Attenuation markers of cold-adapted SARS-CoV-2 variants

Cover Page


Cite item

Full Text

Open Access Open Access
Restricted Access Access granted
Restricted Access Subscription or Fee Access

Abstract

BACKGROUND: Unprecedented anti-epidemic measures and the widespread use of vaccines against COVID-19 have reduced the rate of hospitalization and mortality from the disease, but have not stopped the SARS-CoV-2 pandemic spread. The development of live vaccines against COVID-19, capable of providing the formation of a long-term humoral and cellular immune response and cross-protection against new SARS-CoV-2 variants of concern, is relevant. Previously at the I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera SARS-CoV-2 cold-adapted (ca, cold-adapted) variants were obtained. This work is aimed to search for methodological approaches that allow in vitro screening studies to assess the attenuation (att) phenotype of ca SARS-CoV-2 variants.

MATERIALS AND METHODS: The SARS-CoV-2 laboratory strain Dubrovka and its variants were cultured in Vero and Calu-3 cells. Quantitation of the virus was carried out by titration in Vero cells and by real-time RT-PCR. The attenuation (att) phenotype of SARS-CoV-2 variants was determined on an animal model of COVID-19 on Syrian hamsters.

RESULTS: In experiments on Syrian hamsters, the presence of the att phenotype in the ca variants of the virus was established. Animals infected with virus ca variants had significantly less weight lost, had less viral load in the lungs and brain and less pronounced pathological changes in the lungs compared to infection with the virulent strain. In vitro experiments on Vero and Calu-3 cells revealed probable attenuation markers of the virus ca variants for syrian hamsters: (1) ability to reproduce at low temperature (ca phenotype); (2) inability to reproduce at 39 °C (ts phenotype); (3) changes in the species and tissue specificity of the virus.

CONCLUSIONS: The developed methodological approaches to the identification of SARS-CoV-2 attenuation markers are a valuable tool for monitoring the stability of the phenotype of candidate vaccine strains.

Full Text

Список сокращений

MOI — множественность заражения; п. и. — после инфицирования; ОТ–ПЦР–РВ — полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в режиме реального времени; РНК — рибонуклеиновая кислота; ТЦД50 — 50 % тканевая цитопатическая доза.

Обоснование

SARS-CoV-2 — это высокопатогенный коронавирус, который появился в конце 2019 г. и вызвал пандемию острого респираторного заболевания COVID-19, что привело к глобальным социально-экономическим проблемам. Беспрецедентные противоэпидемические мероприятия и широкое применение вакцин против COVID-19 позволили снизить уровень госпитализации и смертности от заболевания, но не остановили пандемическое распространение SARS-CoV-2. Эффективность вакцинопрофилактики снижается в результате появления новых вариантов SARS-CoV-2, отличающихся повышенной эпидемиологической значимостью (Variants of concern, VOC) [1–3], таких как Delta (B.1.617.2) и Omicron (B.1.1.529). Эти варианты обладают повышенной контагиозностью и плохо нейтрализуется антисыворотками, полученными от реконвалесцентов COVID-19 и вакцинированных лиц [4–7].

В связи с этим актуальны исследования по разработке живой аттенуированной вакцины против COVID-19, способной обеспечить формирование длительного клеточного и гуморального иммунного ответа, а также перекрестную защиту в отношении новых эпидемиологически значимых вариантов SARS-CoV-2.

Ранее в НИИ вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова были получены варианты коронавируса SARS-CoV-2, способные эффективно размножаться при температуре 23 °C, то есть обладающие холодоадаптированным (ca, cold-adapted) фенотипом [8].

Цель настоящей статьи — поиск методических подходов, позволяющих производить скрининговые исследования in vitro для оценки аттенуационного (att) фенотипа ca-вариантов SARS-CoV-2.

Материалы и методы

Вирус и культура клеток. В работе использован лабораторный штамм SARS-CoV-2 Dubrovka (идент. № GenBank: MW514307.1, классификация по Pangolin B.1.1.317), филогенетически близкий штамму Wuhan-Hu-1 (идент. № GenBank: MN908947.3) [9], и его варианты: Dubrovka-37, Dubrovka-ca-B4, Dubrovka-ca-D2 (номера GenBank: ON380441.1, ON059701.1 и ON040961.1 соответственно). Ca-варианты вируса Dubrovka-ca-B4, Dubrovka-ca-D2 получены путем длительного пассирования (42 пассажа) штамма Dubrovka в культуре клеток Vero при постепенно понижаемой до 23 °C температуре с последующим трехкратным клонированием, достигая титра 6,0–7,0 lg 50 % тканевой цитопатической дозы (ТЦД50) на мл на 7-е сутки культивирования [8]. Вариант Dubrovka-37, полученный путем длительного пассирования (42 пассажа) штамма Dubrovka в культуре клеток Vero при температуре 37 °C, при температуре 23 °C не размножался.

Культивирование вируса и экспериментальное заражение проводили на клетках эпителия почки африканской зеленой мартышки Vero CCL81 (American Type Culture Collection, АТСС) (далее клетки Vero) и клетках рака легких человека Calu-3 HTB-55 (ATСС) (далее клетки Calu-3). Клетки культивировали при 37 °C в питательной среде ДМЕМ на основе буфера Эрла (ПанЭко, Россия) с добавлением 5 % эмбриональной сыворотки коров (Gibco, США), L-глутамина, 300 мкг/мл (ПанЭко), гентамицина, 40 мкг/мл (ПанЭко) в атмосфере 5 % СО2. Трехдневный монослой клеток Vero или Calu-3 заражали вирусом SARS-CoV-2 при желаемой множественности заражения (MOI), в течение 60 мин проводили адсорбцию вируса, добавляли поддерживающую среду (ростовая среда без 5 % эмбриональной сыворотки коров) и инкубировали при температуре от 23 до 39 °C в течение 3–8 сут (в зависимости от варианта вируса и цели эксперимента).

Животные. В работе использованы самки золотистых сирийских хомяков (n = 36, масса тела 40–50 г) из НПП «Питомник лабораторных животных» Института биоорганической химии РАН.

Титрование вируса SARS-CoV-2 поводили в культуре клеток Vero так, как описано ранее [9], по конечной точке проявления цитопатического действия. Титр вируса рассчитывали по M.A. Ramakrishnan [10] и выражали в lg ТЦД50/мл.

Идентификацию вируса и количественное определение РНК SARS-CoV-2 в культуральной жидкости и гомогенатах органов проводили методом полимеразной цепной реакци с обратной транскрипцией в режиме реального времени (ОТ–ПЦР–РВ) с вирусоспецифическими праймерами и зондом к гену нуклеокапсида N вируса SARS-CoV-2, как описано ранее [9, 11].

Оценка аттенуационного (att) фенотипа ca-вариантов SARS-CoV-2. Сирийских хомяков (самки, 40 г) заражали интраназально штаммом Dubrovka и ca-вариантами вируса в дозе 4,0 lg ТЦД50/голову. Ежедневно оценивали состояние животных по реакции на звуковые раздражители, активности и взаимодействию в группе, наполненности защечных мешков (оценка аппетита). Каждые 2 дня проводили контроль веса. Через четверо суток после заражения животных гуманно умерщвляли и отбирали легкие и головной мозг для гистологического исследования, определения вирусного титра и концентрации вирусной РНК. Достоверно меньшая потеря в весе, более низкие титр вируса и концентрация вирусной РНК в легких и мозге, менее выраженные патологические изменения в легких животных по сравнению с заражением вирулентным штаммом Dubrovka свидетельствовали о наличии у вируса att-фенотипа для сирийских хомяков.

Оценка температурочувствительного (ts) фенотипа ca-вариантов SARS-CoV-2. Клетки Vero заражали ca-вариантами SARS-CoV-2 и штаммом Dubrovka при множественности заражения (MOI) 0,001 и инкубировали при температуре 39 °C. Через 3 сут после инфицирования (п. и.) отбирали образцы культуральной жидкости и определяли в них титр вируса и концентрацию вирусной РНК. Разница в титре вируса или концентрации вирусной РНК по сравнению с заражением штаммом Dubrovka на 4,0 lg и более свидетельствовала о наличии у вируса ts-фенотипа.

Оценка чувствительности клеточных линий к разным вариантам вируса SARS-CoV-2. Клетки Calu-3 и Vero заражали вариантами SARS-CoV-2 и диким штаммом Dubrovka (второй пассаж) при MOI 0,001, инкубировали в поддерживающей среде при температуре 37 °C. Через 3 сут п. и. отбирали образцы культуральной жидкости и определяли в них концентрацию вирусной РНК. Снижение на 3,0 lg и более концентрации вирусной РНК в клетках Calu-3 по сравнению с Vero свидетельствовало об изменении видовой и/или тканевой специфичности вируса.

Гистологическое исследование препаратов легких сирийских хомяков проводили в отделении экспериментальной фармакологии и токсикологии МНИОИ им. П.А. Герцена. Правое легкое мышей фиксировали в 10 % нейтральном забуференном формалине в течение 24 ч, обезвоживали и заливали в Гистомикс. На этапе заливки материал ориентировали вдоль длинной оси. Ступенчатые срезы толщиной 3–5 мкм изготавливали на ротационном микротоме Leica RM 2125 RTS (Leica, Германия), затем окрашивали гематоксилином и эозином и заключали в канадский бальзам. Гистологические препараты исследовали под световым микроскопом BX 51 (Olympus, Япония) с системой фоторегистрации материала.

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета RStudio (версия 1.0.143). Для количественных показателей результат представлен в виде среднего значения ± стандартное отклонение (SD) и медианы. Нормальность распределения определяли по методу Колмогорова – Смирнова. Для межгрупповых сравнений количественных показателей применяли однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) или непараметрический U-критерий Манна – Уитни, при множественных сравнениях — тест Тьюки (Tukey’s HSD) или Данна (Dunn’s test). Поправку на множественные сравнения проводили по методу Холма – Бонферрони. При использовании статистических процедур различия считали статистически значимыми при p ≤ 0.05.

Результаты

Оценка аттенуационного (att) фенотипа сa-вариантов SARS-CoV-2

При экспериментальном заражении ca вариантами SARS-CoV-2 у сирийских хомяков не наблюдалась задержка в приросте веса и изменений в поведении по сравнению с отрицательным контролем — незараженными животными (ANOVA: F = 0,57, p = 0,97). Напротив, при заражении вирулентным штаммом Dubrovka со 2-го по 6-й день отмечалась задержка в приросте веса, достигавшая максимальных значений в 13,4 % на 4-й день и 10,1 % — на 6-й день (рис. 1), а также снижение аппетита, вялость и сонливость. Различия в весе наблюдались в сравнении как с ca-вариантами SARS-CoV-2, так и с контрольной группой на 4-й день (ANOVA: F = 32,88, p = 0,00001) и на 6-й день (ANOVA: F = 7,211, p = 0.001). К 7-му дню после заражения вес животных сравнялся между всеми группами.

 

Рис. 1. Динамика веса хомяков, интраназально зараженных вариантами SARS-CoV-2. K — незараженные хомяки. Среднее значение ± SD. Тест Тьюки (Post Hoc Tukey HSD): ** p < 0,001, * p < 0,01, в сравнении с группой животных, зараженных штаммом Dubrovka

Fig. 1. Weight of hamsters infected intranasally with SARS-CoV-2 variants. K — uninfected hamsters. Mean ± SD. Post Hoc Tukey HSD: ** p < 0,001, * p < 0,01, compared with a group infected with the Dubrovka variant

 

В легких и мозге животных на 4-е сутки после заражения ca-вариантами вируса концентрация вирусной РНК и титр вируса была достоверно ниже по сравнению с контрольной группой, зараженной вирулентным штаммом Dubrovka (рис. 2). Наименьшая концентрация вирусной РНК в органах наблюдалась при заражении вариантом Dubrovka-са-D2 — в легких 6,5 lg копий РНК/мл (Z = 2,84, p = 0,004, post-hoc Dunn’s test, с поправкой Холма – Бонферрони), в мозге 3,3 lg копий РНК/мл (Z = 3,1, p = 0,001), что на 1,6 и 3,2 lg соответственно ниже, чем в контрольной группе. Титр вируса в гомогенатах легких животных на 4-е сутки после заражения ca-вариантами вируса составлял 5,0 lg ТЦД50/мл, что на 1,2 lg ниже, чем в контрольной группе (Z = 2,38, p = 0,02). Инфекционный вирус в мозге на 4-е сутки после заражения ca-вариантами не обнаруживался, тогда как при заражении штаммом Dubrovka достигал 5,0 lg ТЦД50/мл гомогената.

 

Рис. 2. Распределение вируса в легких и мозге хомяков на 4-е сутки после заражения: a — концентрация вирусной РНК; b — титр вируса. D — штамм Dubrovka; ca-B4 — вариант Dubrovka-са-B4; ca-D2 — вариант Dubrovka-ca-D2; K — незараженные хомяки; n/d — не обнаружено. Медиана ± интерквантильный размах (n = 4). Тест Данна (post-hoc Dunn’s test) с поправкой Холма – Бонферрони: * p < 0,01, ** p < 0,05, *** p > 0,05

Fig. 2. Virus distribution in the lungs and brain of hamsters, 4th day after challenge: a — the viral RNA concentration; b — virus titer. D — Dubrovka strain; ca-B4 — Dubrovka-ca-B4 variant; ca-D2 — Dubrovka-ca-D2 variant; K — uninfected hamsters; n/d — not detected. Median ± interquantile range (n = 4). Post-hoc Dunn’s test with Holm-Bonferroni correction: * p < 0.01, ** p < 0.05, *** p > 0.05

 

При гистологическом исследовании в препаратах легких незараженных хомяков патологических изменений выявлено не было. На 4-е сутки после иммунизации SARS-CoV-2 в легких всех экспериментальных групп развивались воспалительные изменения, соответствовавшие вирусной (интерстициальной) пневмонии. Однако между группами отмечены существенные отличия по выраженности и распространенности воспалительных изменений. Так, при заражении вирулентным штаммом Dubrovka в легких хомяков развивалась долевая вирусная пневмония, которая сопровождалась выраженными альтеративными и воспалительными изменениями в респираторном отделе: образованием обширных сливных безвоздушных очагов пневмонии, десквамацией и гибелью респираторного эпителия, образованием перибронхиальной и периваскулярной лимфогистиоцитарной инфильтрации, воспалительной инфильтрацией межальвеолярных перегородок, выраженным полнокровием сосудов и микрососудов, периваскулярным отеком, интраальвеолярным и интерстициальным отеком, интраальвеолярными кровоизлияниями.

На 4-е сутки после заражения вариантами Dubrovka-ca-B4 и Dubrovka-ca-D2 распространенность и выраженность альтеративно-воспалительных изменений в легких сирийских хомяков были ниже, чем в группе, зараженной штаммом Dubrovka. В частности, в респираторном тракте отсутствовали признаки нарушения кровообращения и выраженного повреждения межальвеолярных перегородок

Сопоставление полученных результатов по изменению веса животных, интенсивности вирусной репродукции в легких и мозге, а также гистологического исследования органов показало наличие у ca-вариантов Dubrovka-ca-B4 и Dubrovka-ca-D2 att-фенотипа для сирийских хомяков.

Выявление маркеров аттенуации сa-вариантов SARS-CoV-2 in vitro

Установлено, что при температуре 39 °C вариант Dubrovka-са-D2 не размножается в культуре клеток Vero (рис. 3), то есть, обладает выраженным ts-фенотипом. Штамм Dubrovka и вариант Dubrovka-са-B4 ts фенотипом не обладали.

 

Рис. 3. Показатели репродукции вариантов SARS-CoV-2 в культуре клеток Vero на 3-и сутки п. и. (39 °С, MOI 0,001): a — концентрация вирусной РНК; b — титр вируса. D — штамм Dubrovka; ca-B4 — вариант Dubrovka-са-B4; ca-D2 — вариант Dubrovka-ca-D2; K — незараженные хомяки; n/d — не обнаружено. Данные двух независимых экспериментов; пороговое значение методов детекции: титрование — 1,0 lg ТЦД50/мл, ОТ–ПЦР–РВ — 3,0 lg копий РНК/мл

Fig. 3. Reproduction rate of SARS-CoV-2 variants in Vero cells on day 3 p.i. (39 °C, MOI 0.001): a — the concentration of viral RNA; b —virus titer. D — Dubrovka strain; ca-B4 — Dubrovka-ca-B4 variant; ca-D2 — Dubrovka-ca-D2 variant; K — uninfected hamsters; n/d — not detected. Data from two independent experiments; threshold value of detection methods: Titration — 1.0 lg TCID50/ml, real-time RT-PCR — 3.0 lg RNA copies/ml

 

Для адаптированных к культуре клеток Vero вариантов Dubrovka-37, Dubrovka-са-D2 и Dubrovka-са-B4 концентрация вирусной РНК в культуре клеток легких человека Calu-3 на 3-и сутки п. и. была на 3,0–6,0 lg ниже по сравнению с диким штаммом Dubrovka (2-й пассаж) при температуре культивирования 37 °C (рис. 4). При этом репродуктивная активность всех вариантов вируса в клетках Vero была высокой и не имела выраженных отличий от других вариантов.

 

Рис. 4. Концентрация вирусной РНК в культурах клеток Calu-3 и Vero, зараженных вариантами SARS-CoV-2 на 3-и сутки п. и. (MOI 0,001). D — штамм Dubrovka (2-й пассаж); ca-B4 — вариант Dubrovka-са-B4; ca-D2 — вариант Dubrovka-ca-D2; D-37 — вариант Dubrovka-37. Данные двух независимых экспериментов; пороговое значение для реакции ОТ–ПЦР–РВ — 3,0 lg копий РНК/мл

Fig. 4. The concentration of viral RNA in Calu-3 and Vero cells infected with SARS-CoV-2 variants on day 3 of p. i. (MOI 0.001). D — Dubrovka strain (2nd passage); ca-B4 — Dubrovka-ca-B4 variant; ca-D2 — Dubrovka-ca-D2 variant; D-37 — Dubrovka-37 variant. Data from two independent experiments; the threshold value for the real-time RT-PCR is 3.0 lg RNA copies/ml

 

Обсуждение

В многочисленных исследованиях доказано, что вирусы человека и животных могут быть адаптированы к росту при пониженной температуре с приобретением ts- и att-фенотипа. Так, холодовая адаптация вируса применялась при разработке вакцин против таких вирусных инфекций, как полиомиелит, краснуха, натуральная оспа, бешенство, грипп и др. [12–15]. Разработанные в СССР и США живые гриппозные вакцины используются интраназально и выгодно отличаются от инактивированных вакцин тем, что индуцируют не только системный, но и местный мукозальный иммунитет, сочетают перекрестную протективную активность и простоту введения [14–17]. По аналогии с живыми гриппозными вакцинами в Южной Корее и Японии получены аттенуированные са-штаммы SARS-CoV-2, проводятся их исследования в качестве кандидатных вакцинных штаммов [18, 19].

Аtt-фенотип вируса может проявляться in vitro в снижении вирусной репродукции в индикаторной культуре клеток по сравнению с вирулентным штаммом. Традиционный подход к выявлению маркеров аттенуации — определение инфекционного титра вируса [12, 20]. В настоящем исследовании и в ряде аналогичных работ в качестве альтернативного подхода к оценке интенсивности вирусной репродукции применяется определение концентрации вирусной РНК, косвенно отражающей накопление инфекционного вируса [18, 21, 22]. Применение ОТ–ПЦР–РВ, в отличие от титрования, позволяет проводить мониторинг вирусной репродукции с высокой чувствительностью и специфичностью, одновременно снижая длительность и трудоемкость анализа.

При экспериментальном заражении сирийских хомяков (животная модель COVID-19) са-вариантами вируса показано, что att-фенотип свойственен как варианту Dubrovka-са-D2, обладающему ts-фенотипом, так и варианту Dubrovka-са-B4, не имеющему ts-фенотипа.

В то же время все исследованные варианты вируса, длительно пассированные в клетках почки обезьяны Vero (Dubrovka-37, Dubrovka-са-D2 и Dubrovka-са-B4), утеряли способность эффективно размножаться в клетках легких человека Calu-3. Вероятнее всего это связано с генетически опосредованными изменениями конформации S-белка — приспособительной реакцией вируса при культивировании в клетках другого хозяина (африканской зеленой мартышки, Cercopithecus aethiops) вместо клеток человека, и в клетках другой ткани — в почках вместо легких. Первичный анализ геномов Dubrovka-37 (номер GenBank: ON380441.1), Dubrovka-са-В4 (номер GenBank: ON059701.1) и Dubrovka-са-D2 (номер GenBank: ON040961.1) выявил до 20 нуклеотидных замен по сравнению с диким штаммом Dubrovka, большинство из которых приводило к замене аминокислоты. Выявленная смена видовой и/или тканевой специфичности вируса согласуется с тем, что в гене S-белка локализовано наибольшее число значащих нуклеотидных замен у вариантов: Dubrovka-37 — 2, Dubrovka-са-B4 — 6, Dubrovka-са-D2 — 7 аминокислотных замен. Однако достоверно роль выявленных мутаций в проявлении того или иного фенотипа можно определить, только применяя методы сайт-направленного мутагенеза и обратной генетики.

Полученные результаты позволили выявить вероятные фенотипические маркеры аттенуации са-вариантов вируса для сирийских хомяков: (1) способность размножаться при пониженной температуре (са-фенотип); (2) неспособность размножаться при 39 °C (ts-фенотип); (3) изменение видовой и/или тканевой специфичности вируса, проявляющееся в неспособности эффективно размножаться в клетках легких человека Calu-3. Аттенуационный фенотип был получен для сирийских хомяков и требует дальнейшего исследования на других моделях. Разработанные методики оценки in vitro вероятных маркеров аттенуации могут служить дополнительными скрининговыми методами оценки аттенуированности вируса. Однако для доказательства связи выявляемых маркеров с att-фенотипом вируса необходимы дальнейшие исследования.

Заключение

По результатам исследования было установлено, что са-варианты SARS-CoV-2 Dubrovka-са-B4 и Dubrovka-са-D2 обладают att-фенотипом в отношении сирийских хомяков. В условиях in vitro выявлены вероятные маркеры аттенуации са-вариантов SARS-CoV-2 — са-фенотип, ts-фенотип и неспособность эффективно размножаться в клетках легких человека Calu-3. Разработанные методические подходы к выявлению in vitro маркеров аттенуации SARS-CoV-2 представляют ценные инструменты контроля стабильности фенотипа кандидатных вакцинных штаммов.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Исследование выполнено при поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 20-04-60079.

Соблюдение этических норм. Проведение исследования разрешено Этическим комитетом НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова (этическая экспертиза от 24.05.2021, протокол № 2). Все работы с животными проводились в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных (Страсбург, 1986).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, связанного с подготовкой и публикацией статьи.

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Наибольший вклад распределен следующим образом: А.В. Грачева, Е.Р. Корчевая, Е.Б. Файзулоев — подготовка первоначального варианта рукописи, визуализация; А.В. Грачева, Е.Р. Корчевая, Д.И. Смирнова, Р.В. Самойликов, А.А. Поромов — проведение исследования и анализ данных; А.А. Панкратов, Г.В. Трунова, В.А. Хохлова — гистологическое исследование; И.А. Ленева, О.А. Свитич, В.В. Зверев, Ф.Г. Нагиева — администрирование проекта.

Additional information

Funding sources. The study was performed with the financial support of the Russian Foundation for Basic Research, No. 20-04-60079.

Compliance with ethical standards. This study was approved by the Medical Ethics Review Committee of the I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera (Ethics Committee Decision No. 2 dated May 24, 2021). All work with animals was carried out in accordance with European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposes (Strasbourg, 1986).

Competing interests. The authors declare the absence of obvious and potential conflicts of interest related to the publication of this article.

Authors̕ contribution. All authors made a significant contribution to the development of the concept and preparation of the article, read and approved the final version before publication. The largest contribution is distributed as follows: A.V. Gracheva, E.R. Korchevaya, E.B. Faizuloev — preparation of the initial version of the manuscript, visualization; A.V. Gracheva, E.R. Korchevaya, D.I. Smirnova, R.V. Samoilikov, A.A. Poromov — conducting research and data analysis; A.A. Pankratov, G.V. Trunova, V.A. Khokhlova — histological examination; I.A. Leneva, O.A. Svitich, V.V. Zverev, F.G. Nagieva, E.B. Faizuloev — project administration.

×

About the authors

Anastasiia V. Gracheva

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Author for correspondence.
Email: anastasiia.gracheva.95@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8428-4482

Junior Research Associate, Laboratory of Molecular Virology, Department of Virology

Russian Federation, Moscow

Ekaterina R. Korchevaya

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: c.korchevaya@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-6417-3301
Scopus Author ID: 57225930677

Junior Research Associate, Laboratory of Molecular Virology, Department of Virology

Russian Federation, Moscow

Roman V. Samoilikov

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: roma_sam78@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6405-1390

Junior Research Associate, Laboratory of Molecular Immunology, Department of Virology

Russian Federation, Moscow

Daria I. Smirnova

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: daria.sm.1995@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7325-0834

Junior Research Associate, Laboratory of Molecular Virology, Department of Virology

Russian Federation, Moscow

Irina А. Leneva

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: wnyfd385@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7755-2714

Dr. Sci. (Biol.), Head of Experimental Virology Laboratory, Department of Virology

Russian Federation, Moscow

Artem A. Poromov

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: poromov@instmech.ru
ORCID iD: 0000-0002-2004-3935
Scopus Author ID: 56636881200

Senior Research Associate of Experimental Virology Laboratory, Department of Virology

Russian Federation, Moscow

Andrey А. Pankratov

National Medical Research Radiological Center

Email: andreimnioi@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7291-9743
Scopus Author ID: 7006145091

Cand. Sci. (Biol.), Head of Microsurgical Department, Hertzen Moscow Oncological Institute

Russian Federation, Moscow

Galina V. Trunova

National Medical Research Radiological Center

Email: gtrunovamnioi@mail.ru

Cand. Sci. (Biol.), Senior Research Associate, Department of Experimental Pharmacology and Toxicology, Hertzen Moscow Oncological Institute

Russian Federation, Moscow

Varvara А. Khokhlova

National Medical Research Radiological Center

Email: nostocus@yandex.ru

Junior Research Associate, Department of Experimental Pharmacology and Toxicology, Hertzen Moscow Oncological Institute

Russian Federation, Moscow

Firaya G. Nagieva

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fgn42@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8204-4899
Scopus Author ID: 6701793390

MD, Dr. Sci. (Med.), Assistant Professor, Head of the Laboratory of Hybrid Cell Cultures, Department of Virology

Russian Federation, Moscow

Oksana А. Svitich

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: svitichoa@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1757-8389

MD, Dr. Sci. (Med.), Professor, Corresponding Member of RAS, Head of Molecular Immunology Laboratory, Director

Russian Federation, Moscow

Vitaly V. Zverev

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: vitalyzverev@outlook.com
ORCID iD: 0000-0001-5808-2246

Dr. Sci. (Biol.), Professor, Academician of the RAS, Scientific Director

Russian Federation, Moscow

Evgeny В. Faizuloev

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera; Russian Medical Academy of Continuous Professional Education

Email: faizuloev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7385-5083
Scopus Author ID: 23472535800

Cand. Sci. (Biol.), Head of Molecular Virology Laboratory, Department of Virology

Russian Federation, Moscow; Moscow

References

  1. Gómez-Carballa A, Pardo-Seco J, Bello X, et al. Superspreading in the emergence of COVID-19 variants. Trends Genet. 2021;37(12):1069–1080. doi: 10.1016/j.tig.2021.09.003
  2. Nikonova AA, Faizuloev EB, Gracheva AV, et al. Genetic diversity and evolution of the biological features of the pandemic SARS-CoV-2. Acta Naturae. 2021;13(3):77–88. doi: 10.32607/actanaturae.11337
  3. Choi JY, Smith DM. SARS-CoV-2 variants of concern. Yonsei Med J. 2021;62(11):961–968. doi: 10.3349/ymj.2021.62.11.961
  4. Dupont L, Snell LB, Graham C, et al. Neutralizing antibody activity in convalescent sera from infection in humans with SARS-CoV-2 and variants of concern. Nat Microbiol. 2021;6(11):1433–1442. doi: 10.1038/s41564-021-00974-0
  5. Tao K, Tzou PL, Nouhin J, et al. The biological and clinical significance of emerging SARS-CoV-2 variants. Nat Rev Genet. 2021;22(12):757–773. doi: 10.1038/s41576-021-00408-x
  6. Saito A, Irie T, Suzuki R, et al. Enhanced fusogenicity and pathogenicity of SARS-CoV-2 Delta P681R mutation. Nature. 2022;602(7896):300–306. doi: 10.1038/s41586-021-04266-9
  7. Bowen JE, Sprouse KR, Walls AC, et al. Omicron BA.1 and BA.2 neutralizing activity elicited by a comprehensive panel of human vaccines. bioRxiv. 2022. doi: 10.1101/2022.03.15.484542
  8. Fajzuloev EB, Gracheva AV, Korchevaja ER, et al. Poluchenie i harakteristika holodoadaptirovannogo shtamma koronavirusa SARS-CoV-2. In: Modern immunoprophylaxis: challenges, opportunities, prospects: Abstracts of the All-Russian scientific and practical conference with international participation (October 7–8, 2021). Moscow; 2021. P. 79. (In Russ.)
  9. Gracheva AV, Korchevaya ER, Kudryashova AM, et al. Adaptation of the MTT assay for detection of neutralizing antibodies against the SARS-CoV-2 virus. Journal of microbiology, epidemiology and immunobiology. 2021;98(3)253–265. (In Russ.). doi: 10.36233/0372-9311-136
  10. Ramakrishnan MA. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World J Virol. 2016;5(2):85–86. doi: 10.5501/wjv.v5.i2.85
  11. Chan JF, Yip CC, To KK, et al. Improved molecular diagnosis of COVID-19 by the novel, highly sensitive and specific COVID-19-RdRp/Hel real-time reverse transcription-PCR assay validated in vitro and with clinical specimens. J Clin Microbiol. 2020;58(5):e00310–20. doi: 10.1128/JCM.00310-20
  12. Maassab HF, DeBorde DC. Development and characterization of cold-adapted viruses for use as live virus vaccines. Vaccine. 1985;3(5):355–369. doi: 10.1016/0264-410x(85)90124-0
  13. Alexandrova GI, Smorodinstev AA. Obtaining of an additionally attenuated vaccinating cryophil influenza strain. Revue Roumaine d’Inframicrobiologie. 1965;2(3):179–186.
  14. Ghendon YZ, Polezhaev FI, Lisovskaya KV, et al. 1984. Recombinant cold-adapted attenuated influenza A vaccines for use in children: molecular genetic analysis of the cold-adapted donor and recombinants. Infect Immun. 1984;44(3):730–733. doi: 10.1128/IAI.44.3.730-733.1984
  15. Maassab HF. Adaptation and growth characteristics of influenza virus at 25 degrees c. Nature. 1967;213(5076):612–614. doi: 10.1038/213612a0
  16. Rudenko LG, Slepushkin AN, Monto AS, et al. Efficacy of live attenuated and inactivated influenza vaccines in schoolchildren and their unvaccinated contacts in Novgorod, Russia. J Infect Dis. 1993;168(4):881–887. doi: 10.1093/infdis/168.4.881
  17. Lu X, Edwards LE, Desheva JA, et al. Cross-protective immunity in mice induced by live-attenuated or inactivated vaccines against highly pathogenic influenza A (H5N1) viruses. Vaccine. 2006;24(44–46):6588–6593. doi: 10.1016/j.vaccine.2006.05.039
  18. Seo SH, Jang Y. Cold-adapted live attenuated SARS-Cov-2 vaccine completely protects human ACE2 transgenic mice from SARS-Cov-2 infection. Vaccines (Basel). 2020;8(4):584. doi: 10.3390/vaccines8040584
  19. Okamura S, Ebina H. Could live attenuated vaccines better control COVID-19? Vaccine. 2021;39(39):5719–5726. doi: 10.1016/j.vaccine.2021.08.018
  20. Tsfasman TM, Markushin SG, Akopova II, Ghendon YZ. Molecular mechanisms of reversion to the ts+ (non-temperature-sensitive) phenotype of influenza A cold-adapted (ca) virus strains. J Gen Virol. 2007;88(Pt 10):2724–2729. doi: 10.1099/vir.0.83014-0
  21. Ammour Y, Faizuloev E, Borisova T, et al. Quantification of measles, mumps and rubella viruses using real-time quantitative TaqMan-based RT-PCR assay. J Virol Methods. 2013;187(1):57–64. doi: 10.1016/j.jviromet.2012.09.011
  22. Landgraf G, Desheva YA, Rudenko LG. Evaluation of influenza A and B cold-adapted reassortant virus reproduction in trivalent live influenza vaccines. Virus Res. 2021;300:198396. doi: 10.1016/j.virusres.2021.198396

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. Weight of hamsters infected intranasally with SARS-CoV-2 variants. K — uninfected hamsters. Mean ± SD. Post Hoc Tukey HSD: ** p < 0,001, * p < 0,01, compared with a group infected with the Dubrovka variant

Download (149KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. Virus distribution in the lungs and brain of hamsters, 4th day after challenge: a — the viral RNA concentration; b — virus titer. D — Dubrovka strain; ca-B4 — Dubrovka-ca-B4 variant; ca-D2 — Dubrovka-ca-D2 variant; K — uninfected hamsters; n/d — not detected. Median ± interquantile range (n = 4). Post-hoc Dunn’s test with Holm-Bonferroni correction: * p < 0.01, ** p < 0.05, *** p > 0.05

Download (176KB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. Reproduction rate of SARS-CoV-2 variants in Vero cells on day 3 p.i. (39 °C, MOI 0.001): a — the concentration of viral RNA; b —virus titer. D — Dubrovka strain; ca-B4 — Dubrovka-ca-B4 variant; ca-D2 — Dubrovka-ca-D2 variant; K — uninfected hamsters; n/d — not detected. Data from two independent experiments; threshold value of detection methods: Titration — 1.0 lg TCID50/ml, real-time RT-PCR — 3.0 lg RNA copies/ml

Download (148KB)
Indexing metadata
5. Fig. 4. The concentration of viral RNA in Calu-3 and Vero cells infected with SARS-CoV-2 variants on day 3 of p. i. (MOI 0.001). D — Dubrovka strain (2nd passage); ca-B4 — Dubrovka-ca-B4 variant; ca-D2 — Dubrovka-ca-D2 variant; D-37 — Dubrovka-37 variant. Data from two independent experiments; the threshold value for the real-time RT-PCR is 3.0 lg RNA copies/ml

Download (107KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2022 Eco-Vector


СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 74760 от 29.12.2018 г.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies