NeuN-immunopositive cells in subfornical organ of spontaneously hypertensive rats

Full Text

Список сокращений

СФО — субфорникальный орган; АПФ2 — ангиотензинпревращающий фермент 2.

Обоснование

Субфорникальный орган (СФО) — один из циркумвентрикулярных органов центральной нервной системы, располагающихся на границе с желудочковой системой головного мозга [1], регулятор электролитного состава крови, что делает его одним из ключевых «игроков», обеспечивающих поддержание энергетического и водно-солевого баланса организма [2, 3]. Интерес исследователей к изучению структуры и клеточного состава СФО определяется отсутствием в этой области классического гематоэнцефалического барьера, вследствие чего составляющие орган ткани и клетки оказываются наиболее чувствительными к воздействию гуморальных факторов крови [4], поэтому колебания концентрации биологически активных веществ в периферической крови, присутствие в ней патогенов или общее нарушение кровообращения могут приводить к изменениям, в том числе деструктивным, нервной ткани СФО. Так, продемонстрировано, что циркулирующие в крови эндотоксины (такие как липополисахарид) стимулируют воспалительную реакцию и истощение пула макрофагов СФО [5], а недавние исследования показали возможную вовлеченность СФО в распространение и протекание коронавирусной инфекции, благодаря связыванию вирусов HCoV-NL63, SARS-CoV и SARS-CoV-2 с ангиотензинпревращающим ферментом 2 (АПФ2), экспрессированным на поверхности нейронов СФО [6]. Однако данные, характеризующие состояние клеточных популяций СФО при различных патологических состояниях, а также под влиянием разнообразных биологически активных факторов, нуждаются в существенном расширении. Таким образом, исследование реакции клеточных элементов СФО на стресс и другие патологические стимулы можно считать перспективным направлением в отношении понимания патогенеза заболеваний, связанных с нарушением функций центральной нервной системы. Особого внимания в этом отношении заслуживает артериальная гипертензия как один из факторов риска нарушения мозгового кровообращения и инсульта, а также развития прогрессирующих заболеваний нервной системы [7, 8]. В связи с этим изучение реакции нейрональной популяции СФО на стойкое повышение артериального давления представляется актуальной научной задачей.

В качестве экспериментальной модели артериальной гипертензии широкое распространение получила линия крыс SHR (Spontaneously Hypertensive Rats) [9, 10]. Артериальная гипертензия у крыс этой линии генетически детерменирована и связана с нарушением функции нескольких генов, участвующих в регуляции артериального давления [11].

Один из надежных доказательных подходов, применяемых для оценки функционального состояния нейронов, — иммуногистохимическое исследование с использованием антител к ядерному белку нервных клеток NeuN [12]. Анализ локализации NeuN широко применяется в сравнительных физиологических и молекулярно-биологических исследованиях для определения степени повреждения головного мозга при моделировании экспериментальной патологии [13, 14], реакции нейронов на воздействие токсических веществ [15] или механическое повреждение нервной ткани [16]. Таким образом, NeuN представляется надежным маркером, характеризующим состояние нейронов различных формаций головного мозга при развитии артериальной гипертензии.

Целью данного исследования стал морфологический и иммуногистохимический анализ распределения нейронов СФО у крыс в норме и у крыс SHR с выявлением белка NeuN.

Материалы и методы

Для оценки функционального состояния нейронов СФО крыс исследовали парафиновые срезы головного мозга спонтанно-гипертензивных крыс-самцов линии SHR (n = 5). В качестве контроля использовали срезы головного мозга нормотензивных крыс-самцов породы Вистар (n = 7). Животные были получены из биоколлекции Института физиологии им. И.П. Павлова РАН. Для верификации артериальной гипертензии у крыс линии SHR использовали систему неинвазивного измерения давления NIBP200A (Biopac Systems, Inc., США). Для исследования отбирали животных с систолическим давлением, в среднем соответствующим или превышающим 200 мм рт. ст. (см. таблицу). При содержании и умерщвлении животных соблюдали основные принципы Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986) и «Правила надлежащей лабораторной практики» (приказ № 199н от 01.04.2016 Минздрава России). Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГБНУ «ИЭМ» (заключение № 1/22 от 18.02.2022). Материал фиксировали в цинк-этанол-формалине [17] и заливали в парафин по стандартной методике. Из парафиновых блоков на ротационном микротоме Leica RM 2125RT на уровне СФО изготавливали срезы толщиной 5 мкм и монтировали на стекла с адгезивным покрытием HistoBond^® (Paul Marienfeld, Германия).

Таблица / Table. Систолическое давление у крыс линии SHR

The systolic pressure of SHR

После депарафинирования и регидратации препаратов проводили тепловое демаскирование антигена в модифицированном цитратном буфере (S1700, Agilent, США) в течение 22 мин. Ингибирование эндогенной пероксидазы проводили путем обработки срезов 3 % водным раствором перекиси водорода, а блокирование неспецифических сайтов связывания антигена — блокировочным раствором (Protein Block, Spring Bioscience, США) в течение 10 мин. Для постановки иммуногистохимической реакции использовали мышиные моноклональные (клон А60) антитела против NeuN в разведении 1 : 500 (MAB377, Merck, США). В качестве вторичных реагентов использовали набор UltraVision Quanto HRP DAB Detection System (TL-060-QHL, Thermo Fisher Scientific, США). Для предотвращения перекрестного связывания вторичных реагентов с собственными иммуноглобулинами крысы в раствор вторичных антител добавляли сыворотку, полученную из крови крыс породы Вистар, содержащихся в виварии ФГБНУ «ИЭМ», до конечной концентрации раствора 0,5 %. Для визуализации продукта реакции использовали хромоген 3,3՛-диаминобензидин из набора DAB+ (Agilent, США). После процедуры иммуногистохимического окрашивания часть срезов подкрашивали квасцовым гематоксилином либо альциановым синим. Полученные препараты анализировали с использованием микроскопа Leica DM750 (Германия) и фотографировали с помощью фотокамеры ICC50 (Leica, Германия).

Для оценки распределения популяций нервных клеток на препаратах головного мозга применяли кластерный анализ. Для этого полученные микрофотографии подвергали цифровому преобразованию с использованием плагина SSIDC Cluster Indicator из комплекта BioVoxxel Toolbox для Fiji [18], на основе алгоритма DBSCAN. Параметр ε = 20 пикселей (минимальное расстояние между объектами для создания общего кластера), minDensity = 3 объекта (минимальная плотность пикселей для создания одного кластера).

Результаты

Результаты измерения артериального давления у крыс линии SHR, отобранных для проведения настоящего исследования, представлены в таблице.

Предварительное изучение гистологических микропрепаратов при окрашивании ткани гематоксилином или альциановым синим показало, что СФО крыс (как Вистар, так и SHR) имеет форму небольшого бугорка, вдающегося в просвет третьего желудочка. СФО характеризуется высокой клеточной плотностью и небольшим содержанием нейропиля. В латеральных и дорсолатеральных частях СФО расположены крупные тонкостенные сосуды. Сосуды микроциркуляторного русла в этой области головного мозга отличаются расширенными периваскулярными пространствами, что отчетливо проявляется при окраске препаратов альциановым синим.

В результате иммуногистохимической реакции на срезах головного мозга всех исследуемых животных хорошо визуализируются нейроны СФО (рис. 1). СФО характеризуется высокой клеточной плотностью как за счет присутствия большого количества нейронов, выявляемых высокоинтенсивной реакцией на NeuN, так и за счет глиальных элементов, ядра которых позволила выявить подкраска препаратов гистологическими красителями. Нейроны СФО крыс Вистар локализованы компактно, распределены относительно равномерно в пределах органа. Выявляются клетки как с интенсивной, так и со слабой реакцией на NeuN. При этом общая интенсивность иммуногистохимической реакции в СФО визуально ниже, чем в близлежащих корковых и стриатных регионах. Глиальный компонент СФО кажется немногочисленным по сравнению с нейральным. В каудальной области СФО плотность нейронов значительно снижается, наблюдается преобладание глиального компонента над нейральным.

Рис. 1. NeuN в субфорникальном органе крыс: а — Вистар, с — SHR. Иммуногистохимическая реакция на NeuN с подкраской альциановым синим. Микрофотографии субфорникального органа крыс Вистар (b) и SHR (d), преобразованные методом кластеризации по плотности (алгоритм DBSCAN) при ε-окрестности 20 пикселей и минимальной плотности частиц 3. Стрелки указывают на нейроны с интенсивной окраской, головки стрелок — клетки с окраской средней интенсивности. Границы территорий (серый цвет) ограничивают предполагаемые кластеры

Fig. 1. NeuN distribution in the rats SFO: a — Wistar, c — SHR. Immunohistochemical staining of neurons (NeuN) with alcian blue counterstain. Micrographs of the Wistar rat (b) and SHR (d) subfornical organ, transformed using by the density based clustering DBSCAN algorithm. Parameter’s value ε = 20 pixels, minDensity = 3 objects. Arrows indicate intencively stained neurons, arrowheads show neurons with average IHC intensity. Borders (gray) indicate estimated clusters

При изучении гистологических микропрепаратов СФО спонтанно-гипертензивных крыс было отмечено визуальное сокращение популяции нейронов. Нейроны в паренхиме СФО у крыс SHR располагаются неравномерно и разделены глиальными элементами таким образом, что на срезах можно выявить обособленные скопления NeuN-позитивных клеток. Неравномерная интенсивность иммуногистохимической реакции в пределах органа и пониженная ее интенсивность по сравнению с другими наблюдаемыми на срезе областями головного мозга также отмечена у крыс SHR. В каудальной области, как и у крыс Вистар, плотность нейронов визуально значительно снижена. Все выявляемые NeuN-клетки СФО в этой области имели окраску слабой интенсивности. Скопления NeuN-содержащих клеток чаще всего отмечали в центральной части органа, вблизи крупных кровеносных сосудов, а также по периферии СФО — в субэпендимной зоне и на границе с прилежащим белым веществом (рис. 2, b). Оценка распределения NeuN-содержащих клеток с использованием плагина SSIDC Cluster Indicator подтвердила как наличие кластеров в пределах СФО, так и их расположение в основном в центральной и вентральной частях СФО (рис. 1, c, d). Между кластерами часто располагались пустоты, которые при исследовании препаратов при большом увеличении идентифицировали как скопления глиальных клеток.

Рис. 2. Особенности распределения NeuN в субфорникальном органе крыс при развитии артериальной гипертензии. Иммуногистохимическая реакция на NeuN с подкраской гематоксилином, крыса Вистар (a), с подкраской альциановым синим, крыса SHR (b). Стрелки указывают на NeuN-содержащие клетки, звездочки — кровеносные сосуды

Fig. 2. Hypertension-induced NeuN distribution in subfornical organ. NeuN immunohistochemistry with hematoxylin counterstain, Wistar rat (a), with alcian blue counterstain, SHR (b). Arrows indicate NeuN-immunopositive cells, arrows — blood vessels

Обсуждение результатов

Результаты исследования позволили охарактеризовать распределение нервных клеток в СФО крыс с нормальным и повышенным артериальным давлением.

Так, в ростральной и медиальной областях СФО крыс Вистар была отмечена высокая плотность нейронов, гомогенно распределенных в паренхиме органа. И напротив, в каудальной области СФО наблюдается малое количество NeuN-иммунопозитивных клеток. В этой области СФО прилегает и прикрепляется к сосудистому сплетению головного мозга [19] так, что основными структурными элементами здесь выступают многочисленные отростки нервных и глиальных клеток [20].

Интересной особенностью становится неравномерная интенсивность NeuN-иммунореактивности в клетках СФО. При обращении внимания на предполагаемые функции белка NeuN разными группами исследователей было замечено преимущественное его расположение в областях эухроматина. Дальнейшие исследования показали не только принадлежность NeuN к семейству Fox-1 факторов сплайсинга, но и его четкую колокализацию с белками маркерами ядерных спеклов [21, 22]. Таким образом, наблюдаемая на препаратах высокоинтенсивная иммуногистохимическая реакция на NeuN может указывать на особое функциональное состояние нейрона, связанное с регуляцией транскрипции и сплайсинга. Тем не менее при использовании только лишь иммуногистохимических подходов установить корреляцию между интенсивностью реакции на NeuN в нервных клетках и процессами экспрессии генов, к сожалению, не представляется возможным.

Иная пространственная организация нейронов СФО наблюдалась у спонтанно-гипертензивных крыс линии SHR. В ростро-медиальном отделе СФО отмечали значительную потерю NeuN-иммунопозитивных клеток и формирование обособленных групп нейронов. Для проверки предположения о формировании нейронами СФО крыс SHR обособленных клеточных скоплений была проведена оценка распределения иммунопозитивных клеток с использованием кластерного анализа. Для этого использовали плагин SSIDC Cluster Indicator из комплекта BioVoxxel Toolbox для Fiji, основанный на алгоритме DBSCAN, который определяет области концентрации точек, отделяя их от пустых и разреженных областей [23]. В результате цифрового преобразования изображений при заданных параметрах нам удалось подтвердить как компактное расположение нейронов СФО крыс Вистар, так и разреженную локализацию NeuN-положительных клеток крыс SHR и формирование ими в пределах СФО дискретных скоплений. Таким образом, результаты иммуногистохимического исследования дополнительно подтверждаются кластерным анализом.

Обнаруженная неравномерность распределения NeuN-содержащих элементов в СФО крыс SHR заставляет искать причины формирования подобных морфологических особенностей. Определенную реакцию нейрональной популяции СФО в ответ на стойкое повышение артериального давления следует ожидать, принимая во внимание тесную связь развития гипертонии с дисфункцией ренин-ангиотензиновой системы [24, 25]. Контроль артериального давления в нервной системе осуществляется воздействием ангиотензина II на нейроны через рецепторы ангиотензина II типов 1 и 2 (AT1R, AT2R) [26]. Постоянная активация AT1R, присутствующего на плазматических мембранах нейронов СФО, в свою очередь приводит к усилению секреции вазопрессина, нарушению чувствительности барорефлекса и способствует поддержанию состояния воспаления, связанного с повышенным артериальным давлением, что дополнительно приводит к повреждению тканей и дисфункции органов [27]. В этом контексте представляется важным упомянуть, что вазоконстрикторные эффекты ангиотензина II подавляются с помощью сигнального пути АПФ2 – ангиотензин 1-7 – Mas-рецептор. Это позволяет рассматривать агонисты АПФ2 в качестве потенциальных фармакологических агентов для лечения гипертонии [28], а особенности проницаемости гематоэнцефалического барьера в СФО, клетки которого содержат на мембранах АПФ2, делают его одной из возможных областей проникновения лекарственных препаратов в головной мозг. Еще один важный факт, касающийся АПФ2, — это то, что при инфицировании SARS-CoV-2 этот рецептор обеспечивает проникновение вируса в клетки-мишени. Связывание SARS-CoV-2 с АПФ2, как предполагается, вызывает нарушение сигнального пути АПФ2 – ангиотензин 1-7 – Mas-рецептор, накопление ангиотензина II и дисфункцию ренин-ангиотензиновой системы [6]. Это может говорить о том, что COVID-19 может не только усугублять течение артериальной гипертензии, но и оказаться одним из факторов риска развития болезни.

Однако стоит отдельно отметить, что, несмотря на распространенное применение иммуногистохимической реакции на NeuN при проведении научных исследований и диагностики патологий [12], снижение интенсивности или полное отсутствие реакции не может трактоваться однозначно. В работах по исследованию реакции нейронов на повреждение продемонстрировано, что утрата NeuN-положительных клеток может быть связана не только с прогнозируемой или произошедшей клеточной гибелью [29], но и с транзиторным прекращением синтеза этого белка в клетке при сохранении нейронами жизнеспособности [30]. Последнее предположение не кажется убедительным для рассматриваемого случая, поскольку подкраска ядер клеток не выявляет типичных NeuN-негативных нейронов в изученном материале.

Общеизвестен факт наличия у спонтанно-гипертензивных крыс линии SHR проявлений нейродегенерации в виде некроза нервных клеток с пролиферацией глиальных элементов в очагах опустошения в корковых структурах [31, 32]. В связи с этим более вероятным представляется гибель нейронов в СФО крыс SHR, вариант которой (запуск различных механизмов, каскадов) в рамках настоящего исследования установить невозможно.

Заключение

1. Иммуногистохимический метод в сочетании с применением кластерного анализа позволил получить детальную информацию о локализации и морфологии клеток, а также о плотности их распределения в тканевых структурах.
2. Проведенное исследование показало, что нейрональная популяция СФО у крыс SHR подвергается реорганизации и, возможно, дегенерации.
3. Изменение распределения белка NeuN в пределах нейрональной популяции СФО у крыс SHR, по-видимому, обусловлено гибелью клеток, механизм которой в рамках настоящего исследования установить невозможно.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда, проект № 22-25-00105, https://rscf.ru/project/22-25-00105/.

Конфликт интересов. Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.

Вклад автора. Автор внес существенный вклад в разработку концепции и подготовку статьи, прочел и одобрил финальную версию перед публикацией.

Additional information

Funding source. The reported study was funded by RSF according to the research project No. 22-25-00105, https://rscf.ru/project/22-25-00105/.

Conflict of interest. The author declare that they have no conflict of interest.

Authors contribution. The author made a significant contribution to the development of the concept and preparation of the article, read and approved the final version before publication.

About the authors

Valeriia A. Razenkova

Author for correspondence.
Email: valeriya.raz@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3997-2232
SPIN-code: 8877-8902
Scopus Author ID: 57219609984
ResearcherId: AAH-1333-2021

PhD student, Junior Research Associate, Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Fig. 1. NeuN distribution in the rats SFO: a — Wistar, c — SHR. Immunohistochemical staining of neurons (NeuN) with alcian blue counterstain. Micrographs of the Wistar rat (b) and SHR (d) subfornical organ, transformed using by the density based clustering DBSCAN algorithm. Parameter’s value ε = 20 pixels, minDensity = 3 objects. Arrows indicate intencively stained neurons, arrowheads show neurons with average IHC intensity. Borders (gray) indicate estimated clusters

Download (341KB)

Indexing metadata

3. Fig. 2. Hypertension-induced NeuN distribution in subfornical organ. NeuN immunohistochemistry with hematoxylin counterstain, Wistar rat (a), with alcian blue counterstain, SHR (b). Arrows indicate NeuN-immunopositive cells, arrows — blood vessels

Download (306KB)

Indexing metadata