Hemostatic activity in vitro of lectin-containing substances of bryathypes on the example of some Antarctic and Belarus representatives

Full Text

Список сокращений

АПТВ — активированное парциальное тромбопластиновое время; ЛСС — лектин-содержащие субстанции.

Обоснование

Среди разнообразных гемостатических средств местного применения, представленных на рынке изделий медицинского назначения в Беларуси и России, весьма востребованы местные гемостатики природного происхождения, в частности, на основе полисахаридов (поли-N-ацетилглюкозамина из морских водорослей, хитозана из ракообразных; производных целлюлозы и амилопектина). Каждый из них не универсален, однако обладает значительным технологическим потенциалом обновления и совершенствования [1–3].

В подобном контексте одним из подходов при создании новых локальных гемостатиков растительного происхождения может быть использование биологически активных соединений мохообразных (Bryophyta), которые все еще остаются малоизученной группой высших растений в фармакогностическом, фитохимическом и биохимическом контекстах. Исключение составляют представители рода Sphagnum, которые нашли широкое применение в медицинской практике различных стран, особенно в период военных действий [4, 5].

На современном этапе отмечается всплеск интереса к мохообразным и поиску видов, перспективных для использования в медицине, благодаря противовоспалительному, антибактериальному и антифунгальному эффектам, обусловленным, как полагают, наличием полисахаридного комплекса и разнообразных вторичных метаболитов [6–10]. В единичных работах отмечен и гемостатический эффект некоторых видов мхов [6, 8], реализуемый, по мнению авторов, посредством таннинов, сапонинов и гликозидов [11–16]. Вместе с тем нельзя исключить, что в составе мхов могут присутствовать также белки лектины, характерная особенность которых — наличие в молекулах специфических углеводсвязывающих сайтов, принимающих участие в формировании белок-углеводных взаимодействий и обеспечивающих аффинное связывание с углеводными детерминантами на поверхности клеток [17, 18]. Данное обстоятельство позволяет предполагать, что лектины мхов обладают агрегантными свойствами в отношении форменных элементов крови и способны выступать в качестве агонистов, запускающих агрегацию тромбоцитов [19–24]. Однако в литературе практически отсутствуют сведения о присутствии лектинов в составе мхов, их гемостатических свойствах и влиянии исследованных видов Антарктики и Беларуси на гемостаз.

Цель настоящей работы — исследование влияния лектин-содержащих субстанций из трех видов мхов Антарктики и двух видов мхов Беларуси на некоторые показатели гемостаза крови человека in vitro.

Материалы и методы

Объекты исследования — представители бриофлоры родов Bryum семейства Bryaceae Schwägr. (Bryum pseudotriquetrum (Hedw.) G. Gaertn, рис. 1); Ceratodon семейства Ditrichaceae Limpr. (Ceratodon purpureus (Hedw.) Brid., рис. 2) и Coscinodon семейства Grimmiaceae Arn. (Coscinodon lawianus (J.H. Willis) Ochyra, рис. 3), собранные в Восточной Антарктиде в районе Белорусской антарктической станции Гора Вечерняя и Российской антарктической станции Прогресс.

 

Рис. 1. Мох Bryum pseudotriquetrum: а — карта распространения (https://www.gbif.org/species/2676867); b — куртина; c — побеги (фотографии любезно предоставлены Л.Е. Курбатовой)

Fig. 1. Moss Bryum pseudotriquetrum: a — distribution map (https://www.gbif.org/species/2676867); b — curtain; с — shoots (photos courtesy of L.E. Kurbatova)

 

Рис. 2. Мох Ceratodon purpureus: а — карта распространения (https://www.gbif.org/species/5281381); b — сообщество на невысоких скальных выходах; c — побеги (фотографии Л.Е. Курбатовой)

Fig. 2. Moss Ceratodon purpureus: a — distribution map (https://www.gbif.org/species/5281381); b — network on low rocky outcrops; c — shoots (photographs by L.E. Kurbatova)

 

Рис. 3. Мох Coscinodon lawianus: а — карта распространения (https://www.gbif.org/species/8124837); b — дернины; с — побеги (фотографии Л.Е. Курбатовой)

Fig. 3. Moss Coscinodon lawianus: a — distribution map (https://www.gbif.org/species/8124837); b — sods; c — shoots (photographs by L.E. Kurbatova)

 

Более подробная информация о локализации исследованных видов мхов представлена в табл. 1.

Среди мхов, представленных в табл. 1, B. pseudotriquetrum и C. purpureus — биполярные виды, космополиты, которым свойственен широкий ареал обитания во многих регионах мира, тогда как C. lawianus — эндемик континентальной Антарктики и встречается преимущественно в ее восточной части.

 

Таблица 1. Виды мхов Восточной Антарктиды и Беларуси

Table 1. Moss species of East Antarctic and Belarus

№ образца	Вид	Семейство	Место сбора (коллектор)	Координаты
Континентальная восточная Антарктида
1	B. pseudotriquetrum	Bryaceae	Восточная Антарктида, Земля Эндерби, холмы Тала, оазис Вечерний, мыс Доступный, окрестности Белорусской антарктической станции Гора Вечерняя (Е.В. Корзун)	S 67°39.269 E 46°09.330
2	С. purpureus	Ditrichaceae	Восточная Антарктида, холмы Ларсеманн, районы залива Прюдс, озера Скандретт, окрестности Российской станции Прогресс, скалы (Ю.Г. Гигиняк)	S 69°23.351 E 76°23.317
3	C. lawianus	Grimmiaceae	Восточная Антарктида, холмы Ларсеманн, районы залива Прюдс, озера Скандретт, окрестности Российской станции Прогресс (Ю.Г. Гигиняк)	S 69°23.662 E 76°22.607
Беларусь
4	B. pseudotriquetrum	Bryaceae	Беларусь, Минская область (О.М. Масловский)	N 54°45.382 E 26°46.596
5	С. purpureus	Ditrichaceae	Беларусь, Минская область (О.Л. Канделинская)	N 53°91.601 E 27°60.271

 

Так, B. pseudotriquetrum отмечен на территориях от высоких широт Арктики до субтропической зоны, а также в горах и экваториальных областях, в южном полушарии встречается на всех субантарктических островах, на юге Австралии, в Новой Зеландии, в Южной Америке в Чили и Аргентине, в Антарктике, это один из наиболее часто встречающихся видов в Антарктике [25].

Вид C. purpureus встречается на всех континентах, от полярных областей обоих полушарий до высокогорий тропиков; это один из наиболее часто встречающихся видов в Антарктике. В восточной Антарктике растет во всех прибрежных и пришельфовых оазисах, встречается в горах и на нунатаках до 83°S, на высотах до 1347 м. Вид имеет очень широкую экологическую амплитуду, растет на скальных поверхностях, в трещинах, на песке, на переувлажненном грунте, на скалах, скальных полках, на склонах морен между камней, по берегам озер и водотоков [25].

Вид C. lawianus — эндемик восточной Антарктиды и отмечен как в прибрежных оазисах, так и во внутренних территориях в горах и на нунатаках до 73°S, на высотах до 2160 м. Растет на скалах в трещинах, расщелинах и кавернах, на песке на стоках со снежников и ледников, на влажных скалах по берегам водотоков. Избегает субстратов с повышенным содержанием азота, в частности, не встречается в местах расположения птичьих колоний и гнездовий [25].

Выделение лектин-содержащих субстанций (ЛСС) из мхов

Образцы мхов размораживали, очищали от механических примесей, отмывали от песка и подсушивали на фильтровальной бумаге. Для исследований использовали верхушечную часть стеблей длиной от 5 до 10 мм. Навеску мхов 0,5 г растирали в 0,05 моль трис-HCl буфере, pH 8,0, в соотношении 1 : 10 и оставляли для экстракции на ночь. Затем экстракт отжимали через капроновую ткань, фильтрат центрифугировали при 20 000 g 20 мин. Оценку активности лектинов в надосадочной жидкости (далее ЛСС) определяли по реакции агглютинации кроличьих эритроцитов.

Анализ агглютинирующей активности ЛСС мхов. Для осуществления данного анализа использовали кровь кроликов, полученную из ушной вены здоровых особей на базе вивария Минского медицинского университета (Минск, Беларусь) в соответствии с Хельсинкской декларацией о гуманном обращении с животными 1964 г. (с изменениями и дополнениями), с Европейскими Директивами 86/609/ЕЕС от 24.11.1986, Европейской конвенцией СEД № 123 от 18.03.1986 (с изменениями от 15.06.2006) о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях, с Директивой Европейского парламента и Совета ЕС 2010/63/EU от 22.09.2010 [26, 27].

Кровь стабилизировали раствором антикоагулянта CPDA-1 в соотношении 6 : 1. Определение агглютинирующей активности ЛСС мхов проводили посредством микротитрования на иммунологических планшетах с U-образными лунками с добавлением в них 2 % суспензии эритроцитов кролика. Реакцию агглютинации проводили при комнатной температуре и результат (агглютинацию) регистрировали через 2 ч после начала титрования. Активность лектинов выражали в величинах, обратных минимальной концентрации белка, при которой отмечали реакцию гемагглютинации (Ед/мг белка).

Определение содержания белка в составе ЛСС мхов. Определение концентрации белка в составе ЛСС мхов осуществляли по методу Bradford [28], в качестве стандарта для построения калибровочного графика использовали бычий сывороточный альбумин. Концентрацию белка выражали в мг/мл.

Выделение тромбина. Для выделения тромбина использовали протромбин, отделенный от церулоплазмина с помощью аффинной хроматографии на неомицин-агарозе. α-Тромбин получали фильтрованием протромбина через колонку с агарозным гелем с иммобилизованным экарином, как описано ранее [29].

Исследование влияния ЛСС мхов на агрегацию. Для осуществления данного анализа использовали донорскую кровь различных групп, резуса и пола, полученную из Республиканского научно-практического центра трансфузиологии и медицинских биотехнологий (Минск, Беларусь). Кровь стабилизировали 3,8 % раствором цитрата натрия в соотношении 9 : 1.

Обогащенную тромбоцитами плазму получали центрифугированием крови при 150 g в течение 10 мин. Отмытые тромбоциты выделяли путем двукратного центрифугирования обогащенной тромбоцитами плазмы при 1500 g в течение 3 мин с последующим отмыванием осадка в трис/EDTA-буфере (13,3 ммоль трис, 120 ммоль NaCl, 15,4 ммоль KCl, 6 ммоль D-глюкозы, 1,5 ммоль EDTA, pH 6,9).

Агрегацию тромбоцитов исследовали с применением анализатора агрегации АР2110 (ЗАО «Солар», Минск, Беларусь). При исследовании тромбин-индуцированной агрегации тромбоцитов в кювету агрегометра вносили 50 мкл отмытых тромбоцитов и 350 мкл фосфатно-солевого буфера (10 ммоль Na₂HPO₄/KH₂PO₄, 137 ммоль NaCl, 2,7 ммоль KCl, pH 7,4), содержащего 1 ммоль CaCl₂ и 0,5 ммоль MgCl₂, инкубировали при температуре 37 °C в течение 5 мин в отсутствие или в присутствии исследуемых веществ в необходимой концентрации, а затем добавляли тромбин (0,5 мкг/мл).

Для количественной оценки процесса агрегации тромбоцитов использовали следующие параметры: степень агрегации (Т) — максимальное изменение величины светопропускания суспензии тромбоцитов при регистрации агрегации; скорость агрегации (v) — тангенс максимального угла наклона прямолинейного участка кинетической кривой.

Определение активированного парциального тромбопластинового времени (АПТВ-тест). Измерения проводили в соответствии с инструкцией по применению набора реагентов для определения АПТВ (АПТВ-тест, производитель — РНПЦ трансфузиологии и медицинских биотехнологий, Минск, Беларусь). Принцип работы набора реагентов заключается в определении времени свертывания плазмы при контакте с АПТВ-реагентом, содержащем контактный активатор — эллаговую кислоту, фосфолипиды и 0,277 % раствор CaCl₂.

Для анализа использовали донорскую кровь различных групп, резуса и пола, полученную из РНПЦ трансфузиологии и медицинских биотехнологий (Минск, Беларусь). Кровь стабилизировали 3,8 % раствором цитрата натрия в соотношении 9 : 1 и центрифугировали 15 мин при 1800 g. Полученную бестромбоцитарную плазму переносили в другую пробирку и центрифугировали повторно 15 мин при 1800 g.

Перед проведением анализа флакон с жидким АПТВ-реагентом оставляли при комнатной температуре в течение 30 мин для стабилизации. В прогретую при 37 °С пробирку, помещенную в термостат с прозрачными стенками, вносили 0,1 мл плазмы, 0,1 мл предварительно перемешанного АПТВ-реагента и инкубировали в течение 3 мин. Затем в смесь добавляли 0,1 мл 0,277 % раствора CaCl₂, предварительно прогретого при температуре 37 °С в блоке подготовки проб. Показания регистрировали визуально по образованию первых нитей фибринового сгустка. АПТВ выражали через индекс Ratio (R), который вычисляли по формуле: R = АПТВ_{образца} /АПТВ_{контрольной плазмы}. В норме R = 0,8–1,2. Все исследования с человеческой кровью были одобрены решением этического комитета ГУ «Республиканский научно-практический центр трансфузиологии и медицинских биотехнологий» (решение № 1 от 10.04.2022, Минск, Беларусь).

Статистический анализ результатов был выполнен с помощью пакета программ Origin 7.0. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Для анализа различий между средними значениями использовали t-критерий Стьюдента. В экспериментах по определению активированного парциального тромбопластинового времени (АПТВ-тест) различия между средними значениями оценивали с помощью непараметрического критерия Манна – Уитни (U) с использованием программы Statistica v.10. (StatSoft Inc., США). Различия считали статистически достоверными при уровне значимости p < 0,05.

Результаты

Согласно представленным данным, ЛСС мхов восточной Антарктики и Беларуси характеризовались вариабельностью показателя агглютинирующей активности в отношении кроличьих эритроцитов в зависимости от вида и места произрастания (табл. 2). Показатель активности лектинов в составе ЛСС исследованных белорусских и антарктических видов мхов находился в пределах 30206,49–482954,31 (B. pseudotriquetrum) и 11708,28–1769253,14 (C. purpureus) Ед/мг белка, причем данный показатель у белорусских образцов мхов был значительно ниже по сравнению с таковым у антарктических образцов.

 

Таблица 2. Активность лектинов в составе лектин-содержащих субстанций исследованных представителей бриофлоры восточной Антарктики и Беларуси в тест-системе на основе кроличьих эритроцитов

Table 2. Lectin activity in the composition of moss lectin-containing substances in the studied representatives of the bryoflora of еast Antarctica and Belarus in a test system based on rabbit erythrocytes

№ образца	Вид	Активность лектинов, Ед/мг белка
Восточная Антарктика
1	B. pseudotriquetrum	482954,31 ± 10499,01
2	C. purpureus	1769253,14 ± 37643,68
3	C. lawianus	1333979,59 ± 48135,84
Беларусь
4	B. pseudotriquetrum	30206,49 ± 755,16*
5	C. purpureus	11708,28 ± 182,68*

* Различия между антарктическими и белорусскими образцами B. pseudotriquetrum (p = 0,0000017468) и C. purpureus (p = 0,0000012589) достоверны при p < 0,05.

 

Далее было исследовано влияние тестируемых ЛСС мхов на агрегацию изолированных тромбоцитов. На рис. 4 представлены типичные кинетические кривые агрегации тромбоцитов, индуцированной ЛСС антарктических мхов. Необходимо отметить, что исследуемые образцы ЛСС антарктических мхов (рис. 4, а–с) — сильные индукторы агрегации тромбоцитов. Их эффект был сравним с эффектом стандартного индуктора агрегации тромбоцитов — тромбина (рис. 4, d).

При анализе количественных показателей, характеризующих агрегацию тромбоцитов (Т — степень агрегации, определяемая как величина светопропускания суспензии тромбоцитов по прошествии 5 мин агрегации, v — скорость агрегации, определяемая как величина тангенса максимального угла наклона линейного участка кинетической кривой агрегации), было установлено (рис. 5), что агрегантный эффект тестируемых ЛСС антарктических мхов составлял 25–80 % от эффекта тромбина в той же концентрации. Образцы ЛСС из мхов B. pseudotriquetrum и C. lawianus характеризовались наиболее выраженной способностью индуцировать агрегацию тромбоцитов (70–80 % от эффекта тромбина).

 

Рис. 4. Типичные кинетические кривые агрегации тромбоцитов при добавлении лектин-содержащих субстанций антарктических мхов (a–c) в различных концентрациях и тромбина (d). Тромбоциты (2,5 · 10⁸ кл/мл) в фосфатно-солевом буфере, содержащем 1 ммоль CaCl₂, 0,5 ммоль MgCl₂. Образец № 1 — B. pseudotriquetrum, № 2 — C. purpureus, № 3 — C. lawianus. Используемые концентрации на рисунке a: 1 — 0,11, 2 — 0,23, 3 — 0,57, 4 — 1,14, 5 — 2,27 мкг/мл; b: 1 — 0,18, 2 — 0,45, 3 — 0,9, 4 — 1,8 мкг/мл; с: 1 — 0,12 , 2 — 0,3, 3 — 0,6, 4 — 1,2 мкг/мл; d — 0,5 мкг/мл

Fig. 4. Typical kinetic curves of platelet aggregation with the addition of Antarctic moss lectin-containing substances (a–c) at various concentrations and thrombin (d). Platelets (2.5 · 10⁸ cells/ml) in PBS containing 1 mM CaCl₂, 0.5 mM MgCl₂. Sample numbers: No. 1 — B. pseudotriquetrum, No. 2 — C. purpureus, No. 3 — C. lawianus. Concentrations used in figure a: 1 — 0.11, 2 — 0.23, 3 — 0.57, 4 — 1.14, 5 — 2.27 µg/ml; b: 1 — 0.18, 2 — 0.45, 3 — 0.9, 4 — 1.8 µg/ml; с: 1 — 0.12, 2 — 0.3, 3 — 0.6, 4 — 1.2 µg/ml; d — 0.5 µg/ml

 

Рис. 5. Зависимость параметров агрегации тромбоцитов (a — степень, b — скорость), инициируемой внесением лектин-содержащих субстанций антарктических мхов, от их концентрации. Тромбоциты (2,5 · 10⁸ кл/мл) в фосфатно-солевом буфере, содержащем 1 ммоль CaCl₂, 0,5 ммоль MgCl₂. Образец № 1 — B. pseudotriquetrum, № 2 — C. purpureus, № 3 — C. lawianus

Fig. 5. Dependence of the parameters of platelet aggregation (a — degree, b — rate) initiated by the addition of Antarctic moss lectin-containing substances, on the concentration of these compounds. Platelets (2.5 · 10⁸ cells/ml) in PBS containing 1 mM CaCl₂, 0.5 mM MgCl₂. Sample numbers: No. 1 — B. pseudotriquetrum, No. 2 — C. purpureus, No. 3 — C. lawianus

 

Интересно отметить, что способность исследуемых субстанций индуцировать агрегацию тромбоцитов не зависела ни от группы крови доноров (тромбоциты выделяли из 5 образцов O(I) группы, 5 образцов A(II) группы и 1 образца B(III) группы), ни от пола донора (в работе была использована кровь 4 мужчин и 7 женщин).

Для сравнительного анализа далее было проведено исследование гемостатической активности ЛСС, выделенных из биполярных видов мхов, которые встречаются не только в Антарктике, но и в Беларуси. Таковыми являются виды B. pseudotriquetrum и C. purpureus. Как видно из данных, представленных в табл. 2, показатель активности лектинов в составе ЛСС исследованных белорусских мхов был ниже, чем в образцах ЛСС антарктических мхов (11708,28 — C. purpureus, 30206,49 Ед/мг белка — B. pseudotriquetrum).

Данный факт оказывал влияние и на способность ЛСС белорусских мхов инициировать агрегацию тромбоцитов. Так, несмотря на то, что кинетические кривые агрегации тромбоцитов под влиянием ЛСС антарктических и белорусских видов мхов были сходны, последние регистрировались при значительно более высоких концентрациях (рис. 6).

 

Рис. 6. Типичные кинетические кривые агрегации тромбоцитов при добавлении лектин-содержащих субстанций белорусских мхов в различных концентрациях. Тромбоциты (2,5 · 10⁸ кл/мл) в фосфатно-солевом буфере, содержащем 1 ммоль CaCl₂, 0,5 ммоль MgCl₂. Образец № 4 — B. pseudotriquetrum, № 5 — C. purpureus. Используемые концентрации на рисунке a: 1 — 3,4, 2 — 8,5, 3 — 17, 4 — 34 мкг/мл; b: 1 — 1,4, 2 — 3,6, 3 — 7,1, 4 — 14,3 мкг/мл

Fig. 6. Typical kinetic curves of platelet aggregation with the addition of Belarus moss lectin-containing substances at various concentrations. Platelets (2.5 · 10⁸ cells/ml) in PBS containing 1 mM CaCl₂, 0.5 mM MgCl₂. Sample numbers: No. 4 — B. pseudotriquetrum, No. 5 — C. purpureus. Concentrations used in figure a: 1 — 3.4, 2 — 8.5, 3 — 17, 4 — 34 µg/ml; b: 1 — 1.4, 2 — 3.6, 3 — 7.1, 4 — 14.3 µg/ml

 

Исходя из анализа параметров агрегации тромбоцитов (степень Т, скорость v) (рис. 7) можно сделать вывод, что образцы ЛСС мхов из Беларуси — менее сильные индукторы агрегации тромбоцитов по сравнению с ЛСС антарктических мхов.

 

Рис. 7. Зависимость параметров агрегации тромбоцитов (a — степень, b — скорость), инициируемой лектин-содержащих субстанций из белорусских мхов, от их концентрации. Тромбоциты (2,5 · 10⁸ кл/мл) в фосфатно-солевом буфере, содержащем 1 ммоль CaCl₂, 0,5 ммоль MgCl₂. Образец № 4 — B. pseudotriquetrum, № 5 — C. purpureus

Fig. 7. Dependence of the parameters of platelet aggregation (a — degree, b — rate) initiated by the addition of Belarus moss lectin-containing substances, on the concentration of these compounds. Platelets (2.5 · 10⁸ cells/ml) in PBS containing 1 mM CaCl₂, 0.5 mM MgCl₂. Sample numbers: No. 4 — B. pseudotriquetrum, No. 5 — C. purpureus

 

Их эффект был сравним с эффектом стандартного индуктора агрегации тромбоцитов — тромбина (0,5 мкг/мл) в диапазоне концентраций 15–35 мкг/мл, тогда как аналогичный эффект регистрировался для ЛСС антарктических мхов в диапазоне концентраций 0,5–1,5 мкг/мл. Мы высказываем гипотезу, согласно которой наблюдаемый феномен более высокой активности ЛСС из исследуемых видов антарктических мхов по сравнению с таковыми белорусских видов обусловлен особенностями структуры белков, в том числе лектинов, что нуждается в отдельных исследованиях. Как и в случае с антарктическими мхами, способность исследуемых ЛСС из белорусских мхов индуцировать агрегацию тромбоцитов также не зависела ни от группы крови доноров, ни от пола донора.

Далее нами было изучено влияние ЛСС мхов Антарктики на плазменный (вторичный) гемостаз и осуществлено гемостазиологическое исследование плазмы крови доноров с добавлением ЛСС в соотношении 1 : 1. Определяли показатель АПТВ с указанием индекса Ratio (R). В качестве контроля использовали плазму донора и плазму с добавлением физиологического раствора в соотношении 1 : 1. Результаты гемостазиологических исследований представлены в табл. 3–6.

Согласно данным табл. 5 и 6, под влиянием ЛСС антарктических мхов наблюдалось снижение показателя АПТВ на 15–18 %, причем достоверно значимое снижение данного показателя определялось под действием образца № 1 (р = 0,016). Кроме того, выявлено статистически достоверное снижение индекса R (почти в 2 раза) под действием исследуемых образцов № 1, 2, 3 (р = 0,012 для всех значений), показатели которого соответствовали диапазону нормы (0,8–1,2).

Поскольку показатель АПТВ используется для характеристики эффективности работы внутреннего пути плазменного гемостаза, в котором участвуют факторы XII, XI, IX, VIII, X, V и II, можно предположить, что тестируемые ЛСС антарктических мхов оказывают влияние на взаимодействие вышеупомянутых факторов свертывания при образовании кровяного сгустка.

Таким образом, в результате проведенных исследований нами впервые установлены феномен высокой агрегационной активности ЛСС из мхов Антарктики и Беларуси и их влияние на коагуляционный гемостаз. Полученные результаты могут служить перспективной основой для разработки отечественных фитопрепаратов различного назначения для применения в медицине. При необходимости возможно использование белорусских биполярных видов мхов в качестве растительного сырья.

 

Таблица 3. Результаты гемостазиологических исследований доноров

Table 3. Results of donors hemostasiological studies

Показатель	Параметры гемостаза
	АПТВ, с	R
Донор № 1	34,0	1,03
Донор № 2	34,8	1,06
Донор № 3	42,0	1,28
Донор № 4	38,8	1,18
Донор № 5	35,0	1,07
Среднее значение ± ± стандартное отклонение	36,92 ± 1,52	1,12 ± 0,05
Референсные значения	28–35	0,8–1,2

 

Таблица 4. Результаты гемостазиологических исследований доноров (разбавление плазмы физиологическим раствором в соотношении 1 : 1)

Table 4. Results of donors hemostasiological studies (dilution of plasma with physiological saline in a ratio of 1 : 1)

Показатель	Параметры гемостаза
	АПТВ, с	R
Донор № 1	51,9	1,58
Донор № 2	48,6	1,48
Донор № 3	56,0	1,7
Донор № 4	55,0	1,67
Донор № 5	48,1	1,47
Среднее значение ± ± стандартное отклонение	51,92 ± 1,60	1,58 ± 0,05
Референсные значения	28–35	0,8–1,2

 

Таблица 5. Результаты гемостазиологических исследований доноров в присутствии лектин-содержащих субстанций из антарктических мхов

Table 5. Results of donors hemostasiological studies in the presence of moss lectin-containing substances from Antarctic mosses

Показатель	Параметры гемостаза
	образец № 1 (B. pseudotriquetrum)		образец № 2 (C. purpureus)		образец № 3 (C. lawianus)
	АПТВ, с	R	АПТВ, с	R	АПТВ, с	R
Донор № 1	44,8	0,86	51,0	0,98	42,2	0,81
Донор № 2	48,1	0,99	38,9	0,8	40,8	0,84
Донор № 3	48,0	0,86	51,9	0,93	55,6	0,99
Донор № 4	39,0	0,71	37,2	0,68	42,0	0,76
Донор № 5	35,8	0,74	37,6	0,68	42,2	0,88
Среднее значение ± ± стандартное отклонение	43,14 ± 2,50	0,83 ± 0,05	42,32 ± 3,87	0,81 ± 0,06	44,56 ± 2,78	0,86 ± 0,04
Референсные значения	28–35	0,8–1,2	28–35	0,80–1,2	28–35	0,8–1,2

 

Таблица 6. Средние значения гемостазиологических исследований

Table 6. Mean values of hemostatic studies

Вариант эксперимента	АПТВ, с	R1
Доноры + 0,9 % раствор хлорида натрия	51,92 ± 1,60	1,58 ± 0,05
Доноры + образец № 1	43,14 ± 2,50*	0,83 ± 0,05*
Доноры + образец № 2	42,32 ± 3,87	0,81 ± 0,06*
Доноры + образец № 3	44,56 ± 2,78	0,86 ± 0,04*
Референcные значения	28–35	0,8–1,2

R¹ — отношение показателя «АПТВ доноров + образец» к показателю «АПТВ доноров + 0,9 % раствор хлорида натрия». Обозначение образцов см. в табл. 5; * достоверность различий между аналогичными показателями по сравнению с показателем «доноры + физиологический раствор» при р < 0,05.

 

В этой связи нами была проведена ресурсная оценка запасов побегов B. pseudotriquetrum с помощью разработанного алгоритма кадастровой региональной оценки запасов растительных ресурсов. На территории Республики Беларусь всего учтено 20 823 популяций на площади 3659,5 га [30]. Рассчитаны запасы сырья и рекомендуемые объемы ежегодного пользования ресурсами данного вида. Общий биологический запас побегов B. pseudotriquetrum на территории страны составляет 18,3 т, эксплуатационный — 9,1 т, а возможный объем ежегодной заготовки сырья — 0,9 т. На рис. 8 проиллюстрировано распределение эксплуатационных запасов побегов данного вида по стране.

 

Рис. 8. Распределение эксплуатационных запасов сырья B. pseudotriquetrum на территории Республики Беларусь по административным районам

Fig. 8. Distribution of exploitable stocks of B. pseudotriquetrum raw materials on the territory of the Republic of Belarus by administrative regions

 

Согласно представленным данным, наибольшие эксплуатационные запасы побегов данного вида сосредоточены в Брестской (2815 кг) и Гомельской (2743 кг) областях, наименьшие — в Гродненской (534 кг). По административным районам самые большие эксплуатационные запасы сырья (более 100 кг) выявлены в Березовском (124,8 кг), Ганцевичском (138,0 кг), Ивацевичском (400,0 кг), Лунинецком (522,0 кг), Ляховичском (141,0 кг), Пинском (104,5 кг), Пружанском (116,5 кг) и Столинском (960,0 кг) районах Брестской области; Городокском (139,3 кг), Докшицком (136,3 кг), Полоцком (170,8 кг) и Россонском (112,3 кг) районах Витебской области; Брагинском (154,5 кг), Ветковском (270,3 кг), Добрушском (130,0 кг), Ельском (147,5 кг), Житковичском (350,0 кг), Жлобинском (100,3 кг), Калинковичском (117,8 кг), Лельчицком (403,8 кг), Наровлянском (142,3 кг), Петриковском (206,0 кг), Речицком (127,8 кг) и Хойникском (139,0 кг) районах Гомельской области; Борисовском (122,8 кг) и Солигорском (114,0 кг) районах Минской области.

Вид C. purpureus распространен по всей территории Республики Беларусь. Однако несмотря на то, что в настоящее время зарегистрировано значительное количество популяций данного вида, они малочисленны. В связи с этим заготовки сырья C. purpureus возможны, но лишь в небольших объемах.

Заключение

В результате проведенных исследований нами впервые установлен феномен высокой агрегационной активности ЛСС из мхов Антарктики и Беларуси, сопоставимой с тромбином. Исследованные представители мохообразных родов Bryum, Ceratodon и Coscinodon характеризовались агглютинирующим и гемостатическим действием в отношении эритроцитов и тромбоцитов соответственно, причем наиболее высокие показатели были отмечены для антарктических видов по сравнению с этими же видами из Беларуси. Высказана гипотеза, согласно которой наблюдаемый феномен обусловлен особенностями структуры белков, в том числе лектинов. Предполагается, что возможными индукторами агглютинации эритроцитов и агрегации тромбоцитов в составе мхов являются лектины. Показано, что у видов B. pseudotriquetrum и C. purpureus имеется определенный ресурсный потенциал в Беларуси, что позволяет рассматривать перспективы их ежегодной заготовки. Полученные результаты расширяют спектр перспективных видов мхов, обладающих гемостатической активностью, которые могут быть использованы для разработки новых гемостатиков растительного происхождения локального применения.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Исследование было проведено при поддержке подпрограммы «Развитие деятельности белорусской антарктической станции» Государственной программы «Научно-инновационная деятельность Национальной академии наук Беларуси» на 2021–2025 гг. в рамках мероприятия 8. Заказчик не оказывал влияния на выбор материала для публикации, анализ и интерпретацию данных.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Наибольший вклад распределен следующим образом: О.Л. Канделинская — концепция и дизайн исследования, анализ полученных результатов и их обсуждение, подбор и обзор литературы, написание статьи, привлечение финансирования; Е.Р. Грищенко — проведение экспериментов, обработка результатов и их анализ; Д.В. Григорьева — проведение экспериментов, их обработка и описание, обсуждение результатов; И.В. Горудко — подбор литературы, обсуждение результатов; Д.В. Горецкий — проведение экспериментов; Э.В. Дашкевич — подбор литературы, дизайн исследования, анализ и обсуждение результатов; Ж.В. Пешняк — проведение экспериментов, обработка результатов; Н.А. Бухвальд — проведение экспериментов, обработка результатов; О.М. Масловский — проведение полевых исследований, определение белорусских образцов мхов, оценка ресурсного потенциала белорусских мхов, обсуждение результатов; И.П. Сысой — проведение полевых исследований, оценка ресурсного потенциала, построение карты, анализ результатов; Ю.Г. Гигиняк, Е.В. Корзун — сбор коллекции мхов в Антарктике, фотографирование, пакетирование; В.А. Костевич — выделение и очистка тромбина; М.П. Андреев — обсуждение результатов; Л.Е. Курбатова — таксономический анализ собранной коллекции мхов, фотографирование мхов в Антарктике.

Информированное согласие на публикацию. Авторы получили письменное согласие доноров на публикацию результатов научных исследований.

Additional information

Funding source. The study has been supported by support of the subprogram “Development of the Belarusian Antarctic Station” of the State Program “Scientific and Innovative Activities of the National Academy of Sciences of Belarus” for 2021–2025. within the frame of Event 8. The customer did not influence the choice of material for publication, analysis and interpretation of data.

Conflict of interest. The authors declare that there is no potential conflict of interest requiring disclosure in this article.

Authors̕ contribution. All authors made significant contributions to concept development, research and paper preparation, read and approved the final version before publication. The largest contribution is distributed as follows: O.L. Kandelinskaya — the concept and design of the study, analysis of the results and their discussion, selection and review of literature, article writing, fundraising; H.R. Grischenko — conducting experiments, processing results and their analysis; D.V. Grigorieva — carrying out experiments, their processing and description, discussion of the results; I.V. Gorudko — selection of literature, discussion of results; D.V. Goretsky — conducting experiments; E.V. Dashkevich — literature selection, study design, analysis and discussion of results; J.V. Peshnyak — conducting experiments, processing results; N.A. Bukhvald — conducting experiments, processing results; O.M. Maslovsky — conducting field research, identifying Belarusian moss samples, assessing the resource potential of Belarusian mosses, discussing the results; I.P. Sysoi — conducting field research, assessing the resource potential, building a map, analyzing the results; Yu.G. Hihiniak, E.V. Korzun — collection of mosses in Antarctica photos, packaging; V.A. Kostevich — isolation and purification of thrombin; M.P. Andreev — the discussion of the results; L.E. Kurbatova — taxonomic analysis of the collected collection of mosses, photographs of mosses in Antarctica.

Consent for publication. The authors received written consent from donors for the publication of scientific research results

About the authors

Olga L. Kandelinskaya

Institute of Experimental Botany National Academy of Sciences of Belarus

Email: okandy@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-0364-9548
SPIN-code: 2189-4733

Cand. Sci. (Biol.), Assistant Professor, Leading Researcher, Sector of Plant Protein Metabolism and Functions

Belarus, Minsk

Helena R. Grischenko

Institute of Experimental Botany National Academy of Sciences of Belarus

Email: helegreen@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2163-6759

Senior Research Associate of Sector of Plant Protein Metabolism and Functions

Belarus, Minsk

Daria V. Grigorieva

Belarusian State University

Email: dargr@tut.by
ORCID iD: 0000-0003-0210-5474
SPIN-code: 2479-7785

Cand. Sci. (Biol.), Assistant Professor of the Department of Biophysics, Physics Faculty

Belarus, Minsk

Irina V. Gorudko

Belarusian State University

Email: irinagorudko@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4737-470X
SPIN-code: 8968-3125

Cand. Sci. (Biol.), Assistant Professor, Assistant Professor of the Department of Biophysics, Physics Faculty

Belarus, Minsk

Dmitriy V. Goreckiy

Institute of Experimental Botany National Academy of Sciences of Belarus

Email: goreckiydmitriy@yandex.by
ORCID iD: 0009-0000-8279-5094

Junior Research Associate of Sector of Plant Protein Metabolism and Functions

Belarus, Minsk

Eleonora V. Dashkevich

Republican Scientific and Practical Center for Transfusiology and Medical Biotechnologies of the Ministry of Health of the Republic of Belarus

Email: eleonoravdoc@gmail.com
ORCID iD: 0009-0000-9711-9371
SPIN-code: 1804-4804

Head of the Laboratory of Transfusiology

Belarus, Minsk

Janna V. Peshnyak

Republican Scientific and Practical Center for Transfusiology and Medical Biotechnologies of the Ministry of Health of the Republic of Belarus

Email: peshnyak@gmail.com
ORCID iD: 0009-0001-3709-3947
SPIN-code: 2496-2585

Leading Research Associate of the Laboratory of Transfusiology

Belarus, Minsk

Natallia A. Bukhvald

Republican Scientific and Practical Center for Transfusiology and Medical Biotechnologies of the Ministry of Health of the Republic of Belarus

Email: morskayaz300@mail.ru
ORCID iD: 0009-0003-4795-3271
SPIN-code: 8599-4504

Research Associate at the Laboratory of Transfusiology

Belarus, Minsk

Oleg M. Maslovsky

Institute of Experimental Botany National Academy of Sciences of Belarus

Email: oleg.maslovsky@tut.by
ORCID iD: 0009-0003-4976-5215
SPIN-code: 7756-0934

Cand. Sci. (Biol.), Head of Sector of Plant Cadastre

Belarus, Minsk

Irina P. Sysoi

Institute of Experimental Botany National Academy of Sciences of Belarus

Email: mastibrotskaya@gmail.com
ORCID iD: 0009-0001-7777-9433
SPIN-code: 1719-9379

Cand. Sci. (Biol.), Senior Research Associate of Sector of Plant Cadastre

Belarus, Minsk

Yury G. Hihiniak

Scientific and Practical Center for Bioresources National Academy of Sciences of Belarus

Email: antarctida_2010@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8376-3991

Cand. Sci. (Biol.), Assistant Professor, Leading Research Associate of the Sector for Monitoring and Cadastre of the Wildlife

Belarus, Minsk

Egor V. Korzun

Scientific and Practical Center for Bioresources National Academy of Sciences of Belarus

Email: natrix109@gmail.com
ORCID iD: 0009-0002-9318-9625
SPIN-code: 9108-1529

Senior Research Associate of Sector of monitoring and wildlife cadastre

Belarus, Minsk

Valeria A. Kostevich

Institute of Experimental Medicine; Academician Yu.M. Lopukhin Federal Scientific and Clinical Center for Physical and Chemical Medicine of the Federal Biomedical Agency

Email: hfa-2005@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1405-1322
SPIN-code: 2726-2921

Cand. Sci. (Biol.), Senior Research Associate of the Department of Molecular Genetics; Research Associate fellow of Department of Biophysics

Russian Federation, Saint Petersburg; Moscow

Mikhail P. Andreev

V.L. Komarov Botanical Institute of the Russian Academy of Sciences

Email: andreev@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-5688-0751
SPIN-code: 6075-6128

Head of the Laboratory of Lichenology and Bryology

Russian Federation, Saint Petersburg

Lyubov E. Kurbatova

V.L. Komarov Botanical Institute of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: kurbatovae@binran.ru
ORCID iD: 0000-0003-4695-5331
SPIN-code: 2032-8596

Senior Research Associate of the Laboratory of Lichenology and Bryology

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files