Mechanisms of the influence of adiponectin on apolipoproteins A-1 and B production by human hepatocytes

Dmitriy A. Tanyanskiy; Танянский Дмитрий Андреевич; Ella B. Dizhe; Диже Элла Борисовна; Galina N. Oleinikova; Олейникова Галина Николаевна; Vladimir S. Shavva; Шавва Владимир Станиславович; Aleksandr D. Denisenko; Денисенко Александр Дорофеевич

doi:10.17816/MAJ62892

Механизмы влияния адипонектина на продукцию аполипопротеинов А-1 и B гепатоцитами человека

Авторы: Танянский Д.А.¹, Диже Э.Б.¹, Олейникова Г.Н.¹, Шавва В.С.¹, Денисенко А.Д.¹
Учреждения:
1. Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Институт экспериментальной медицины»
Выпуск: Том 21, № 1 (2021)
Страницы: 39-45
Раздел: Оригинальные исследования
Статья опубликована: 10.06.2021
URL: https://journals.eco-vector.com/MAJ/article/view/62892
DOI: https://doi.org/10.17816/MAJ62892
ID: 62892

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ
Доступ закрыт

Доступ предоставлен
Доступ закрыт

Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Цель исследования — выяснить механизмы влияния адипонектина на продукцию аполипопротеинов (апо) А-1 и В гепатоцитами человека.

Материалы и методы. Исследование проводили на клетках линии гепатомы человека HepG2. Экспрессию гена apoA-1 оценивали на уровне мРНК методом количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией, продукцию апоВ — методом иммуноферментного анализа. Активность липогенеза определяли по включению меченого ¹⁴С-ацетата в триглицериды, по экспрессии генов липогенеза на уровне мРНК и по общему содержанию триглицеридов в клетках. Для выяснения участия сигнальных путей использовали метод РНК-интерференции.

Результаты. Нокдаун генов специфических рецепторов, АМФ-активируемой протеинкиназы и регулируемых ею факторов транскрипции приводил к отмене адипонектин-зависимой стимуляции экспрессии гена apoA-1 в гепатоцитах. Адипонектин не влиял на липогенез и продукцию апоВ в базальных условиях, но при этом подавлял данные процессы, индуцированные добавлением олеата.

Заключение. Адипонектин стимулирует продукцию апоА-1 в гепатоцитах путем индукции транскрипции гена apoA-1 и подавляет секрецию данными клетками апоВ посредством влияния на липогенез. Указанные воздействия могут лежать в основе влияния адипонектина на обмен липопротеинов.

Ключевые слова

адипонектин, аполипопротеины, гепатоциты, ядерные рецепторы, липогенез, метаболический синдром

Полный текст

Список сокращений

апо — аполипопротеин; ПЦР-ОТ — полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией; ТГ — триглицериды; AdipoRs — рецепторы адипонектина (от англ. adiponectin receptor); AMPK — АМФ-активируемая протеинкиназа (от англ. AMP-activated protein kinase); BSA — бычий сывороточный альбумин; FCS — фетальная телячья сыворотка; LXRα — печеночные рецепторы Х альфа (от англ. liver X receptor alpha); PPARα — ядерный рецептор активаторов пролиферации пероксисом альфа (от англ. peroxisome proliferator-activated receptor alpha)

Введение

Одним из главных факторов риска атеросклероза является метаболический синдром, комплекс патогенетически взаимосвязанных нарушений, таких как ожирение, инсулинорезистентность, дислипопротеинемия, гипертензия [1]. В формировании указанных расстройств участвуют белки жировой ткани, адипокины [2]. Из всех адипокинов наибольший интерес представляет адипонектин, который повышает чувствительность тканей к инсулину, стимулирует окисление жирных кислот и тем самым способен благоприятно воздействовать на спектр липопротеинов плазмы [3, 4]. Метаболические эффекты адипонектина реализуются путем активации специфических рецепторов 1-го и 2-го типов (AdipoR1/2), передающих сигнал на АМР-активируемую протеинкиназу (АМРK) и ядерные рецепторы активаторов пролиферации пероксисом (PPARα) [3].

Другим способом влияния адипонектина на обмен липопротеинов является воздействие на продукцию аполипопротеинов (апо) гепатоцитами. Было показано, что адипонектин повышает продукцию гепатоцитами апоА-1, основного белка липопротеинов высокой плотности, и уменьшает продукцию гепатоцитами апоВ, основного белка липопротеинов низкой плотности [4–6]. В то же время механизмы указанных воздействий адипонектина остаются малоизученными.

В связи с этим цель исследования состояла в выяснении механизмов влияния адипонектина на продукцию апоА1 и апоВ гепатоцитами человека.

Материалы и методы

Исследование проводили на клетках линии гепатомы человека HepG2 (Российская коллекция клеточных культур Института цитологии РАН). Клетки культивировали на среде DMEM с добавлением 4 мМ глутамина, 0,1 мг/мл гентамицина (все — «Биолот», Россия), 10 % фетальной телячьей сыворотки (FCS) (Hyclone, США) в атмосфере 5 % СО₂ при температуре 37 °С. Клетки высевали на 96-луночные культуральные планшеты (Sarstedt, Германия) с плотностью 1 ∙ 10⁴ клеток/см² и выращивали на полной среде в течение 2–3 дней до субконфлюэнтности (~70–80 %). Далее культуральную среду заменяли на среду, не содержащую FCS, с добавлением адипонектина (кат. номер RD172023100-C, Biovendor, Чехия) в концентрациях 10 или 30 мкг/мл, либо 1 мМ AICAR (5-аминоимидазол-4-карбоксамид-1-β-D-рибофуранозид) (Calbiochem, США), либо фосфатно-солевого буфера на 24 ч. В ряде опытов на весь срок инкубации с указанными агентами добавляли комплекс бычьего сывороточного альбумина (BSA) с 290 μМ олеата (все — «Сигма», США) либо очищенный от жирных кислот BSA в конечных концентрациях 5 г/л. После окончания срока инкубации клетки собирали на выделение РНК («Евроген», Россия) либо на определение содержания внутриклеточного белка (BCA Protein Assay, ThermoScientific, США) и триглицеридов (ТГ) (энзиматические наборы Randox, Великобритания). Культуральные среды клеток HepG2 отбирали для определения концентрации апоВ с помощью иммуноферментного анализа.

Трансфекцию клеток HepG2 миРНК проводили с использованием реагента Липофектамин RNAiMAX (Invitrogen, США) в соответствии с инструкцией производителя. Клетки были трансфецированы в течение 72 ч и содержались на среде DMEM c 10 % FCS. Последние сутки трансфекции клетки инкубировали с 10 мкг/мл адипонектина, либо с 1 мМ AICAR, либо с фосфатно-солевым буфером в бессывороточных условиях. Затем клетки лизировали на определение экспрессии генов при помощи полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ПЦР-ОТ). Эффективность трансфекции проверяли при помощи ПЦР-ОТ. Для трансфекции применяли миРНК к AdipoR1, AdipoR2 [7], α1/2-субъединицам AMPK [8] (все — «Синтол», Россия), PPARα (sc-36307), LXRα (печеночные рецепторы-Х) (sc-38828) и неспецифическую миРНК (sc-37007) (все — Santa Cruz, США).

Выделение РНК, обратную транскрипцию и ПЦР в режиме реального времени проводили как описано ранее [9, 10]. Относительное содержание мРНК искомых генов нормировали на уровни экспрессии генов «домашнего хозяйства» (β-актина, рибосомального белка RPLP0 и циклофилина А).

Синтез ТГ в клетках оценивали по включению в ТГ ¹⁴С-ацетата. Для этого к клеткам HepG2 на 5 ч добавляли 1 μCi ¹⁴С-ацетата натрия (удельная радиоактивность — 20 000 имп/мин/нмоль) в присутствии 10 либо 30 мкг/мл адипонектина или 10 мкг/мл BSA (отрицательный контроль) в бессывороточных условиях. Затем из клеток экстрагировали липиды смесью гексан – изопропанол (3 : 2 по объему) и разделяли их методом тонкослойной хроматографии в системе гептан — изопропиловый эфир — уксусная кислота (15 : 10 : 1 по объему) на алюминиевых пластинах Kieselgel 60 (Merck, Германия). После проявки йодом (J₂) пятна, соответствующие фракции ТГ, вырезали, затем помещали в виалы и заливали сцинтилляционной жидкостью для подсчета радиоактивности (RakBeta, LKB, Швеция). Делипидированные клетки заливали 0,2 М NaOH для определения концентрации белка.

Результаты исследования представлены в виде средних значений ± стандартная ошибка среднего (mean ± SEM) 3–4 независимых экспериментов. Статистический анализ различий между контрольной и опытными группами выполняли с использованием критерия Даннета. Различия считали достоверными при p < 0,05. Статистический анализ осуществляли в программе GraphPad Prism v.6 (США).

Результаты и их обсуждение

Продукция гепатоцитами апоА-1 регулируется главным образом на транскрипционном уровне с участием факторов транскрипции, которые взаимодействуют со специфическими участками, локализованными в 5’-регуляторной области данного гена. Активаторами транскрипции гена apoA-1 являются PPARα и HNF4α (ядерный фактор гепатоцитов 4α), в то время как LXR подавляют экспрессию данного гена [9]. В свою очередь активность в гепатоцитах PPARα и LXRα контролирует AMPK [11, 12].

С целью выяснения участия указанных сигнальных молекул в адипонектин-зависимой активации экспрессии гена apoA-1 в гепатоцитах мы применили метод РНК-интерференции. Выяснилось, что нокдаун генов, кодирующих AdipoRs, киназу AMPK, а также ядерные рецепторы PPARα и LXRα, приводил к отмене влияния адипонектина на экспрессию гена apoA-1 на уровне мРНК (см. таблицу). Как и адипонектин, активатор АМРК AICAR стимулировал экспрессию гена apoA-1 в гепатоцитах, и данный эффект также отменялся на фоне нокдауна генов, кодирующих AMPK и оба ядерных рецептора (см. таблицу). Полученные данные свидетельствуют об участии адипонектиновых рецепторов обоего типа, АМРК и ядерных рецепторов PPARα и LXRα в регуляции экспрессии гена apoA-1 под действием адипонектина.

Таблица / Table

Влияние адипонектина (10 мкг/мл) на экспрессию гена apoA-1 в клетках гепатомы человека линии HepG2 на фоне нокдауна генов AdipoRs, AMPK, PPARα и LXRα

Effect of adiponectin (10 mkg/ml) on the expression of the apoA-1 gene in human hepatoma HepG2 cells upon the knockdown of the AdipoRs, AMPK, PPARα, and LXRα genes

Подавляемый ген	Действующий агент	мРНК апо А-1, доля (%) от контроля
–	Контроль	100,0 ± 1,1
	Адипонектин	150,5 ± 3,5*
	AICAR	140,3 ± 3,3*
AdipoR1	Контроль	117,5 ± 11,2
AdipoR1	Адипонектин	120,3 ± 12,8
AdipoR2	Контроль	138,0 ± 15,6
AdipoR2	Адипонектин	131,6 ± 16,8
Субъединицы α1-AMPK и α2-AMPK	Контроль	44,3 ± 1,9*
	Адипонектин	35,7 ± 1,3
	AICAR	30,1 ± 2,1
PPARα	Контроль	131,8 ± 4,0
	Адипонектин	124,3 ± 2,5
	AICAR	122,0 ± 2,1
LXRα	Контроль	191,4 ± 7,0*
	Адипонектин	186,9 ± 1,3
	AICAR	148,5 ± 10,2

Примечание. Представлены результаты ПЦР-ОТ в реальном времени относительного содержания мРНК апоА-1, средние ± SEM (n = 12–16). * p < 0,05 против контроля с неспецифической миРНК.

В отличие от апоА-1, продукция апоВ регулируется в основном на посттрансляционном уровне стабилизацией данного белка липидным окружением [13]. В связи с этим наиболее вероятно, что адипонектин воздействует на продукцию апоВ-содержащих липопротеинов, влияя на синтез ТГ. Адипонектин понижает активность липогенеза в гепатоцитах крысы и быка [14, 15], хотя эти данные не подтверждаются в исследованиях, проведенных на гепатоцитах человека [6]. Указанные противоречия могут быть обусловлены разной видовой принадлежностью гепатоцитов, а также различиями в активности липогенеза в изучаемых клеточных моделях. Согласно нашим данным адипонектин не влияет на базальный липогенез в клетках HepG2 (диаграммы рисунка a и b), но при этом в концентрации 30 мкг/мл уменьшает количество ТГ в клетках на фоне нагрузки клеток олеатом (диаграмма c). Описанные эффекты адипонектина на синтез в клетках ТГ сопровождались изменением секреции клетками апоВ (диаграмма d). Полученные данные подтверждают гипотезу, что адипонектин вмешивается в продукцию гепатоцитами апоВ посредством влияния данного адипокина на липогенез.

Рисунок. Влияние адипонектина на синтез триглицеридов и секрецию аполипопротеина В клетками гепатомы человека линии HepG2: а — синтез триглицеридов оценивали по включению 14С-ацетата в триглицеридах; количество импульсов в минуту, нормированное на содержание клеточного белка, относительно среднего значения в контроле, принятого за 100 %; b — экспрессия генов липогенеза ACC-1 (ацетил-КоА-карбоксилазы) и FASN (синтетазы жирных кислот), метод — полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией; ТО-901317 — активатор липогенеза, агонист LXR [12], положительный контроль; c — содержание триглицеридов в лизатах клеток (энзиматический метод), нормированное на уровень внутриклеточного белка; Н. д. — триглицериды указанным методом не детектировались; d — концентрации аполипопротеина В на культуральных средах гепатоцитов (иммуноферментный анализ), нормированные на содержание внутриклеточного белка, относительно контроля, принятого за 100 % (абсолютные значения концентраций аполипопротеина В составляли ~5–50 нг/мкг клеточного белка); средние ± SEM (a – n = 8, b – d – n = 12–16). * p < 0,05, ** p < 0,005 против контроля, # p < 0,05 против контроля с добавлением олеата. Адипо — адипонектин, ТГ — триглицериды, апоВ — аполипопротеин В

Figure. Effect of adiponectin on TG synthesis and apo B secretion in human hepatoma HepG2 cells. a — synthesis of TG was evaluated by the inclusion of ¹⁴C-acetate into TG. The results are presented as counts per minutes, normalized for the content of cellular protein, relative to the average value in the control, taken as 100%. b — The expression level of lipogenesis genes ACC-1 (acetyl-CoA-carboxylase) and FASN (fatty acid synthase), measured by the reverse transcription PCR assay. TO-901317 — LXR agonist, the activator of lipogenesis [12], positive control. c — TG content in cell lysates (enzymatic method), normalized for the level of intracellular protein. N. d. — TG were not detected by this method. d — apo B concentrations in hepatocytes’ culture media (ELISA assay), normalized for the content of intracellular protein, relative to the control taken as 100% (absolute values of apo B concentrations were ~5-50 ng/mkg of cellular protein). Mean values ± SEM are given (a – n = 8, b – d – n = 12–16). * p < 0.05, ** p < 0.005 versus the control, ^#p < 0.05 versus control with oleate treatment. Adipo — adiponectin, TG — triglycerides, apoB — apolipoprotein B

Подавление адипонектином синтеза ТГ может быть обусловлено, с одной стороны, активацией АМРК с дальнейшим снижением активности генов липогенеза на транскрипционном и посттрансляционном уровнях [3, 16], а с другой — активацией PPARα и коактиватора транскрипции PGC1α, повышающих на транскрипционном уровне окисление ЖК [3, 17].

Заключение

Суммируя вышеизложенное, можно заключить, что адипонектин через сигнальные пути обоих адипонектиновых рецепторов, включающие активацию АМРК и изменение активности ядерных рецепторов PPARα и LXRα, влияет на продукцию аполипопротеинов в гепатоцитах. Указанные воздействия, наряду с активацией адипонектином окисления жирных кислот и повышением чувствительности к инсулину в периферических тканях, могут обеспечивать благоприятные эффекты этого адипокина на уровень липопротеинов в крови и на формирование дислипопротеинемии при метаболическом синдроме.

Дополнительная информация

Благодарность. Авторы приносят благодарность старшему научному сотруднику А.О. Шерстобитову (ИЭФиБ РАН им. И.М. Сеченова) за помощь в работе с радиоактивной меткой.

Финансирование. Исследование проведено при финансовой поддержке РФФИ в рамках проекта № 12-04-01410-а.

Соблюдение этических норм. Проведение данного исследование не связано с работой на животных и клиническом материале.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.