Alterations in the expression of dopamine catabolism genes in DAT-KO rats with induced valproate syndrome

Full Text

Обоснование

Расстройство аутистического спектра (РАС) — группа заболеваний, проявляющихся в детском возрасте, которые характеризуются дефицитом социального взаимодействия и стереотипией поведения [1]. Все чаще обсуждается нарушение работы дофаминергической системы в качестве одного из потенциальных факторов развития РАС [2]. Предполагается, что социальный дефицит у пациентов с РАС связан с дисфункцией мезокортиколимбического пути, в то время как стереотипное поведение может быть обусловлено дисфункцией нигростриатального пути [2, 3]. Транспортер обратного захвата дофамина (DAT, dopamine transporter) играет важную роль, контролируя вне-/внутриклеточный уровень дофамина, следовательно, нарушение его работы может стать одной из причин развития РАС.

Цель работы — исследование уровней экспрессии мРНК ферментов, ответственных за катаболизм дофамина, у крыс-гетерозигот с нокаутом гена, кодирующего DAT, и индуцированным вальпроатным синдромом.

Материалы и методы

Работа выполнена на 32 крысах в возрасте 40 дней (подростковый возраст). Всего в работе было сформировано 4 группы крыс: DAT:Salt, DAT:VPA, WT:VPA и WT:Salt, где DAT/WT — наличие или отсутствие генетического фактора (DAT — гетерозигота по нокауту гена SLC6A3, WT — дикий тип), VPA/Salt — наличие или отсутствие токсического фактора (индуцированный вальпроатный синдром).

РАС моделировали введением вальпроевой кислоты (VPA, valproic acid) в дозе 600 мг/кг на 12,5-й день беременности самки, так как в 11–13-е дни пренатального развития крыс формируется нервная трубка, а VPA приводит к нарушению ее развития [4]. Такие параметры введения позволяют получить аутичноподобный фенотип у потомства [5–8].

Крыс с индуцированным вальпроатным синдромом декапитировали на 40-й день эксперимента, осуществляли забор структур: стриатума, префронтальной коры (ПФК) и среднего мозга. Образцы хранили при температуре –70 °С.

Выделение тотальной РНК производили коммерческим набором ExtractRNA (#BC032, Евроген, Россия) согласно инструкции. Концентрацию РНК в пробах измеряли на спектрофотометре NanoDrop 2000C. Для определения качества выделенной РНК проводили неденатурирующий гель-электрофорез в 1 % агарозе. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием коммерческого набора MMLV RT kit (#SK021, Евроген) в соответствии с инструкцией. Полученную кДНК хранили при температуре –20 °С.

Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе CFX96 Real-Time System (США) с использованием коммерческого набора реактивов qPCRmix-HSSYBR-5X (#PK155S, Евроген). Для каждой пары праймеров предварительно подбирали индивидуальные температурные характеристики. Последовательности праймеров приведены в таблице.

 

Таблица 1 / Table 1

Последовательности прямого и обратного праймеров

Forward and reverse primers sequences

Ген	Последовательности праймеров	Температура отжига, °C
18S	5՛-ACGGACCAGAGCGAAAGCAT-3՛ 5՛-TGTCAATCCTGTCCGTGTCC-3՛	60
Pgc-1	5՛-ATGCAAAGACTGGCCAAGCTAC-3՛ 5՛-AGCCACAGCCTCAGCATATTTC-3՛	60
МАО-А	5՛-GCCAGGAACGGAAATTTGTA-3՛ 5՛-TCTCAGGTGGAAGCTCTGGT-3՛	64
MAO-B	5՛-TGGGCCAAGAGATTCCCAGTGATG-3՛ 5՛-AGAGTGTGGCAATCTGCTTTGTAG-3՛	60
COMT	5՛-CTGGAGAAATGTGGCCTGCT-3՛ 5՛-GCTGCTGCTCCCTCTCACAT-3՛	60

Примечание. МАО-А — моноаминоксидаза А; МАО-В — моноаминоксидаза B; СОМТ — катехол-Ометилтрансфераза.

 

Для расчета количества мРНК был использован сравнительный 2^–ΔΔCt-метод. Уровень экспрессии генов определяли по содержанию мРНК генов интереса относительно среднего геометрического количества мРНК двух референсных генов (18S и Pgc-1).

Проверку на нормальность осуществляли с помощью критерия Шапиро – Уилка. Для статистической обработки данных использовали двухфакторный дисперсионный анализ с поправкой Тьюки на множественное сравнение.

Результаты

Было показано, что в среднем мозге уровень экспрессии мРНК катехол-О-метилтрансферазы (COMT, сatechol-O-methyl transferase) у крыс из группы DAT:Salt в 17,4 раза выше по сравнению с контрольной группой WT:Salt (рис. 1). При этом воздействие VPA в группе DAT:VPA привело к снижению уровня мРНК COMT по сравнению с DAT:Salt в 6,3 раза. Для COMT в среднем мозге взаимодействие факторов F_1,18 = 101,4, p < 0,0001, генетический фактор F_1,18 = 149,7, p < 0,0001, токсический фактор F_1,18 = 97,13, p < 0,0001. Для моноаминоксидазы А (MAO-A) взаимодействие F_1,18 = 0,45, p = 0,5108, генетический фактор F_1,18 = 31,36, p < 0,0001, токсический фактор F_1,18 = 13,47, p = 0,0018. Таким образом, нокаут гена DAT и пренатальное воздействие VPA приводит к снижению уровня мРНК MAO-A в среднем мозге, но взаимодействия между факторами не наблюдается. Для моноаминоксидазы B (MAO-B) взаимодействие F_1,18 = 4,859, p = 0,0408, генетический фактор F_1,18 = 17,8, p = 0,0005, токсический фактор F_1,18 = 4,205, p = 0,0552. Мы предполагаем, что к снижению уровня MAO-B приводит как совокупность повреждающих факторов, так и непосредственно нокаут гена DAT.

 

Рис. 1. Уровни экспрессии мРНК катехол-О-метилтрансферазы (COMT), моноаминоксидазы А (MAO-A), моноаминоксидазы B (MAO-B) в среднем мозге в группах DAT:Salt (n = 4), WT:Salt (n = 7), DAT:VPA (n = 5), WT:VPA (n = 6). Данные представлены как M ± SEM. * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,005; # p ≤ 0,0001

Fig. 1. Expression levels of catechol-O-methyltransferase (COMT), monoamine oxidase A (MAO-A), monoamine oxidase B (MAO-B) mRNA in the midbrain in groups DAT:Salt (n = 4), WT:Salt (n = 7), DAT:VPA (n = 5), WT:VPA (n = 6). Data are presented as M ± SEM. * p ≤ 0.05; ** p ≤ 0.005; ^# p ≤ 0.0001

 

В стриатуме не было обнаружено значимых различий в уровнях экспрессии мРНК COMT, MAO-A и MAO-B (рис. 2).

 

Рис. 2. Уровни экспрессии мРНК катехол-О-метилтрансферазы (COMT), моноаминоксидазы А (MAO-A), моноаминоксидазы B (MAO-B) в стриатуме. DAT:Salt (n = 6), WT:Salt (n = 7), DAT:VPA (n = 7), WT:VPA (n = 7). Данные представлены как M ± SEM

Fig. 2. Catechol-O-methyltransferase (COMT), monoamine oxidase A (MAO-A), monoamine oxidase B (MAO-B) mRNA expression levels in the striatum. DAT:Salt (n = 6), WT:Salt (n = 7), DAT:VPA (n = 7), WT:VPA (n = 7). Data are presented as M ± SEM

 

В ПФК не было обнаружено статистически значимых различий в уровнях экспрессии мРНК COMT, MAO-A и MAO-B (рис. 3).

 

Рис. 3. Уровни экспрессии мРНК катехол-О-метилтрансферазы (COMT), моноаминоксидазы А (MAO-A), моноаминоксидазы B (MAO-B) в префронтальной коре. DAT:Salt (n = 5), WT:Salt (n = 7), DAT:VPA (n = 7), WT:VPA (n = 7). Данные представлены как M ± SEM

Fig. 3. Catechol-O-methyltransferase (COMT), monoamine oxidase A (MAO-A), monoamine oxidase B (MAO-B) mRNA expression levels in the prefrontal cortex. DAT:Salt (n = 5), WT:Salt (n = 7), DAT:VPA (n = 7), WT:VPA (n = 7). Data are presented as M ± SEM

 

Обсуждение

Известно, что VPA обладает множеством фармакологических свойств, однако установить точный механизм возникновения аутичноподобного фенотипа при индуцированном вальпроатном синдроме пока не удается. Примечательно, что в 11–13-е дни пренатального развития (период введения VPA при моделировании РАС) происходит дифференциация дофаминергических нейронов среднего мозга [9]. Оказываемый эффект в ранний пренатальный период может приводить к изменению архитектуры цитоскелета, нарушая синаптогенез. Предполагается, что в конечном итоге VPA опосредованно нарушает баланс возбуждения/торможения в головном мозге [10, 11]. Ранее на культуре клеток было показано, что VPA изменяет Wnt-сигналинг [12], который необходим в том числе и для созревания дофаминергических нейронов среднего мозга.

Тела дофаминергических нейронов находятся на уровне среднего мозга и простирают свои аксоны к стриатуму (нигростриальный путь) и ПФК (мезокортиколимбический путь). Нигростриальный путь участвует в регуляции моторной активности, а мезокортиколимбический — в регуляции когнитивных функций, мотивации и вознаграждения [13]. Утилизация дофамина, накопленного в синаптической щели, происходит главным образом поочередным действием двух ферментов — COMT и MAO [14].

Мы установили, что экспрессия COMT в среднем мозге значительно выше лишь в группе DAT:Salt, но не DAT:VPA. Обе эти группы состоят из крыс со сниженным обратным захватом дофамина. Однако количество мРНК COMT в группе DAT:VPA осталось на уровне контрольной группы. Следовательно, пренатальное воздействие VPA способно влиять на функционирование DAT или, вероятно, изменять доступность дофамина для других белков-транспортеров, которые также могут захватывать дофамин (например, обратный транспортер серотонина SERT и обратный транспортер норадреналина NET [15]). В работе [16] было показано, что пренатальное воздействие VPA приводило к повышению экспрессии мРНК DAT и NET в ПФК у 4-недельных крыс. Кроме того, известно, что COMT преобладает в глиальных клетках, а не в нейрональных [17], поэтому повышенный уровень COMT в среднем мозге у крыс с частичным нокаутом гена DAT весьма логичен, так как у этих крыс повышен уровень внеклеточного дофамина [18].

Снижение уровня мРНК этих генов у крыс из групп DAT:VPA и DAT:Salt можно было бы объяснить сниженным количеством внутриклеточного дофамина [19]. Однако подобный эффект также был обнаружен и для группы WT:VPA, что объясняется снижением уровня дофамина в среднем мозге у крыс, пренатально получивших VPA (800 мг/кг) [20].

Ожидаемо вызванное VPA снижение экспрессии мРНК COMT, MAO-A и MAO-B в среднем мозге должно приводить к изменению обмена дофамина в стриатуме и ПФК. Однако уровни экспрессии мРНК COMT, MAO-A и MAO-B в этих структурах не отличались у крыс всех четырех групп. Вероятно, это может быть связано с компенсаторными эффектами в ПФК и стриатуме, которые контролируют важнейшие психофизиологические функции (когнитивные, мотивацию, эмоции и двигательную активность).

Заключение

На сегодняшний день выделяют две группы факторов, которые могут служить причинами развития РАС и синдрома дефицита внимания и гиперактивности: токсические и генетические. В данной работе мы показали, что сочетанное действие токсического (развитие вальпроатного синдрома) и генетического (наличие нокаутированного аллеля гена SLC6A3) факторов приводит к нарушению катаболизма дофамина в среднем мозге вследствие снижения уровня мРНК МАО-А и МАО-B, что, вероятно, и является одной из причин нарушения эмоционально-мотивационной активности у пациентов в данными формами патологии.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Работа выполнена в рамках государственного задания ФГБНУ «Института экспериментальной медицины» № FGWG-2024-0015.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Наибольший вклад распределен следующим образом: И.Р. Назаров — обзор литературы, проведение эксперимента, обработка результатов, написание рукописи; Н.С. Пестерева — анализ и интерпретация полученных результатов, корректировка рукописи; В.М. Кудринская, Д.А. Обухова — проведение эксперимента.

Additional information

Funding source. The work was carried out within the framework of the state task of the Institute of Experimental Medicine No. FGWG-2024-0015.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Author contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the study.

Personal contribution of each author: I.R. Nazarov — literature review, conducting the experiment, processing the results, writing the manuscript; N.S. Pestereva — analysis and interpretation of the results obtained, correction of the manuscript; V.M. Kudrinskaya, D.A. Obukhova — conducting the experiment.

Список сокращений

РАС — расстройство аутистического спектра; DAT, dopamine transporter — транспортер обратного захвата дофамина; VPA, valproic acid — вальпроевая кислота; ПФК — префронтальная кора; МАО-А — моноаминоксидаза А; МАО-В — моноаминоксидаза B; СОМТ — катехол-О-метилтрансфераза.

About the authors

Ilya R. Nazarov

Saint Petersburg State University

Author for correspondence.
Email: inazarovgm@gmail.com
ORCID iD: 0009-0003-3789-0836

engineer, Faculty of Biology, Department of Biochemistry

Russian Federation, Saint Petersburg

Daria A. Obukhova

Saint Petersburg State University; Institute of Experimental Medicine

Email: obuhowadaria@gmail.com
ORCID iD: 0009-0002-4287-0808

student of the Faculty of Biology, Department of Biochemistry, Laboratory Research Assistant of the I.P. Pavlov Physiological Department, Laboratory of Neurochemistry

Russian Federation, Saint Petersburg; Saint Petersburg

Valentina M. Kudrinskaya

Institute of Experimental Medicine; Peter the Great St. Petersburg Polytechnic University

Email: v.kudrinskaja2011@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2763-5191

laboratory research assistant at the Physiological Department named after I.P. Pavlov, laboratory of neurochemistry, student at the Institute of Biomedical Systems and Biotechnology

Russian Federation, Saint Petersburg; Saint Petersburg

Nina S. Pestereva

Institute of Experimental Medicine

Email: pesterevans@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3104-8790

Senior Research Associate of the I.P. Pavlov Physiological Department, Laboratory of Neurochemistry

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files