Influence of PLL treatment on the long-term memory formation in Helix mollusk

Full Text

В последние годы в понимании механизмов пластичности мозга осуществлен значительный прорыв. Описан ряд уникальных эпигенетических механизмов, к которым относится регуляция экспрессии генов через модификацию хроматина, а также РНК-интерференция, в том числе через микроРНК. Все эти процессы интенсивно изучают в связи с механизмами формирования долговременной памяти (ДП) и применением полученных знаний для развития работ по коррекции когнитивных нарушений [1–3]. микроРНК — это некодирующие РНК, подавляющие экспрессию генов на посттранскрипционном уровне. Они вовлечены в регуляцию множества процессов, в том числе в механизмы пластичности [2–5]. Количество микроРНК составляет десятки тысяч, из которых около 70 % экспрессируется в мозге. В связи с многообразием мишеней микроРНК и сложностью устройства центральной нервной системы их функции изучены еще очень фрагментарно.

Биогенез микроРНК является сложным и многоступенчатым процессом, включающим транскрипцию при-микроРНК, процессинг при-микроРНК, процессинг пре-микроРНК, загрузку микроРНК в RISC-комплекс (РНК-индуцируемый комплекс — от англ. RNA-induced silencing complex) и его сборку. В конечном счете в RISC-комплексе происходит узнавание матричной РНК-мишени и снижение ее количества путем депонирования или разрушения [4]. Все вышеперечисленные стадии контролирует целый спектр белков. Один из них — эндонуклеаза Dicer, которая является высококонсервативным ферментом. Dicer регулирует расщепление пре-микроРНК с образованием зрелой микроРНК и ее ассоциацию с комплексом RISC. Соответственно блокада Dicer нарушает созревания микроРНК и влияет на экспрессию генов-мишеней [2, 4, 6]. В ряде работ на животных с генетической модификацией биогенеза малых РНК показано, что дисфункция гена Dicer вызывает уменьшение количества микроРНК в коре и гиппокампе мыши и нейроморфологические дефекты и влияет на формирование ДП [7–9]. Другим подходом для изучения связи экспрессии микроРНК с формированием ДП может быть применение ингибиторов Dicer. Так, Watashi et al. [6] провели широкомасштабные исследования механизмов действия поли-L-лизина гидробромида (PLL) на биогенез микроРНК. Они установили, что это вещество снижает экспрессию микроРНК путем подавления активности Dicer через нарушение ассоциации Dicer с пре-микроРНК.

Важную роль в изучении механизмов пластичности играют животные, обладающие относительно просто устроенной центральной нервной системой, в частности моллюски [5, 10]. Для исследования молекулярных механизмов памяти в течение многих лет в качестве модели обучения мы используем выработку условного рефлекса пищевой аверcии у моллюска Helix. Этот рефлекс хорошо изучен на поведенческом, клеточном и молекулярном уровнях [11–13]. Нами было показано, что при формировании пищевой аверсии у Helix, как и у позвоночных животных, значительно изменяются эпигенетические модификации гистонов, в регуляцию которых вовлекаются как активаторные, так и тормозные пути, причем как их избыточная активация, так и ингибирование могут нарушать формирование ДП [14–16]. Как отмечалось выше, еще одним уникальным эпигенетическим механизмом регуляции экспрессии генов является ингибирование трансляции матричной РНК посредством микроРНК. Таким образом, изучение роли микроРНК в консолидации рефлекса пищевой аверсии представляет несомненный интерес.

Целью исследования являлось изучение вовлечения микроРНК в формирование долговременной памяти на модели выработки условного рефлекса пищевой аверсии у моллюска Helix. В качестве подхода использовали нарушение образования зрелых микроРНК через введение PLL — ингибитора активности Dicer.

Методы и подходы

С целью изучения вовлечения микроРНК в формирование ДП у моллюска Helix мы осуществили блокаду образования зрелых микроРНК путем ингибирования активности Dicer [4] через введение PLL М 4–15 кДа (Sigma-Aldrich). PLL инъецировали животным в концентрации 30 мкг на грамм веса в объеме 10 мкл спустя 1, 3 или 5 ч после тренировок или в процессе обучения. Инъекции производили в цефалопедальный синус через нечувствительную область тела улитки. Остальным животным вводили солевой раствор для моллюсков (80 мМ NaCl; 4 мМ KCl; 7 мМ CaCl₂; 5 мМ MgCl₂; 5 мМ Tris–HCl; pH 7,8) [14], который применяли для растворения PLL. Модель обучения заключалась в выработке у Helix условного рефлекса пищевой аверсии. Эту модель в течение многих лет применяют в нескольких лабораториях, в том числе в нашей, поэтому она хорошо отработана [11–13]. Перед экспериментами животных 3 сут содержали без корма. Условным стимулом являлся кусочек банана, безусловным — удар электрическим током (6 мА, 0,5 с). Нижним электродом служила металлическая поверхность, по которой улитка свободно ползала. Пищу располагали на расстоянии 1 см от головы животного. После того как животное достигало пищи и начинало ее поедать, в область головы наносили удар электрическим током через второй электрод. Предъявляли пищу в сочетании с воздействием электрического тока каждые 15–20 мин. Животные получали 6–8 сочетанных воздействий. Критерием обученности являлось избегание животным пищи. Тестирование успешности обучения проводили спустя 72 ч после последней тренировки, предъявляя условный стимул — банан. При тестировании измеряли латентный период консуматорной реакции (время, которое улитка затрачивала на приближение к пище). Если животное не приближалось к пище и не начинало ее есть в течение 120 с, тест прекращали. Как правило, эти животные активно избегали пищу. При статистической обработке латентный период принимали за 120 с. Эксперименты проведены на 57 животных.

Статистическую обработку осуществляли с использованием анализа ANOVA. Различия считали статистически значимыми при p ≤ 0,05. Результаты представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего.

Результаты исследований

Наблюдали значительное ухудшение ДП (тестирование через 72 ч) у животных, которым PLL вводили спустя 1 и 3 ч после окончания процедуры обучения, по сравнению с тренированными животными, которым вместо PLL вводили растворитель (см. рисунок). Латентный период консуматорной реакции у обученных улиток без введения PLL составлял 116 ± 3 с, а с введением PLL спустя 1 ч после окончания тренировок снижался до 68 ± 10 с (р < 0,0001). У животных, которым PLL вводили через 3 ч после обучения, латентный период консуматорной реакции составлял 67 ± 10 с и достоверно отличался от латентного периода у обученных животных, которым PLL не вводили (р < 0,0002).

Влияние поли-L-лизина, ингибитора Dicer, на формирование пищевой аверсии у моллюсков Helix. По оси ординат — латентный период консуматорной реакции животных до и после процедуры обучения. К (контроль) — животные до обучения (n = 57); О — обученные животные, которым поли-L-лизин не вводили (n = 20); ОPL1, ОPL3, ОPL5 — животные, которым поли-L-лизин вводили спустя 1 (n = 15), 3 (n = 7) и 5 (n = 8) ч после обучения соответственно. ОPL0 — животные, которым вводили поли-L-лизин в середине процедуры обучения (n = 7). Достоверное отличие от контроля — * р < 0,0003. Достоверное отличие от обученных животных, которым поли-L-лизин не вводили, — ^# р < 0,0002; ^## р < 0,0001. Unequal N HSD test. F (5,108) = 33,703, р < 0,00001 (ANOVA)

The effect of PLL, a Dicer inhibitor, on the formation of food aversia in Helix. On the ordinate axis — latency periods of consumatory reaction in the Helix before and after training. K — animals before training (n = 57); L — learning animals injected with saline (n = 20); OPLL1 — learning animals injected with PLL 1 h after training (n = 15); OPLL3 — learning animals injected with PLL 3 h after training (n = 7); OPLL5 — learning animals injected with PLL 5 h after training (n = 8); OPLL0 — learning animals injected with PLL during training (n = 7). A significant differences to control * р < 0.0003. A significant difference from trained animals to which PLL was not administered, ^# р < 0.0002; ^## р < 0.0001. Unequal N HSD test. F (5,108) = 33,703, р < 0,00001 (ANOVA). Error bars indicate SEM

Введение PLL во время тренировок или спустя 5 ч влияния на ДП не оказывало. Таким образом, инъекция PLL спустя 1 и 3 ч после процедуры обучения вызывала значительное нарушение формирования условного оборонительного рефлекса пищевой аверсии у Helix.

Обсуждение

Проведенные нами исследования по влиянию ингибирования активности Dicer посредством PLL на формирование условного рефлекса пищевой аверсии показали, что существуют определенные временные интервалы (1–3 ч после окончания обучения), в которые эта блокада приводит к значительному нарушению ДП. Поскольку блокада активности Dicer вызывает нарушение биогенеза микроРНК, можно предположить, что в данный временной интервал происходит экспрессия микроРНК, блокирующих матричную РНК генов-репрессоров, одним из которых может быть ингибиторный транскрипционный фактор CREB2 [10, 17]. С помощью методов секвенирования микроРНК (miRNA-seq) было установлено, что при обучении может происходить как репрессия ряда микроРНК, так и активация, что связано с необходимостью либо активации, либо подавления их генов-мишеней, играющих разную роль в механизмах пластичности [4].

В настоящее время в нескольких работах показано, что нарушение работы Dicer влияет на формирование синаптической пластичности, ДП и других когнитивных процессов [2, 18–20]. Причем как сверхэкспрессия Dicer, так и выключение может приводить к различным функциональным нарушениям. Однако полученные данные весьма противоречивы, так как работы проведены главным образом на животных с генетическими дефектами в гене, кодирующем Dicer, и соответственно с его постоянной репрессией, в том числе и в период развития. Кроме того, применяли различные типы генетических моделей и различные модели обучения [2, 7, 19–21]. Введение PLL позволяет выключать Dicer в определенное время и поэтому более направленно изучать механизмы памяти. В 2018 г. PLL был успешно использован для нарушения формирования условного рефлекса с однократным положительным подкреплением у Lymnaea stagnalis [17]. В данном случае наиболее эффективным было введение PLL спустя 15 мин после обучения.

Через час после обучения в центральной нервной системе Helix мы наблюдали активацию регуляторного каскада MAPK/ERK и MAPK/ERK-зависимые эпигенетические модификации гистонов [12, 14, 22], что может свидетельствовать в пользу скоординированности индукции хроматиновых перестроек, экспрессии микроРНК и важной роли МАРК/ERK в этих процессах. На основе параллельного полногеномного анализа модификаций гистонов и микроРНК в 2015 г. показано наличие согласованных действий микроРНК и модификаций гистонов в регуляции экспрессии генов у человека [23].

С целью дальнейшего изучения функций индивидуальных микроРНК нами совместно с Институтом цитологии и генетики СО РАН впервые осуществлено секвенирование микроРНК из центральной нервной системы Helix c использованием метода miRNA-seq и биоинформатического анализа. Было обнаружено большое количество высококонсервативных микроРНК. Данные представлены в NCBI Sequence Read Archive (SRA) [24].

Высокая консервативность микроРНК позволяет успешно использовать модели обучения на животных, обладающих простыми нервными системами, для изучения функций микроРНК в механизмах пластичности. Важность исследований микроРНК определяется как фундаментальной значимостью, так и возможным прикладным значением. Предполагают, что микроРНК, экспрессия которых нарушена при различных заболеваниях, могут выступать целями для терапии [25].

Выводы

Введение PLL, блокатора биогенеза микроРНК, нарушает формирование ДП у Helix. Таким образом, микроРНК вовлечены в формирование рефлекса пищевой аверcии у Helix. Нарушение экспрессии микроРНК критично для формирования ДП, если происходит в определенные временные интервалы (1–3 ч) после процедуры обучения. PLL может быть рекомендован для исследований в области нейроэпигенетики, а именно для изучения функций микроРНК.

Дополнительная информация

Финансирование. Работа поддержана Программой фундаментальных научных исследований государственных академий на 2013–2020 гг. (ГП-14, раздел 63).

Соблюдение этических норм. Не требуется.

Список сокращений

ДП — долговременная память; РНК — рибонуклеиновая кислота; RISC — РНК-индуцируемый комплекс (от англ. RNA-induced silencing complex); PLL — поли-L-лизин; MAPK/ERK — митоген-активируемая протеинкиназа/внеклеточная сигнально-регулируемая киназа (от англ. mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase).

About the authors

Larisa N. Grinkevich

Author for correspondence.
Email: larisa_gr_spb@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3744-5946
SPIN-code: 4925-6575
Scopus Author ID: 80116

Principal Scientist at the Laboratory for Regulation of the Function of Brain Neurons

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. The effect of PLL, a Dicer inhibitor, on the formation of food aversia in Helix. On the ordinate axis — latency periods of consumatory reaction in the Helix before and after training. K — animals before training (n = 57); L — learning animals injected with saline (n = 20); OPLL1 — learning animals injected with PLL 1 h after training (n = 15); OPLL3 — learning animals injected with PLL 3 h after training (n = 7); OPLL5 — learning animals injected with PLL 5 h after training (n = 8); OPLL0 — learning animals injected with PLL during training (n = 7). A significant differences to control * р < 0.0003. A significant difference from trained animals to which PLL was not administered, # р < 0.0002; ## р < 0.0001. Unequal N HSD test. F (5,108) = 33,703, р < 0,00001 (ANOVA). Error bars indicate SEM

Download (128KB)

Indexing metadata