Scientific platform, development and implementation of effective immunodiagnosis of tuberculosis infection in the Russian Federation

Full Text

Список сокращений

АТР — аллерген туберкулезный рекомбинантный; ЛТИ — латентная туберкулезная инфекция; МБТ — микобактерии туберкулеза; ТБ — туберкулез; ФНО-α — фактор некроза опухоли альфа.

Туберкулез распространен во всем мире и является одной из 10 ведущих причин смерти. В глобальном масштабе заболеваемость туберкулезом снижается примерно на 2 % в год. Однако для достижения целей, сформулированных в Стратегии по ликвидации туберкулеза (ТБ), эти темпы необходимо ускорить до 4–5 % в год [1, 2]. Следует заметить, что, по данным Всемирной организации здравоохранения, треть населения земного шара инфицирована микобактериями туберкулеза (МБТ) и имеет латентную туберкулезную инфекцию (ЛТИ) [3, 4]. Согласно Российским Федеральным клиническим рекомендациям по диагностике и лечению ЛТИ и обновленным рекомендациям CDC (Центр по контролю и профилактике заболеваний, США) ЛТИ — это состояние стойкого иммунного ответа на антигены МБТ при отсутствии клинических проявлений активной формы ТБ. В настоящее время контроль за распространением туберкулезной инфекции остается одной из приоритетных задач здравоохранения в России. Это обусловливает необходимость постоянного мониторинга эпидемической ситуации с использованием индикаторов, отражающих различные аспекты распространения ТБ и эффективность противотуберкулезных мероприятий, включая своевременную иммунодиагностику туберкулезной инфекции [5, 6].

Согласно данным многочисленных международных исследований [7] кумулятивный риск развития ТБ равен 5 % в первые 5 лет после инфицирования МБТ и не превышает 5 % на протяжении последующей жизни. Наибольший риск как инфицирования ТБ, так и развития активного процесса возникает при контакте с больными, в мокроте которых МБТ обнаруживают методом бактериоскопии, как правило, у лиц с асоциальным поведением [8]. У лиц, инфицированных ВИЧ, вероятность развития активного ТБ возрастает в 20–30 раз. Высокому риску развития ТБ подвергаются также люди, страдающие другими заболеваниями, ослабляющими иммунную систему [9].

Ранняя диагностика туберкулезной инфекции — это прежде всего возможность контролировать распространение инфекции и предотвращать развитие заболевания у лиц, инфицированных МБТ. Туберкулезное инфицирование диагностируют с использованием иммунологических методов на основе выявления иммунологической памяти, сформированной в результате проникновения МБТ в организм пациента [10, 11]. Следует подчеркнуть, что иммунодиагностике туберкулезной инфекции уже более 120 лет. В 1890 г. Р. Кох создал туберкулин и началась эпоха применения пробы Манту с большим количеством проб [12].

В современных условиях стало очевидно, что результаты пробы Манту вносят значительную неопределенность в процесс диагностики туберкулезной инфекции и не позволяют качественно ее выявлять. Основной причиной этого является препарат для постановки реакции — туберкулин, который обладает низкой специфичностью и вызывает ложноположительные реакции прежде всего у BCG-вакцинированных людей [13]. Метаанализ 14 зарубежных исследований показал, что совокупная чувствительность туберкулиновой пробы составила только 71 %, что указывает на низкую прогностическую значимостью пробы Манту для диагностики туберкулезной инфекции [14]. Большой обзор зарубежной литературы с метаанализом, проведенным M. Rangaka и соавт. (2012) и экспертами TBNET (Tuberculosis Network European Trials Group), также показал низкую прогностическую значимостью пробы Манту в оценке риска развития ТБ [15, 16].

В мире используют в основном три вида туберкулина: датский PPD RT 23 (в большинстве стран), американский PPD-S и российский PPD-L, изготовленный из двух штаммов (humanus и bovis), но с другими туберкулинами его не сопоставляли.

В 1998 г. расшифрован геном М. tuberculosis. При сравнении генетической последовательности М. bovis и M. tuberculosis с аттенуированной BCG была обнаружена делеция трех геномных участков в вакцинном штамме (RD1, RD2 и RD3). В отличие от двух других, геномный участок RD1 (размером 9500 п. н.) не был выявлен ни в одном из субштаммов BCG, но обнаружен во всех протестированных лабораторных штаммах и клинических изолятах МБТ. Эти исследования открыли определенные перспективы в отношении разработки рекомбинантных препаратов для диагностики ТБ [17].

В зоне RD1 генома МБТ закодированы антигены (ESAT6 и CFP10), которые отсутствуют у M. bovis BCG и большинства нетуберкулезных микобактерий и экспрессируются при размножении микобактерий [18]. На модели животных показано, что экспрессия и секреция ESAT-6 и CFP10 тесно связаны с ростом МБТ и клеточно-опосредованные иммунные ответы на ESAT-6 тесно коррелируют с бактериальной репликацией в отношении бактериального числа и с учетом развития патологии [19]. Было доказано, что пептиды антигенов МБТ ESAT-6 и CFP-10 обладают повышенной специфичностью по сравнению с кожным туберкулиновым тестом. Доля субъектов, положительных либо по пулу пептидов, либо по слитому белку, обеспечивала максимальную чувствительность, будучи значительно выше, чем доля субъектов, положительных только по пептидам ESAT-6 (р = 0,007). Именно поэтому при разработке специфических диагностических тестов, дифференцирующих иммунный ответ при туберкулезной инфекции и вакцинации BCG, использована комбинация пептидов и гибридного белка ESAT-6 и CFP-10. Были разработаны клеточные тесты in vitro, основанные на измерении продуцирования гамма-интерферона Т-лимфоцитами крови в ответ на стимуляцию этими антигенами (IGRA-тесты — Interferon Gamma Release Assay). Специфичность тестов достигает 99 % [20], чувствительность — 98,0 % [21].

Возможность использования этих белков в качестве реагентов для постановки кожной пробы была детально изучена в лабораториях США, Германии и Дании [22–25]. Первыми в мире кожный тест на основе двух белков для клинического применения разработали специалисты НИИ молекулярной медицины Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова под руководством академика РАМН и РАН М.А. Пальцева и члена-корреспондента РАН профессора В.И. Киселева — препарат аллерген туберкулезный рекомбинантный (АТР, Диаскинтест) [26, 27]. Гены CFP10 и ESAT6 были клонированы в экспрессионный вектор pET22b(+) (Novagene). Для использования в выделении металлхелатного носителя в С-концевую область молекулы «диаскинтест» были введены шесть остатков His. Полученные клетки Escherichia coli продуцировали гибридный белок ожидаемого молекулярного веса (около 27 кДа). Лабораторный метод выделения рекомбинантного белка из клеток штамма-продуцента состоял из следующих стадий: разрушение клеток-продуцента; извлечение целевого белка из клеточного лизата в раствор и рефолдинг рекомбинантного белка «диаскинтест»; его хроматографическая очистка и перевод в буфер готовой лекарственной формы. Для выделения рекомбинантного белка «диаскинтест» культуру клеток продуцента отделяли от культуральной среды центрифугированием, полученную биомассу клеток разрушали в буфере, содержащем 6 М гуанидин хлорида.

Поскольку молекула в С-концевой области содержала полигистидиновый тракт, оказалось возможным применение металлхелатной хроматографии, но основной обогащающей стадии. Причем хроматографирование на этой стадии было выстроено так, чтобы от нанесения образца до элюции плавно снижать хаотропность подвижной фазы. Нанесение рекомбинантного белка в денатурирующих условиях предотвращало связывание колонкой гетеро- и гомоолигомерных примесей и гарантировало освобождение от основного пула белков штамма-продуцента. Снижение хаотропности подвижной фазы от 6 М гуанидин хлорида до 150 мМ фосфатного буфера определило успешный рефолдинг молекулы белка непосредственно на хроматографическом носителе.

В качестве промежуточной стадии очистки использовали анионный обмен. На этой стадии выделения концентрация белков штамма-продуцента снижалась до 10–100 нг/мл.

Для удаления бактериальных эндотоксинов была введена обращенно-фазовая стадия. Эта стадия позволила снизить уровень эндотоксинов Escherichia coli более чем в 10 000 раз. Отделение от следовых количеств родственных олигомерных примесей и перевод чистого целевого белка в буфер готовой лекарственной формы осуществляли на гель-фильтрационной колонке. Мономерную фракцию рекомбинантного белка «диаскинтест» подвергали стерилизующей фильтрации и разбавляли стерильным буфером готовой формы до концентрации 2 мкг/мл. В мономерной фракции концентрированного препарата определяли концентрацию рекомбинантного белка, количество белков штамма-продуцента методом иммуноферментного анализа, в стандартном LAL-тесте — уровень эндотоксинов Escherichia coli методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) — хроматографическую чистоту целевого белка в концентрированном растворе (около 1 мг/мл).

Кроме основных аналитических процедур технологического контроля при разработке методов получения чистого рекомбинантного белка были проведены также деградация N-концевой аминокислотной последовательности рекомбинантного белка «диаскинтест» по Эдману и масс-спектрометрическое исследование пептидной карты целевого белка. Рекомбинантный белок подвергали гидролизу трипсином, продукты гидролиза анализировали масс-спектрометрическими методами. В результате структурных исследований была показана идентичность N-концевой аминокислотной последовательности гибридного белка нативной последовательности CFP10. Установлено, что пептиды трипсинового гидролизата относятся только к аминокислотной последовательности рекомбинантного белка «диаскинтест» со 100 % покрытием последней.

При введении в макроорганизм кожных диагностикумов фагоцитирующие клетки взаимодействуют с антигеном, выделяются цитокины, отмечается дополнительный приток клеточных элементов, формируется папула.

По данным разработчиков кожного теста с АТР [28], для определения гиперчувствительности замедленного типа к МБТ в качестве модели использовали морских свинок, которых живыми внутрибрюшинно сенсибилизировали M. bovis BCG, M. avium и МБТ Н37RA в количестве 10⁷ микробных клеток в 0,2 мл фосфатного буфера (рН 7,2). На шестой неделе после сенсибилизации в выбритый участок кожи экспериментальным животным внутрикожно вводили по 2 мкг антигенов в 0,1 мл фосфатно-солевого буфера и по 10 ЕД туберкулина, полученного из штаммов M. bovis BCG, M. avium и M. tuberculosis (PPD-b = M. bovis BCG; PPD-a = M. avium; PPD-t = M. tuberculosis). Через 24 ч оценивали диаметр эритемы, образовавшейся в месте инъекции. Диагностический реагент для кожной пробы на основе рекомбинантного белка esat6-cfp10 не давал перекрестных реакций у морских свинок, иммунизированных M. bovis BCG и M. avium, в то время как туберкулины, полученные из других видов микобактерий, давали перекрестные реакции. Таким образом, препарат на основе белка esat6-cfp10 позволяет достоверно отличить повышенную чувствительность замедленного типа, обусловленную инфицированием M. tuberculosis, от реакций, связанных с вакцинальным иммунитетом (BCG) и инфекцией, вызванной другими видами микобактерий.

Доклиническое исследование полуфабриката — концентрата препарата Диаскинтест, предназначенного для изготовления стандартных разведений, проведено на 315 лабораторных животных (мыши, морские свинки). Препарат прошел все испытания на соответствие (подлинность, стерильность, пирогенность, отсутствие эндотоксинов — лал-тест, токсичность, специфическая безвредность, шоковая реакция), в нем определены содержание белка и его молекулярная масса. С учетом того что препарат является генно-инженерным, подтверждена стабильность штамма-продуцента. Доклинические испытания препарата прошли в соответствии с требованиями РД 42-28-8-89 «Доклинические испытания новых медицинских иммунобиологических препаратов» и требованиями Государственного фармакологического комитета, предъявляемыми к изучению токсического действия новых лекарственных средств [29, 30]. По данным И.В. Бочаровой и А.В. Демина, исследовавших на морских свинках препарат Диаскинтест, у животных, не вакцинированных BCG и инфицированных вирулентным штаммом микобактерий, сначала (на 3-й неделе) появляется ответная реакция на Диаскинтест. Таким образом, уже в ходе доклинических исследований было установлено, что получен прогностически новый кожный тест, который может идентифицировать высокий риск развития активного ТБ в ближайшем будущем [31].

По применению препарата Диаскинтест в клинической практике были проведены многоцентровые клинические исследования I, II, III фазы. Полученные результаты обосновывают использование кожной пробы с препаратом АТР с целью диагностики туберкулеза и оценки активности процесса; дифференциальной диагностики туберкулеза; дифференциальной диагностики поствакцинального и инфекционного иммунного ответа (гиперчувствительности замедленного типа); наблюдения за эффективностью лечения в комплексе с другими методами [32, 33]. В мультицентровом сплошном исследовании по безопасности применения Диаскинтеста для диагностики ТБ было установлено, что он безопасен и не вызывает необычных реакций [34]. Проба с Диаскинтестом обладает высокой информативностью (чувствительность — 98–100 %, специфичность — от 90 до 100 %). Неспецифических аллергических реакций на введение Диаскинтеста не выявлено [35].

В отечественных и международных электронных базах данных представлено более 200 научных публикаций, подтверждающих обоснованность и эффективность применения Диаскинтеста в клинической практике.

Одно из первых научных исследований проведено Л.В. Слогоцкой и соавт., сотрудниками Московского научно-практического центра борьбы с ТБ (МНПЦБТ), в 2006–2010 гг. В результате обследования 732 взрослых больных ТБ органов дыхания и 945 детей определена высокая чувствительность и специфичность теста Диаскинтест в различных клинических ситуациях. Авторы показали, что кожная проба с АТР обладает высокой чувствительностью у больных ТБ детей и подростков (в целом 96,5 %, 95 % ДИ 94,5–97,8) [36]. Кроме того, Диаскинтест отличался высокой специфичностью: 94,6 % отрицательных реакций при нетуберкулезных заболеваниях легких и 89,5 % при внелегочных локализациях, что значительно превышает специфичность пробы Манту [37].

Под руководством специалистов НИИ фтизиопульмонологии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова в 2008–2014 гг. выполнено исследование последовательного (четырехэтапного) применения АТР на территории Москвы, Самарской и Рязанской областей, а в последующем — в 72 регионах Российской Федерации. Было доказано, что пробы с препаратом Диаскинтест в качестве диагностического и скринингового метода обследования детей и подростков в условиях противотуберкулезной и общей лечебной сети способствуют выявлению лиц с высоким риском заболевания ТБ, что значительно повышает эффективность работы фтизиопедиатров по раннему обнаружению туберкулезной инфекции [38, 39].

По данным В.И. Литвинова, чувствительность этого теста в группе больных активным ТБ детей и подростков достигала 95 %. В свою очередь специфичность метода у здоровых лиц, вакцинированных BCG, также составляла 95 % [40]. Научные исследования консультативно-диагностического центра и отделения терапии туберкулеза легких ФГБУ «СПбНИИФ» Минздрава России подтвердили высокую информативность теста при обследовании 112 подростков с подозрением на ТБ. У 96,7 % больных ТБ зарегистрирована положительная реакция на пробу с Диаскинтестом [41].

Необходимо отметить, что совершенствование мероприятий по раннему выявлению туберкулезной инфекции, особенно в группах риска по развитию заболевания, представляет важную задачу фтизиатрии. По данным Л.В. Слогоцкой и соавт., в 2013 г. проба с Диаскинтестом была проведена у 131 000 детей Москвы, при этом выявляемость ТБ среди лиц с положительными реакциями на АТР составила 5,0 % обследованных, в то время как выявляемость ТБ среди туберкулиноположительных детей была в 40 раз меньше — 0,13 %, что свидетельствует о высокой специфичности пробы с АТР. Такая высокая чувствительность метода способствует выявлению подавляющего числа лиц, больных ТБ. Все это привело к тому, что в первые годы внедрения пробы с АТР в Москве показатель заболеваемости ТБ детей и подростков резко увеличился, а в дальнейшем стал снижаться за счет своевременного выявления лиц с латентной туберкулезной инфекцией и проведения профилактических мероприятий, предупреждающих развитие активной формы заболевания [42].

Переходу ЛТИ в заболевание ТБ способствует эпидемический фактор — контакт с больным ТБ. В связи с чем контактные лица, в частности дети, составляют значимую группу риска по заболеванию ТБ, поэтому возрастает роль скрининговых методов обследования детей на туберкулезную инфекцию. По данным В.А. Аксеновой [43], существует прямая корреляция положительной реакции на пробу с АТР у детей с ЛТИ и контактированием с больным, выделяющим МБТ, в отличие от контактирования с больным без бактериовыделения или если в окружении детей отсутствуют больные туберкулезом. В работе Н.А. Барминой и соавт. показано, что положительная проба с АТР у детей и подростков в очагах туберкулезной инфекции с бактериовыделением с множественной лекарственной устойчивостью МБТ регистрировалась в 2,6 раза чаще, чем в очагах туберкулезной инфекции без бактериовыделения (p < 0,05). Гиперергические реакции на пробу с АТР в очаге туберкулезной инфекции встречались у детей достоверно чаще, чем при постановке пробы Манту (p < 0,05). Таким образом, кожная проба с АТР может служить индикатором эпидемической отягощенности очага туберкулезной инфекции и эпидемической обстановки по ТБ в целом [44].

В работе [45] проведен скрининг на ТБ пробой АТР 832 пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника, 446 (53,6 %) из которых затем обследовали на фоне лечения ингибиторами фактора некроза опухоли альфа (ФНО-α). На этапе скрининга и мониторинга положительный результат пробы с АТР был отмечен у 29 из 777 обследованных пациентов (3,7 %, 95 % ДИ 2,4–5,0). После выявления положительной конверсии на фоне лечения ингибиторами ФНО-α превентивное противотуберкулезное лечение проведено 19 (67,8 %, 95 % ДИ 49,8–85,9 %) пациентам. Среди 19 пациентов, получивших лечение ингибиторами ФНО-α и противотуберкулезное лечение по показаниям, не было ни одного случая развития активного туберкулеза. Все это свидетельствует, что проведение эффективных иммунологических проб на этапе скрининга и на фоне терапии ингибиторами ФНО-α у больных позволяет обнаружить ранние признаки туберкулезного инфицирования в виде появления иммунного ответа на специфические туберкулезные антигены, а также контролировать состояние выявленной ранее ЛТИ. Важным преимуществом Диаскинтеста является и возможность оценки эффективности лечения ТБ. Так, исследования [46, 47] показали, что у всех пациентов, излеченных от ТБ, результат на пробу Диаскинтест оказался отрицательным, что свидетельствует об эффективности лечении в конкретных случаях.

Согласно С.Г. Грачевой, Л.В. Лебедевой и другим исследователям при массовой туберкулинодиагностике в 14-летнем возрасте 72,4 % детей положительно реагируют на туберкулин по пробе Манту. Однако лишь 33,9 % оказывались инфицированными МБТ, а в 45,2 % случаев наблюдался поствакцинальный иммунный ответ. Низкая специфичность туберкулинодиагностики в условиях тотальной вакцинации BCG детского населения приводит к тому, что только 10–15 % детей и подростков с положительной реакцией на пробу Манту обследуют в противотуберкулезном диспансере и часть случаев ТБ остается невыявленной [48].

Внедрение в практику фтизиатров с 2008 г. кожного теста in vivo Диаскинтест повысило качество диагностики туберкулезной инфекции в различных возрастных группах. Чувствительность теста при сплошном исследовании составила 98 %. Основное преимущество современного теста заключается в отсутствии ложноположительных реакций, и папула любого размера расценивается как положительный результат. В этом случае не требуется дополнительного обследования неинфицированных лиц, а превентивную терапию проводят только лицам с высоким риском развития ТБ [49].

Необходимо отметить, что в Дании создан аналогичный российскому кожный тест с препаратом C-Tb из тех же двух белков — ESAT-6, CFP-10, но только в соотношении 1 : 1 в отличие от российского. По данным клинических испытаний на выборке здоровых вакцинированных BCG добровольцах (n = 151), его специфичность составила 99,7 %. При этом специфичность туберкулина PPD RT23 была 63 %. Следует заметить, что проба с препаратом Диаскинтест обладает более высокой чувствительностью, вероятно обусловленной более высокой дозой (в 2 раза выше — 0,2 мкг, чем у датского, — 0,1 мкг). Результаты доклинических и клинических исследований пробы с препаратом Диаскинтест, проводимые с разными его дозами, показали, что доза 0,1 мкг обладает значительно более низкой чувствительностью, чем доза 0,2 мкг, это и объяснило выбор последней для клинической практики [50].

Выводы

Результаты проведенных в последние годы исследований по оценке эффективности иммунодиагностики в РФ дают основание полагать, что внедрение современного скринингового метода диагностики туберкулезной инфекции с использованием препарата Диаскинтест значительно повысит качество работы врачей по раннему выявлению различных проявлений туберкулезной инфекции и существенно сократит материальные затраты государства на борьбу с туберкулезом. Для сохранения положительных тенденций необходимо дальнейшее повышение эффективности противотуберкулезных мероприятий, прежде всего работы по профилактике и раннему выявлению туберкулеза у детей и подростков.

Конфликт интересов. Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

Dmitry A. Kudlay

Author for correspondence.
Email: D624254@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1878-4467

MD, PhD, DSc (Medicine), Professor of the Pharmacology Department, Institute of Pharmacy, Leading Researcher at the Laboratory of Personalized Medicine and Molecular Immunology

References

Supplementary files