The effect methylglyoxal on acute lung injury induced by influenza A(H1N1)PDM09 in mice

Full Text

Введение

Известно, что в период эпидемий и пандемий число больных с тяжелыми осложнениями гриппа, нередко несовместимыми с жизнью, резко возрастает, несмотря на широкое применение противовирусных препаратов и сопутствующую патогенетическую и симптоматическую терапию [1, 2]. Одним из тяжелых осложнений гриппозной инфекции является острое повреждение легких (ОПЛ). Независимо от этиологии основной причиной, приводящей к развитию ОПЛ у 55 % пациентов, служит прямое воздействие цитопатогенного фактора на эндотелий легочных капилляров и альвеолярный эпителий [3–5]. При гриппозной инфекции в основе патогенеза ОПЛ в первую очередь лежит повреждение эпителия альвеолярной мембраны [6]. Наряду с непосредственным цитопатогенным эффектом вируса гриппа на альвеолоциты значительную роль в развитии дополнительного повреждения легочной паренхимы играет воспаление, одним из индукторов которого являются конечные продукты гликирования (КПГ) [7, 8]. Основной внутриклеточный предшественник КПГ — метилглиоксаль — образуется в результате неферментативного гидролиза конечных продуктов гликолиза, а также перекисного окисления липидов [9]. На настоящий момент повреждающая роль КПГ наиболее хорошо изучена в патогенезе осложнений такого социально значимого заболевания, как сахарный диабет [10–13]. В то же время их вклад в развитие ОПЛ при вирусной инфекции выяснен не в полной мере. В связи с вышеизложенным целью данной работы являлось изучение влияния метилглиоксаля на течение ОПЛ у мышей при экспериментальном заражении вирусом гриппа A/H1N1/pdm09.

Материалы и методы

Эксперименты выполнены на восьминедельных беспородных мышах-самках (n = 110), полученных из ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово» РАН (пос. Рапполово, Ленинградская область). Все манипуляции осуществляли в соответствии с директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях (Rus-LASA, 2012).

С целью моделирования вирусной инфекции использовали штамм вируса гриппа A(H1N1)pdm09, полученный из рабочей коллекции ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России. LD₅₀ штамм вируса гриппа определяли по методике Рида – Менча на 20 мышах-самках [14]. Расчетная величина LD₅₀ вируса гриппа составила 10^–3,4 в десятикратном разведении. Вирусная природа ОПЛ была подтверждена с помощью постановки реакции гемагглютинации. Легкие инфицированных животных гомогенизировали в физиологическом растворе. Гомогенат центрифугировали, отбирали супернатант, который вводили в аллантоисную полость куриных эмбрионов и инкубировали при 36 °C в течение 48 часов. Перед забором аллантоисной жидкости яйца охлаждали при температуре +4 °C в течение 3–4 часов. К забранному биоматериалу добавляли эквивалентный объем 1 % взвеси эритроцитов в физиологическом растворе. Присутствие вирусных частиц в материале было подтверждено образованием характерного зонтика [15].

В экспериментах по изучению влияния метилглиоксаля на течение ОПЛ животные были разделены на три группы: 1-я группа — интактные животные (n = 10); 2-я группа — инфицированные мыши, получавшие плацебо (n = 40); 3-я группа — инфицированные мыши, получавшие метилглиоксаль (n = 40). Вируссодержащий материал вводили интраназально в дозе, равной 0,75 расчетной величины LD₅₀, или 10^–3,5 в десятикратном разведении. Метилглиоксаль (Sigma-Aldrich, США) вводили в дозе 50 мг/кг/сут подкожно (п/к) в течение двух недель до инфицирования [16].

Забор крови для гематологического исследования осуществляли в эппендорфы с ЭДТА и анализировали по следующим параметрам: количество лейкоцитов, лейкоцитарная формула. Количество лейкоцитов определяли на автоматическом гематологическом анализаторе Abacus Junior Vet, лейкоцитарную формулу — в окрашенном по Романовскому – Гимзе мазке крови при микроскопировании. Макроскопическое и гистологическое исследование проводили на 4, 7 и 14-е сутки либо после смерти животного в ходе эксперимента. Ход гистологического исследования: подготовка фиксирующих жидкостей, отбор материала во время вскрытия, фиксация материала, вырезание кусочков фиксированного материала, уплотнение обезвоживанием кусочков и заливка в парафин, резка блоков на санном микротоме, окраска парафиновых срезов (гематоксилином и эозином), просмотр гистологических препаратов, описание препаратов, микрофотосъемка, изготовление отпечатков.

Степень поражения легочной ткани оценивали согласно методике, предложенной American Thoracic Society [17] и заключающейся в подсчете баллов согласно табл. 1 в 20 полях при увеличении ×400. Степень поражения оценивали по формуле

$Степень поражения=\frac{(20·A)+(14·B)+(7·C)+(7·D)+(2·E)}{кол-во просмотренных полей·100}$

при этом учитывали параметры (A, B, C, D, E), указанные в табл. 1.

 

Таблица 1 / Table 1

Оценка значимости гистологических показателей поражения легких в баллах

Lung injury scoring system by histological parameters

Параметры	Количество баллов на одно поле
	0	1	2
A. Нейтрофилы в альвеолах	–	1–5	>5
B. Нейтрофилы в интерстиции	–	1–5	>5
C. Гиалиновые мембраны	–	1	>1
D. Наличие белкового дебриса в воздушном пространстве	–	1	>1
E. Утолщение альвеолярной перегородки	< ×2	×2–4	> ×4

Примечание: × – кратность утолщения.

 

Оценку статистической значимости различий проводили при помощи программы Graphpad Prism 7. Для регистрируемых количественных переменных рассчитывали параметры описательной статистики, характеризующие данные по каждой группе. Параметры описательной статистики включали: среднее значение параметра в группе (Mean), стандартное отклонение средней (Std. Dev), стандартная ошибка (Std. Err, ± m), 25-й и 75-й процентили. Отличия между выборками оценивали с помощью непараметрических критериев Краскела – Уоллиса и Манна – Уитни. Данные в таблицах представлены в виде среднего (M) и его ошибки (± m). Для попарного сравнения выживаемости применяли лог-ранговый тест с учетом поправки Бонферрони. Динамика выживаемости представлена в виде кривых Мантела – Кокса. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

На 40 животных из 2-й и 3-й групп (по 20 особей в группе) была изучена клиническая картина течения патологии и динамика летальности в течение всего периода наблюдения. Полученные данные представлены на рис. 1.

 

Рис. 1. Процент выживания животных в течение опыта. 1-я группа — интактные мыши; 2-я группа — инфицированные мыши, получавшие NaCl 0,9 %; 3-я группа — инфицированные мыши, получавшие метилглиоксаль, * р > 0,05 в сравнении с интактными животными, ^# р > 0,05 в сравнении c инфицированными мышами, получавшими NaCl 0,9 %

Fig. 1. Percent survival during experiment. 1^st group — intact mice, 2^nd group — infected mice treated with NaCl 0.9%, 3^rdgroup — infected mice treated with methylglyoxal. * р > 0,05 compared to intact mice, ^# р > 0,05 compared to infected mice treated with NaCl 0.9%

 

Гибель животных, получавших метилглиоксаль (3-я группа), наступала в период с 7-го по 12-й день с момента инфицирования, в группе сравнения — с 8-го по 11-й день соответственно. Общая летальность в течение периода наблюдения у животных из 3-й группы составила 70 %, что значимо превышало значение данного показателя по сравнению с животными из 2-й группы — 35 % (p < 0,05). Клиническая картина, предшествующая гибели животных, характеризовалась снижением двигательной активности и мышечного тонуса, отсутствием реакции на внешние раздражители, неопрятностью шерстного покрова, прогрессирующим падением массы тела, снижением температуры в среднем на три градуса и увеличением глубины экскурсии грудной клетки.

Патоморфологическое исследование погибших животных из обеих опытных групп показало наличие кровоизлияния в обоих легких, достигающее 90–100 % от всей площади органа. Гистологическое исследование выявило наличие генерализованного альвеолярного отека и десквамации эпителиальной ткани. Наблюдались субтотальные и тотальные кровоизлияния в альвеолах и бронхах, большое количество гиалиновых мембран и инфильтратов в стенках альвеол. Данные изменения были отмечены как в верхних, так и в нижних отделах легких.

В параллельном эксперименте, на оставшихся 20 животных из каждой опытной группы, было проведено морфологическое и гистологическое исследование легких, а также проанализированы гематологические показатели. На 4-е и 7-е сутки после инфицирования по четыре особи из 2-й и 3-й групп подвергали плановой эвтаназии и производили забор биологического материала. Отбор животных при этом основывался на клинической картине, предшествующей гибели и описанной выше. На 14-е сутки были забраны легкие мышей из 1-й группы (интактные животные) и выживших животных из 2-й и 3-й групп.

На 4-е сутки эксперимента у мышей из обеих опытных групп (2-я и 3-я) площадь поражения легочной паренхимы составила 35,00 ± 5,27 и 76,75 ± 8,04 % (р < 0,05 по отношению ко 2-й группе) общей площади легких соответственно. Гистологическое исследование легких животных из 2-й группы выявило повреждение альвеолоцитов и эпителия бронхов, сопровождавшееся десквамацией клеток, оголением базальной мембраны и инициацией процесса образования гиалиновых мембран. В просвете альвеол отмечались скопления альвеолярных макрофагов. Наблюдались очаги альвеолярного отека, локальные кровоизлияния в альвеолы и мелкие очаги ателектазов. У животных из 3-й группы гистологические изменения ткани легких характеризовались наличием выраженной смешанно-клеточной воспалительной инфильтрации с формированием микроскопической картины острой бронхопневмонии. В целом гистологическая картина ОПЛ у инфицированных животных из обеих опытных групп носила однонаправленный характер. Однако степень выраженности изменений в группе животных, получавших метилглиоксаль, была значимо выше, чем у животных из группы сравнения, что определялось количеством клеточных инфильтратов в альвеолах и их стенках, а также степенью отечных проявлений. Так, суммарная полуколичественная оценка поражения легких у инфицированных мышей, получавших плацебо и метилглиоксаль, составила 0,43 ± 0,01 и 0,57 ± 0,02 балла (р < 0,05 по отношению к группе сравнения) соответственно, а общее значение показателей, характеризующих собственно воспалительный процесс (содержание нейтрофилов и толщина альвеолярных стенок), — 0,32 ± 0,01 и 0,42 ± 0,01 балла (р < 0,05 по отношению к группе сравнения).

На 7-е сутки после инфицирования площадь поражения легочной паренхимы у животных из 2-й и 3-й групп составила 75,00 ± 5,00 и 87,50 ± 5,00 % соответственно. Гистологическое исследование легких животных из 2-й группы показало присутствие гиалиновых мембран и увеличение толщины межальвеолярных перегородок. Наблюдались кровоизлияния в альвеолах, ателектазы, клеточные инфильтраты в периваскулярных пространствах и «опеченение» легкого (формирование геморрагической пневмонии). Одновременно с проявлениями, характерными для воспалительного процесса, отмечались признаки очаговой пролиферации соединительнотканных клеток с тенденцией к замещению легочной паренхимы фиброзной тканью. В свою очередь, у животных, получавших метилглиоксаль, изменения легочной паренхимы носили более выраженный характер, в частности, за счет показателей толщины альвеолярных стенок, количества гиалиновых мембран, отеков в альвеолах и бронхах, ателектазов и клеточных инфильтратов в альвеолах и альвеолярной стенке, признаков циркуляторных нарушений, очагов геморрагической пневмонии и фибротизации. Суммарная полуколичественная оценка поражения легких составила 0,66 ± 0,02 и 0,75 ± 0,01 балла (р < 0,05 по отношению к группе сравнения) у животных из 2-й и 3-й групп соответственно, а общее значение показателей, характеризующих собственно воспалительный процесс, — 0,51 ± 0,02 и 0,59 ± 0,01 балла (2-я и 3-я группы соответственно).

Таким образом, в результате сравнительной гистологической оценки повреждения легких в динамике (4-е и 7-е сутки после инфицирования) у животных из обеих опытных групп был установлен прогредиентный характер течения смоделированной патологии. Анатомические повреждения легких и уровень летальности при этом у животных, получавших метилглиоксаль, значимо превышали таковые у животных из группы сравнения.

Результаты патоморфологического и гистологического исследования (выжившие животные из обеих опытных групп, подвергнутые плановой эвтаназии), проведенного на 14-е сутки после инфицирования, свидетельствовали о наличии выраженной тенденции к замещению легочной паренхимы фиброзной тканью. Легкие приобрели серый оттенок, а их структура стала плотной и менее эластичной. Наряду с этим имело место снижение количества кровоизлияний в альвеолах и бронхах, гиалиновых мембран и нейтрофилов в альвеолах и альвеолярной стенке. Достоверных различий в уровне повреждения легких в исследуемых группах не было.

Полученные при гистологическом исследовании данные представлены на рис. 2.

 

Рис. 2. Паренхима легких опытных мышей. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение ×40 и ×400. a — интактные мыши; b — 2-я группа на 4-е сутки; c — 3-я группа на 4-е сутки; d — 2-я группа на 7-е сутки; e — 3-я группа на 7-е сутки; f — 2-я группа на 14-е сутки; g — 3-я группа на 14-е сутки

Fig. 2. Lung parenchyma of mice. Hematoxylin and eosin staining, magnification ×40 and ×400. a — intact mice; b — 2^nd group on 4^th day; c — 3^rd group on 4^th day; d — 2^nd group on 7^th day; e — 3^rd group on 7^th day; f — 2^nd group on 14^th day; g — 3^rd group on 14^th day

 

Анализ гематологических показателей (табл. 2) продемонстрировал, что у животных из обеих опытных групп значимо (р < 0,05 по отношению к интактным животным) изменился индекс нормального соотношения «нейтрофилы/лимфоциты»: 0,21 ± 0,02 у интактных животных, 0,61 ± 0,07 и 0,69 ± 0,11 на 4-е сутки и 0,54 ± 0,09 и 0,55 ± 0,04 на 7-е сутки эксперимента (2-я и 3-я группы соответственно). Так как значимых межгрупповых различий по данному показателю выявлено не было, то изменение данного индекса, обусловленное нейтрофилезом и лимфопенией, в первую очередь служит маркером собственно гриппозной инфекции. Аналогичные данные были получены M. Preusse et al. [18] при инфицировании мышей вирусами гриппа штаммов A/PuertoRico/8/1934 (H1N1). Снижение же содержания свободно циркулирующих лейкоцитов (значимо на 7-е сутки у животных из группы, получавшей метилглиоксаль) на фоне описанных микроскопических изменений в легких, скорее всего, было обусловлено их миграцией из периферической крови в очаг воспаления.

 

Таблица 2 / Table 2

Гематологические показатели животных в течение эксперимента

Animal hematological parameters during experiment

Показатели	Экспериментальные группы (n = 4) и сроки исследования
	1-я группа	4-е сутки		7-е сутки		14-е сутки
		2-я группа	3-я группа	2-я группа	3-я группа	2-я группа	3-я группа
Лейкоциты, 109/л	8,05 ± 0,31	9,29 ± 0,56	8,95 ± 0,76	6,16 ± 0,60	5,12 ± 0,59*	7,22 ± 0,74	9,00 ± 0,70
Сегментоядерные нейтрофилы, %	16,25 ± 1,13	31,25 ± 1,38*	33,00 ± 2,50*	28,00 ± 2,50*	30,25 ± 2,38*	26,25 ± 1,69*	27,00 ± 1,50*
Палочкоядерные нейтрофилы, %	0,25 ± 0,19	2,75 ± 0,63	3,50 ± 1,00	3,75 ± 1,13	2,50 ± 0,75	1,00 ± 0,50	1,25 ± 0,69
Эозинофилы, %	1,75 ± 0,63	5,50 ± 1,00	5,25 ± 0,63	4,25 ± 1,19	3,25 ± 0,88	4,25 ± 1,19	3,00 ± 0,75
Базофилы, %	0,50 ± 0,25	0,25 ± 0,19	–	0,25 ± 0,19	0,25 ± 0,19	–	0,25 ± 0,19
Лимфоциты, %	79,00 ± 1,75	57,25 ± 3,13*	55,00 ± 3,00*	60,75 ± 2,38*	60,75 ± 2,38*	66,60 ± 1,75	65,75 ± 3,44
Моноциты, %	2,25 ± 0,19	3,00 ± 0,25	3,25 ± 0,19	3,00 ± 0,75	3,00 ± 0,75	2,50 ± 0,50	3,00 ± 1,00

Примечание. * р > 0,05 в сравнении с интактными животными.

 

На 14-е сутки после инфицирования индекс соотношения «нейтрофилы/лимфоциты» составил 0,42 ± 0,03 и 0,43 ± 0,06 во 2-й и в 3-й группах соответственно, а значимых отличий в показателе содержания лейкоцитов и лимфоцитов у опытных животных по сравнению с интактными особями не было. В то же время относительное содержание нейтрофилов продолжало оставаться повышенным.

Заключение

Оценка влияния внутриклеточного предшественника КПГ метилглиоксаля на течение ОПЛ позволила установить, что он усугубляет структурные нарушения в легочной ткани у мышей, инфицированных вирусом гриппа A/H1N1/pdm09, и повышает летальность опытных животных по сравнению с животными из контрольной группы. С учетом ранее полученных данных о роли предшественников КПГ в формировании провоспалительного ответа при различных патологических состояниях [19, 20], скорее всего, выявленное негативное действие метилглиоксаля в условиях данного эксперимента может быть связано с усилением гликолиза в очаге воспаления (легочная ткань). Выявленное в ходе исследования изменение индекса нормального соотношения «нейтрофилы/лимфоциты» свидетельствовало о наличии гриппозной инфекции и не было напрямую связано с действием предшественника КПГ.

Полученные данные могут являться основанием для изучения эффективности фармакологических зондов, способствующих инактивации процесса накопления предшественников КПГ, с целью повышения эффективности лечения тяжелой гриппозной инфекции.

Список сокращений

КПГ — конечные продукты гликирования; ОПЛ — острое повреждение легких; ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота; LD₅₀ — средняя смертельная (летальная) доза.

About the authors

Andrei G. Aleksandrov

Smorodintsev Research Institute of Influenza

Author for correspondence.
Email: forphchemistry@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9212-3865

a graduate student in the Laboratory of Drug Safety

Russian Federation, Saint Petersburg

Tatiana N. Savateeva-Lyubimova

Smorodintsev Research Institute of Influenza

Email: drugs_safety@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4516-3308

Professor, MD, PhD in Medicine, Leading Researcher in the Laboratory of Drug Safety

Russian Federation, Saint Petersburg

Arman A. Muzhikyan

Smorodintsev Research Institute of Influenza

Email: vetdiagnostics.spb@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-7093-0014

PhD in Veterinary Sciences, Leading Researcher in the Laboratory of Drug Safety

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files