Экспериментальное исследование раннего защитного действия живой гриппозной вакцины против гетерологичной гриппозной инфекции

Полный текст

Обоснование

Проблема вакцинопрофилактики инфекций обозначена Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) в качестве приоритетного направления развития медико-биологической науки [1]. Острые респираторные заболевания занимают важное место среди проблем общественного здравоохранения в связи с высокой заболеваемостью и смертностью [2]. Ведущие российские специалисты по гриппу и эксперты ВОЗ считают, что на фоне снижения популяционного иммунитета к гриппу во время пандемии COVID-19 повышается опасность заражения вирусами «птичьего гриппа», которые стали более вирулентными и преодолели межвидовой барьер [3, 4]. В России в 2022 г. зарегистрированы вспышки заболеваний среди домашних и диких птиц, вызванные вирусами A/H5N1. При заражении вирусами гриппа A/H5N1 смертность достигает 60 % [5]. В связи с этим востребована разработка универсальных гриппозных вакцин, защищающих как от сезонного, так и от высокопатогенного «птичьего» гриппа.

Использование живой гриппозной вакцины (ЖГВ) при интраназальном введении представляется очень важным в текущей эпидемической ситуации. Во-первых, крайне актуально проводить вакцинацию против гриппа в период подъема SARS-CoV-2, так как было показано, что коинфекция вирусом гриппа значительно ухудшает течение COVID-19 [6]. Во-вторых, использование интраназальной ЖГВ позволяет проводить вакцинацию больших групп населения. Наконец, только ЖГВ способны прерывать передачу инфекционного вируса, в отличие от инактивированных вакцин, что неоднократно было показано в крупномасштабных исследованиях [7, 8]. Одним из объяснений этого эффекта может быть индукция ранних цитокинов и интерферона I типа (ИНФ альфа) при интраназальном введении ЖГВ. Ранее было показано, что вакцинный кандидат на основе A/PR8/34(H1N1) с делетированным геном NS стимулирует выработку ИНФ в куриных эмбрионах выше, чем дикий вирус A/PR8, и может обеспечить защиту от заражения еще до развития специфического адаптивного иммунитета [9]. Показано, что применение интраназальной ЖГВ в период циркуляции сезонных респираторных инфекций оказывает косвенное воздействие, защищая от респираторных вирусов, отличных от гриппа, и это связано с изменением цитокинового профиля [10]. В наших предыдущих исследованиях на мышах была оценена ранняя защита, обеспечиваемая ЖГВ против заражения гомологичным вирусом гриппа [11]. Улучшение защиты сопровождалось снижением содержания инфекционных вирусов в легких и коррелировало с повышением экспрессии ИФН-α в легких [11, 12].

Цель — экспериментальное изучение механизмов ранней защиты против гетерологичной гриппозной инфекции после иммунизации живой гриппозной вакциной.

Материалы и методы

Вирусы

Вакцинный вирус гриппа A/17/Южная Африка/2013/01(H1N1)pdm09, а также вирусы A/Южная Африка/3626/2013(H1N1)pdm09 и A/Индонезия/5/2005(H5N1) IDCDC-RG2 были получены из коллекции отдела вирусологии ФГБНУ «ИЭМ». Все вирусы культивировали в куриных эмбрионах как описано ранее [13], аликвотировали и хранили при температуре –70 °C до использования.

Изучение продукции ранних цитокинов в клеточной культуре THP-1

Мы использовали клеточную линию моноцитов-макрофагов человека (THP-1) для оценки раннего производства цитокинов in vitro. Клетки THP-1 культивировали в 24-луночных планшетах для клеточных культур из расчета 3,0 × 10⁶ клеток на лунку со средой RPMI (Мемориальный институт Розуэлла, Буффало, Нью-Йорк, США), содержащей 10 % телячьей сыворотки, 100 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Перед экспериментом клетки инкубировали при 37 °C и 5 % CO₂ в течение 48 ч. Клетки инокулировали 6 lg 50 % эмбриональных инфекционных доз (ЭИД₅₀) на 1 мл вирусов A/17/Южная Африка/2013/01(H1N1)pdm09 и родительского штамма «дикого типа» A/Южная Африка/3626/ 2013(H1N1)pdm09. В качестве положительного контроля мы использовали агонист Toll-подобного рецептора полиинозиновую:полицитидиловую кислоту (Poly I:C) (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) в конечной концентрации 1 мкг/мл. Лунки, содержащие только среду RPMI, использовали в качестве отрицательного контроля. Культуральные планшеты дополнительно инкубировали в течение 24 ч в RPMI. Клеточные супернатанты собирали через 6 ч для анализа цитокинов при иммуноферментном анализе. Уровни ранних цитокинов (фактор некроза опухоли α, интерлейкин 6) и ИФН-α в супернатантах определяли с использованием коммерческих тест-систем ELISA (Вектор-Бест, Новосибирск) согласно инструкциям производителя.

Работа с мышами

Животных содержали в соответствии с ГОСТ 33216–2014 «Правила работы с лабораторными грызунами и кроликами». Все процедуры с животными проводили согласно Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств [14]. Исследование было одобрено Локальным комитетом по этике ухода и использования животных в ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, протокол № 3/23 от 20.09.2023. В исследовании использовали самок мышей линии CBA (питомник «Рапполово», Ленинградская область). Рандомизированным группам животных (по 10 мышей в каждой группе) под легким эфирным наркозом вводили интраназально 50 мкл вакцинного штамма ЖГВ A/17/Южная Африка/2013/01(H1N1)pdm09 с содержанием 6 lg ЭИД₅₀, распределяя объем равномерно между ноздрями. Животным контрольной группы инокулировали фосфатный буферный раствор таким же образом. Заражение проводили на 6-й день после иммунизации вирусом A/Индонезия/5/2005(H5N1) IDCDC-RG2 в инфекционной дозе 6 lg ЭИД₅₀, что соответствует пяти 50 % мышиным летальным дозам. Выживаемость животных наблюдали в течение двух недель после заражения вирусом.

Статистический анализ

Статистическую обработку данных проводили с использованием Prism 8 (GraphPad Software, Сан-Диего, США). Для представления данных использовали средние значения и стандартные отклонения средних (SD). Сравнение двух независимых групп проводили с использованием теста Манна – Уитни. Значение p < 0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Показано, что введение вакцинного вируса и родительского штамма вируса гриппа «дикого типа» в клеточную линию THP-1 вызывало заметное увеличение уровней фактора некроза опухоли α, интерлейкина 6 и ИФН-α (рис. 1). Продукция ИФН-α статистически значимо отличалась от контрольных лунок, содержащих только поддерживающую среду, после введения вируса A/H1N1 pdm09 «дикого типа» (рис. 1). Введение вакцинного вируса ЖГВ также вызывало повышение продукции ИФН-α, но различия с лунками без стимуляции не были статистически значимыми.

 

Рис. 1. Результаты изучения продукции ранних цитокинов в клетках линии моноцитов-макрофагов человека. H1-дт — A/Южная Африка/3626/2013(H1N1)pdm09; Н1-вак — A/17/Южная Африка/2013/01(H1N1)pdm09; Poly I:C — полиинозиновая:полицитидиловая кислота. Лунки, содержащие только среду RPMI, использовали в качестве отрицательного контроля. Представлены данные двух независимых экспериментов, выполненных в двух повторностях каждый. * р < 0,05 по сравнению с лунками с отрицательным контролем. ФНО-α — фактор некроза опухоли α; ИЛ-6 — интерлейкин 6; ИФН-α — интерферон α

Fig. 1. Results of studying the production of early cytokines in human monocytic-macrophage cell line. H1-dt — A/South Africa/3626/2013(H1N1)pdm09; H1-vac — A/17/South Africa/2013/01(H1N1)pdm09; Poly I:C — polyinosinic:polycytidylic acid. Wells containing only RPMI medium were used as negative control. Data from two independent experiments are presented, each performed in duplicate. * p < 0.05 compared to wells with negative control. TNF-α — tumor necrosis factor α; IL-6 — interleukin 6; IFN-α — interferon α

 

Мы исследовали, как ЖГВ будет защищать мышей от гетерологичной инфекции на раннем сроке после иммунизации. Для этого мы провели иммунизацию вирусом гриппа A/17/Южная Африка/2013/01(H1N1)pdm09, после чего заразили иммунных мышей летальной дозой вируса A/Индонезия/5/2005(H5N1) IDCDC-RG2. После иммунизации вакцинным штаммом ЖГВ на основе пандемического вируса гриппа A/H1N1pdm09 мыши были на 100 % защищены от заражения гетерологичным инфекционным вирусом (рис. 2, а), тогда как в группе неиммунизированных животных 90 % погибли к 13-му дню после заражения. Средняя потеря массы тела иммунизированных животных после заражения не превышала 10 %, в отличие от неиммунизированных животных, у которых средняя потеря веса достигала 20 % (рис. 2, b).

 

Рис. 2. Результаты экспериментального инфицирования вирусом гриппа A/Индонезия/5/2005(H5N1) IDCDC-RG2 на 6-й день после введения мышам вакцинного штамма ЖГВ A/17/Южная Африка/2013/01(H1N1)pdm09. а — Пропорции выживаемости (n = 10 в группе); b — динамика массы тела (n = 10)

Fig. 2. Results of experimental infection with the influenza virus A/Indonesia/5/2005(H5N1) IDCDC-RG2 on the 6th day after the administration of the live attenuated vaccine strain A/17/South Africa/2013/01(H1N1)pdm09 to mice. a — Survival proportions (n = 10 in the group); b — body weight dynamics (n = 10)

 

Обсуждение

В настоящей работе продемонстрировано, что вакцинный вирус A/17/Южная Африка/2013/01(H1N1)pdm09 вызывает выраженную продукцию ранних цитокинов и демонстрирует тенденцию к увеличению продукции ИФН-α in vitro. В ранних работах коллектива было показано, что сезонная ЖГВ защищает мышей от гомологичной летальной инфекции пандемическим вирусом гриппа и стрептококковой суперинфекции [11, 12, 15] уже в первые дни после введения. Это коррелировало с повышением экспрессии ранних цитокинов и ИФН-α в легких животных [11, 12].

Изучение факторов врожденного иммунитета при иммунизации ЖГВ актуально в связи с тем, что в ряде случаев, например, в пожилом возрасте адаптивный Т- и В-иммунный ответ может частично замещаться врожденной функцией [16]. Кроме этого, гены активации цитокинов и их рецепторов на ранней стадии вакцинации могут быть маркерами последующего гуморального ответа и его продолжительности [17]. Активация ранних цитокинов и их рецепторов при вакцинации влияет на последующее формирование устойчивости к возбудителям. Ранние цитокины, такие как фактор некроза опухоли α и интерлейкин 6, вовлечены в первичную неспецифическую защиту организма на ранней стадии вирусной инфекции, участвуя в активации иммунной системы и в запуске «специфического» иммунного ответа [18]. Выделяемые зараженными клетками ИФН-α вскоре после инфицирования вирусом действуют на рецепторы соседних клеток, предотвращая дальнейшее распространение вируса, отсутствие же передачи сигналов ИФН приводит к дальнейшему распространению вируса [19]. В дополнение к своей функции в качестве критического противовирусного цитокина ИФН-α/β участвует в развитии иммунитета Th1, стимулируя экспрессию генов естественных киллеров (NK) и T-клеток рецептора цитокинов Th1 и продукцию ИФН-γ [20].

Заключение

Таким образом, можно предполагать, что ЖГВ может модулировать пути врожденного иммунитета, тем самым способствуя уменьшению первичной вирусной инфекции. Наши данные на мышиной модели показали, что однократное интраназальное введение вакцинного штамма ЖГВ пандемического подтипа А/H1N1 pdm09 полностью защищало животных от летальной инфекции вирусом гриппа А/H5N1 уже на 6-й день после иммунизации.

Полученные данные могут указывать на пользу применения ЖГВ в период сезонного подъема острой респираторной вирусной инфекции за счет стимуляции факторов врожденного иммунитета.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 24-24-00238, https://rscf.ru/project/24-24-00238/

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Наибольший вклад распределен следующим образом: Ю.А. Дешева — анализ полученных данных, написание текста, окончательное редактирование; Д.С. Петрачкова — сбор и обработка материалов, обзор литературы, редактирование; А.Р. Рекстин — анализ полученных данных; И.В. Майорова, Н.В. Копылова, Д.С. Гузенков, Д.С. Соколовский — сбор и обработка материалов.

Additional information

Funding source. The study has been supported by Institute of Experimental Medicine. The research was conducted with the financial support of the Russian Science Foundation grant No. 24-24-00238, https://rscf.ru/project/24-24-00238/

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Author contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the study.

Personal contribution of each author: Yu.A. Desheva — data analysis, writing the main part of the text; D.S. Petrachkova — experimental design, collecting and preparation of samples, literature review, writing the main part of the text; A.R. Rekstin — data analysis; I.V. Mayorova, N.V. Kopylova, D.S. Guzenkov, D.S. Sokolovskiy — experimental design, collecting and preparation of samples.

Список сокращений

THP-1 — клеточная линия моноцитов-макрофагов человека; ЖГВ — живая гриппозная вакцина; ИФН — интерферон; ЭИД₅₀ — 50 % эмбриональная инфекционная доза.

Об авторах

Дарья Сергеевна Петрачкова

Институт экспериментальной медицины

Автор, ответственный за переписку.
Email: ya.dashook@ya.ru
ORCID iD: 0009-0004-0045-4886

документовед отдела трансляционной медицины

Россия, Санкт-Петербург

Андрей Роальдович Рекстин

Институт экспериментальной медицины

Email: arekstin@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2156-1635

канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник отдела вирусологии

Россия, Санкт-Петербург

Ирина Владимировна Майорова

Институт экспериментальной медицины

Email: mayorovairina0248@gmail.com
ORCID iD: 0009-0009-5130-5000

лаборант-исследователь отдела вирусологии

Россия, Санкт-Петербург

Нина Вадимовна Копылова

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»

Email: KNINA5485@gmail.com
ORCID iD: 0009-0004-1963-0333

лаборант-исследователь отдела вирусологии

Россия, Санкт-Петербург, Российская Федерация.

Данила Сергеевич Гузенков

Институт экспериментальной медицины

Email: danila.guzenkov@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0000-1680-399X

лаборант-исследователь отдела вирусологии

Россия, Санкт-Петербург

Даниил Дмитриевич Соколовский

Институт экспериментальной медицины

Email: sokolovskiy.daniil@gmail.com
ORCID iD: 0009-0005-8530-8059

лаборант-исследователь отдела вирусологии

Россия, Санкт-Петербург

Юлия Андреевна Дешева

Институт экспериментальной медицины

Email: desheva@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9794-3520
SPIN-код: 4881-3786

д-р мед. наук, профессор кафедры фундаментальных проблем медицины и медицинских технологий, ведущий научный сотрудник отдела вирусологии

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы