Assessment of cell-mediated immune responses to SARS-CoV-2 in Syrian hamsters

Full Text

Обоснование

Пандемия COVID-19, вызванная вирусом SARS-CoV-2, к настоящему времени насчитывает более 500 млн случаев острой респираторной инфекции, она унесла жизни более 6 млн человек во всем мире [1]. Созданные в кратчайшие сроки вакцины первого поколения позволили значительно снизить ущерб от новой инфекции [2]. Подавляющее большинство лицензированных вакцин от COVID-19 (в ответ на иммунизацию которыми вырабатываются преимущественно вирусспецифические антитела) включают основной поверхностный антиген коронавируса — spike-белок (S-белок). Однако существенный их недостаток — высокая степень антигенной изменчивости S-белка, что приводит к снижению эффективности вакцин против вновь появляющихся вариантов SARS-CoV-2 [3]. Вирусспецифические Т-клетки — важный элемент иммунитета, который может ограничивать тяжесть заболевания и способствовать выздоровлению, при этом Т-клетки более долгоживущие по сравнению с В-клетками, их действие чаще всего направлено на консервативные вирусные эпитопы [4, 5]. В этой связи разработка Т-клеточных вакцин от COVID-19 — перспективная стратегия для создания вакцин, обеспечивающих длительную защиту от широкого спектра антигенных вариантов SARS-CoV-2 [6]. Оценка иммуногенности Т-клеточных вакцин на наиболее распространенной модели лабораторных животных для SARS-CoV-2, сирийских хомячках, осложняется отсутствием доступных реагентов и тест-систем, позволяющих адекватно оценивать уровни вирусспецифического клеточного иммунитета на вакцинацию. Наиболее чувствительный метод оценки T-клеточного ответа — метод ELISpot (Enzyme-Linked Immunospot assay), который позволяет количественно оценить секрецию цитокинов клетками, стимулированными in vitro [7]. В результате активированные клетки приобретают способность продуцировать различные цитокины, которые в свою очередь распознаются специфическими антителами, заранее нанесенными на подложку для ELISpot. Чаще всего для оценки клеточного иммунитета к новому коронавирусу используется стимуляция клеток пулом пептидов, покрывающих последовательность какого-либо белка вируса SARS-CoV-2 [8, 9]. Однако наборы таких пептидов соответствуют неполному вирусному протеому, что может привести к занижению данных об уровне вирусспецифических Т-клеток. В нашем исследовании для выявления максимального специфического ответа к вирусу SARS-CoV-2 предлагается стимуляция иммунных клеток цельным живым коронавирусом.

Цель статьи — отработка условий стимуляции иммунных клеток сирийских хомячков живым вирусом SARS-CoV-2 для выявления IFNγ-продуцирующих клеток методом ELISpot.

Материалы и методы

Для формирования значимого иммунного ответа к вирусам SARS-CoV-2 сирийских хомячков (Mesocricetus auratus, n = 3) заражали двукратно интраназально умеренной дозой коронавируса, не вызывающей клинических проявлений заболевания (10⁴ ТЦИД₅₀), с трехнедельным интервалом. Для заражения использовали штамм вируса SARS-CoV-2 (номер доступа в базе GISAID: EPI_ISL_1789542). Контрольная группа животных получала раствор фосфатно-солевого буфера.

На 5-й день после повторного заражения провели забор тканей легких и селезенок. Выделение клеток из них проводили по стандартному протоколу [10], живые клетки подсчитывали на автоматическом счетчике клеток TC20 (Bio-Rad) с отсечением по размеру, соответствующему лимфоцитам. В стерильные 96-луночные планшеты вносили клетки в количестве 5 · 10⁵ в объеме 100 мкл, после чего к ним добавляли различные дозы цельного вируса, очищенного на градиенте плотности сахарозы. Контроль стимуляции проводили PepTivator — набором коммерческих пептидов, покрывающих последовательности S- и N-белков SARS-CoV-2 (Miltenyi Biotec, Германия). После перемешивания смесь клеток и стимуляторов вносили в лунки планшета из коммерческого набора Hamster IFNγ ELISpot PLUS kit (Mabtech, Швеция) и инкубировали 24 ч при 37 °C в атмосфере 5 % СО₂. После инкубации планшеты проявляли, а уровни IFNγ-продуцирующих клеток количественно учитывали на приборе AID vSpot Spectrum (Advanced Imaging Devices, Германия).

Работу с вирусом SARS-CoV-2 выполняли в лаборатории, соответствующей уровню биобезопасности BSL-3.

Результаты и обсуждение

Разработка Т-клеточных вакцин от COVID-19 — перспективный путь усовершенствования первого поколения вакцин от SARS-CoV-2, направленных на выработку нейтрализующих антител к S-белку [11]. Однако это самый вариабельный белок нового коронавируса, поэтому вновь возникающие варианты SARS-CoV-2 могут ускользать от антител, выработанных после вакцинации [12]. При доклиническом изучении Т-клеточных вакцин важно подобрать адекватные условия оценки Т-клеточного иммунитета на моделях животных, чтобы учитывались все возможные эпитопы коронавируса, участвующие в ответе на иммунизацию. В настоящем исследовании для поиска оптимальных условий стимуляции иммунных клеток сирийских хомячков использовали различные дозы вируса SARS-CoV-2, соответствующие множественности заражения (multiplicity of infection, MOI) 1, 0,1, 0,01 и 0,001 (количество инфекционных единиц вируса на одну клетку). Детекция спотов после стимуляции клеток селезенок не выявила достоверных различий между группами при дозах 1, 0,1 и 0,01 MOI (см. рисунок). Применение таких заражающих доз позволило получить статистически достоверно большее количество спотов по сравнению с использованием набора коммерческих пептидов (PepTivator) для стимуляции спленоцитов. Данные литературы свидетельствуют, что мишенями для Т-клеточного ответа могут быть неструктурные белки вируса [13], которые обычно не входят в состав коммерческих пептидных пулов. В данном исследовании стимуляция клеток проводилась цельным реплицирующимся вирусом и, соответственно, происходил синтез всех белков, включая неструктурные белки, что указывает на перспективность использования цельного вируса для стимуляции клеток in vitro для выявления максимального уровня цитокин-продуцирующих клеток у животных, зараженных SARS-CoV-2 или иммунизированных специфическими вакцинами. W.A. Mak и соавт. [9] отметили, что при стимуляции мононуклеаров периферической крови нет корреляции между количеством полученных спотов и концентрацией используемых для этого пептидов.

 

Рис. 1. Изучение специфического ответа к антигенам SARS-CoV-2 методом ELISpot на модели сирийских хомячков: a — пример данных анализа индивидуальных лунок планшета для ELISpot с помощью прибора AID vSpot Spectrum; b — оценка количества спотов после стимуляции клеток инфицированных животных. Двукратное заражение сирийских хомячков проведено с использованием вируса SARS-CoV-2 или фосфатно-солевого буфера (PBS). Статистический анализ проводился методом двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA с поправкой Тьюки на множественное сравнение. MOI — multiplicity of infection, множественность заражения. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001

Fig. 1. Detection of antigen-specific response to SARS-CoV-2 in the spleens and lung cells of Syrian hamsters using ELISpot assay: a — example of data obtained after analysis of individual wells of the ELISpot plate using the AID vSpot Spectrum; b — number of spots after stimulation of the cells of infected animals. Syrian hamsters were infected twice using SARS-CoV-2 virus or PBS. Data were analyzed by two-way ANOVA with Tukey’s post-hoc multiple analyses test. MOI — multiplicity of infection. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001

 

Кроме того, нам важно было оценить возможность изучения не только системного, но и локального T-клеточного иммунного ответа на антигенную стимуляцию клеток селезенок. Поскольку вирус SARS-CoV-2 поражает в первую очередь респираторные органы, а тяжесть заболевания тесно связана с наблюдаемыми патологическими изменениями в легких [14], важно оценить, насколько вакцинация может формировать локальный ответ в легких на быструю активацию при обнаружении соответствующего патогена [10]. В этой связи мы оценивали возможность выявления IFNγ-продуцирующих клеток, выделенных из легочной ткани инфицированных животных. Показано, что при использовании высокой дозы стимулирующего вируса (множественность заражения 1 и 0,1) выявляется большее количество спотов по сравнению с действием коммерческих пептидов к S- и N-белкам, что также подтверждает возможность оценки T-клеточного ответа к полному протеому вируса при использовании цельного реплицирующегося вируса (см. рисунок, b).

Стоит также отметить, что стимуляция клеток животных, получавших раствор фосфатно-солевого буфера, не привела к формированию специфического ответа к IFNγ (см. рисунок).

Таким образом, наше исследование показало возможность изучения клеточного иммунного ответа к вирусу SARS-CoV-2 методом ELISpot на модели сирийских хомячков и продемонстрировало преимущество стимуляции клеток легких и спленоцитов цельным очищенным вирусом SARS-CoV-2 по сравнению с пулом перекрывающихся пептидов отдельных вирусных белков. Преимущество такого подхода не только в силе индуцируемого ответа, но и в его универсальности. Например, существующие стратегии вакцинации включают кроме основных антигенов вирусных белков S, N и M цельный вирус (как мишени) [15]. Кроме того, показано, что стимуляция моноцитов крови привитых мРНК-вакциной против S-белка с использованием N- и M-пептидов, неэффективна [9]. В то же время применение цельного вируса для стимуляции клеток — наиболее универсальный подход, который позволяет оценить иммунный ответ не только в результате перенесенной болезни, но и после проведения вакцинации любым типом вакцин.

Выводы

Итак, метод ELISpot — перспективный инструмент для изучения клеточного иммунного ответа к антигенам SARS-CoV-2 на модели сирийских хомячков. Максимальные уровни значений ответа могут быть выявлены при стимуляции иммунных клеток живым коронавирусом в дозе, соответствующей множественности заражения 0,1 или 0,01.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда (грант № 21-75-30003).

Конфликт интересов. Авторы декларирует отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Соблюдение этических норм. Исследование одобрено на заседании локального этического комитета ФГБНУ «Института экспериментальной медицины» (№ 1/22 от 18.02.2022).

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Наибольший вклад распределен следующим образом: И.Н. Исакова-Сивак — идея, план исследований; Д.А. Меженская — проведение экспериментов, анализ данных; Л.Г. Руденко — администрирование проекта.

Additional information

Funding sources. The study was funded by the Russian Science Foundation (grant No. 21-75-30003).

Competing interests. The authors declare the absence of obvious and potential conflicts of interest related to the publication of this article.

Compliance with ethical standards. The study was approved by the local Ethical Committee of the Institute of Experimental Medicine (No. 1/22 by 18.02.2022).

Authors̕ contribution. All authors made a significant contribution to the development of the concept and preparation of the article, read and approved the final version before publication. The largest contribution is distributed as follows: I.N. Isakova-Sivak — concept, research plan; D.A. Mezhenskaya — conducting experiments, their interpretation; L.G. Rudenko — project administration.

About the authors

Daria А. Mezhenskaya

Institute of Experimental Medicine

Author for correspondence.
Email: dasmez@iemspb.ru
ORCID iD: 0000-0001-6922-7682
SPIN-code: 5799-8802
Scopus Author ID: 57188763106

Research Associate of Laboratory of Immunology and Prevention of Viral Infections, A.A. Smorodintsev Department of Virology

Russian Federation, Saint Petersburg

Irina N. Isakova-Sivak

Institute of Experimental Medicine

Email: isakova.sivak@iemspb.ru
ORCID iD: 0000-0002-2801-1508
SPIN-code: 3469-3600
Scopus Author ID: 23973026600

Dr. Sci. (Biol.), Head of Laboratory of Immunology and Prevention of Viral Infections, A.A. Smorodintsev Department of Virology

Russian Federation, Saint Petersburg

Larisa G. Rudenko

Institute of Experimental Medicine

Email: vaccine@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0107-9959
SPIN-code: 4181-1372
Scopus Author ID: 7005033248

MD, Dr. Sci. (Med.), Professor, Head of the A.A. Smorodintsev Department of Virology

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files