическом ретикулуме, повышает эффективность псевдотипирования на основе ВИЧ [3]; репортерная плазмида — pLenti-Luc-GFP.

После наработки и концентрирования псевдовирусных частиц оценивали их трансдуцирующую активность. Известно, что SARS-CoV-2 для проникновения в клетку-мишень использует ангиотензинпревращающий фермент 2 (human angiotensin converting enzyme 2, ACE2) как свой целевой рецептор [6], поэтому для анализа мы взяли клеточную линию HEK293-hACE2, клетки которой стабильно экспонируют ACE2 на своей поверхности. Помимо этого, для проникновения вируса требуется праймирование S-белка клеточными протеазами, в частности сериновой протеазой TMPRSS2 (transmembrane serine protease 2) [7]. Именно поэтому для исследования трансдуцирующей активности псевдовирусов мы также использовали клетки HEK293-hACE2-TMPRSS2 (t), полученные путем транзиентной трансфекции клеточной линии HEK293 плазмидой pDUO-hACE2-TMPRSS2. Согласно результатам, наилучшее проникновение псевдовирусных частиц наблюдалось при заражении HEK293-hACE2-TMPRSS2 (t), в то время как инфекционность полученных псевдовирусов SARS-CoV-2 на клетках HEK293-hACE2 оказалась в 10 раз ниже и ее практически не было в клетках HEK293 (рис. 1). Эти результаты согласуются с ранее опубликованными данными [3, 7].

 

Рис. 1. Инфекционность псевдовирусных частиц, экспонирующих S-белок SARS-CoV-2, на клетках HEK293, HEK293-hACE2 и HEK293-hACE2-TMPRSS2 (t). Образцы тестировали в трех повторах, эксперимент проводили дважды. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение

Fig. 1. Infectivity of pseudoviral particles displaying SARS-CoV-2 S protein on HEK293, HEK293-hACE2 and HEK293-hACE2-TMPRSS2 cells (t). The samples were tested in triplicate, the experiment was carried out twice. Data are presented as mean ± standard deviation

 

Для первичной оценки работоспособности псевдовирусов как антигена был проведен анализ вируснейтрализации с использованием моноклональных рекомбинантных антител DA, 6B3 и M6N, которые взаимодействуют с RBD гликопротеина S SARS-CoV-2. Согласно полученным результатам, псевдовирусы оказались чувствительны к нейтрализации данными антителами и не чувствительны к нейтрализации моноклональным антителом VRC01 (рис. 2).

 

Рис. 2. Нейтрализация псевдовирусных частиц, экспонирующих на своей поверхности гликопротеин S SARS-CoV-2, моноклональными антителами при концентрации 1 мкг/мл. Образцы тестировали в трех повторах, эксперимент проводили дважды. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение

Fig. 2. Neutralization of pseudoviral particles displaying SARS-CoV-2 S glycoprotein on their surface with monoclonal antibodies at a concentration of 1 μg/ml. The samples were tested in triplicate, the experiment was carried out twice. Data are presented as mean ± standard deviation

 

Выводы

Таким образом, полученные и охарактеризованные псевдовирусы, экспонирующие на своей поверхности гликопротеин S SARS-CoV-2, могут быть использованы как для поиска противовирусных препаратов, способных блокировать проникновение SARS-CoV-2 в клетки-мишени, так и для оценки эффективности разрабатываемых моноклональных антител и вакцин против SARS-CoV-2.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Исследование выполнено в рамках государственного задания ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, связанного с подготовкой и публикации статьи.

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Наибольший вклад распределен следующим образом: Н.Б. Рудомётова, Д.Н. Щербаков — концепция исследования и разработка дизайна исследования, анализ данных, написание текста рукописи; Л.И. Карпенко — научное редактирование и утверждение окончательного варианта статьи перед публикацией.

Additional information

Funding sources. The study was carried out as part of the state assignment of FBRI SRC VB “Vector” of Rospotrebnadzor.

Competing interests. The authors declare that there is no conflict of interest related to the preparation and publication of the article.

Authors̕ contribution. All authors made a significant contribution to the development of the concept and preparation of the article, read and approved the final version before publication. The largest contribution is distributed as follows: N.B. Rudometova, D.N. Shcherbakov — study concept and study design development, data analysis, drafting the manuscript; L.I. Karpenko — scientific editing and approved the final version before publication.

About the authors

Nadezhda B. Rudometova

State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector”, Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Well-being

Author for correspondence.
Email: nadenkaand100@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1684-9071
SPIN-code: 5283-6608

Cand. Sci. (Biol.), Research Associate

Russian Federation, Koltsovo, Novosibirsk Region

Dmitry N. Shcherbakov

State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector”, Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Well-being

Email: dnshcherbakov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-8023-4453
SPIN-code: 9616-0933
Scopus Author ID: 37027118800

Dr. Sci. (Biol.), Leading Research Associate

Russian Federation, Koltsovo, Novosibirsk Region

Larisa I. Karpenko

State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector”, Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Well-being

Email: karpenko@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0003-4365-8809
SPIN-code: 2026-5992
Scopus Author ID: 7005000410

Dr. Sci. (Biol.), Assistant Professor, Leading Research Associate

Russian Federation, Koltsovo, Novosibirsk Region

References

Supplementary files