Proteins and peptides involved in realization of the protective functions of mixed saliva: antimicrobial peptides, proline-rich proteins and peptides

Full Text

Список сокращений

АМП — антимикробные пептиды; ПБП — пролин-богатые пептиды; Ig — иммуноглобулин; ПББ — пролин-богатые белки.

Введение

Ротовая полость — один из основных барьеров на пути проникновения патогенов во внутреннюю среду организма. Существенную роль в осуществлении противоинфекционных функций ротовой полости играет слюна. Эта уникальная жидкость содержит широкий спектр белков/пептидов, нуклеиновых кислот, электролитов, гормонов, поступающих из множества местных и системных источников, соединений, выделяемых эпителиальными клетками и клетками врожденного и приобретенного иммунитета, которые мобилизуются при повреждении тканей полости рта, при развитии инфекционного процесса и других видов патологии.

Хотя в целом по составу смешанной слюны можно судить о состоянии здоровья каждого индивидуума, ее широкое использование в качестве диагностической жидкости затруднено главным образом из-за недостаточного понимания значимости качественных и количественных изменений в составе разнообразных присутствующих в слюне биомолекул в сочетании с отсутствием высокочувствительных систем обнаружения маркеров патологических процессов [1].

Как биологическая жидкость человеческая слюна обладает особыми характеристиками, и в некоторых недавних обзорах описана специфичность ее протеома [2]. На сегодняшний день в слюне человека обнаружено более 2000 различных белков и пептидов [3]. В их число входят катионные антимикробные пептиды (АМП) с молекулярной массой 3–5 кДа: α- и β-дефенсины, кателицидин, гистатины, однако их концентрация в слюнной жидкости относительно низкая и в норме составляет примерно 1–3% общей концентрации белка смешанной слюны [4].

В смешанной слюне широко представлена фракция пролин-богатых белков (ПББ) и пептидов (ПБП) — продуктов их протеолиза, функции которых на данный момент остаются малоизученными [5]. Известно, что у некоторых млекопитающих ПБП, обладающие высокой антимикробной активностью, содержатся в гранулярном аппарате нейтрофилов. Фагоциты человека лишены подобных ПБП, обогащенные пролином пептиды у человека обнаружены преимущественно в слюне, хотя их биологическая роль не полностью установлена. Получение новых данных и обобщение имеющихся сведений о биологической активности ПБП слюны, выяснение, играют ли они значимую роль в обеспечении ее защитных функций, вступают ли во взаимодействие с другими, хорошо изученными белками, участвующими в реализации противоинфекционной защиты ротовой полости, в частности с АМП, важно для понимания молекулярно-клеточных основ поддержания гомеостаза ротовой полости. Данный обзор посвящен рассмотрению имеющихся литературных данных, раскрывающих роль различных белковых компонентов смешанной слюны — антимикробных пептидов и пролин-богатых катионных белков и пептидов — в обеспечении ее защитных свойств в норме и при различных видах патологии, а также указывающих на возможности их использования в медицине как диагностических или терапевтических средств.

Общие свойства слюны

Слюна представляет собой биологическую жидкость, поступающую в ротовую полость, это секрет трех пар крупных слюнных желез (околоушной, подъязычной и поднижнечелюстной) и нескольких малых желез — губных и нёбных. Непосредственно в полости рта образуется смешанная слюна, или ротовая жидкость. Кроме общего секрета всех слюнных желез она имеет в своем составе жидкость десневой щели (борозды), которая содержит бактерии полости рта и остатки пищи [5]. В нашем обзоре под термином «слюна» понимается именно смешанная слюна.

Слюна выполняет множество важных функций как для питания, так и для защиты, особенно важна ее роль в протекции зубов, в формировании эпителиального барьера полости рта, а также пищевода. Например, она обладает ферментативным, ранозаживляющим и противомикробным действием [6].

Эта многокомпонентная жидкость играет важную роль в поддержании «здорового рта»; например, уменьшение слюноотделения заметно увеличивает риск кариеса зубов, она обеспечивает смазку поверхности ротовой полости и имеет первостепенное значение для поддержания структурной целостности зубов за счет снижения деминерализации. Данный процесс происходит под воздействием продуцируемых микроорганизмами зубного налета кислот, которые растворяют соединения кальция и разрушают поверхность эмали зубов. Слюна в свою очередь нейтрализует данные потенциально вредные кислоты [7]. Слюна также способствует стимулированию реминерализации зубной эмали и реализации адаптивных и врожденных механизмов защиты организма [8].

Состав слюны

В составе слюны имеется широкий спектр структурно и функционально различных белковых молекул, в том числе гликопротеинов [8]. Несмотря на большие успехи в выделении и классификации белков, составляющих протеом слюны, его исследования еще продолжаются, поэтому на данный момент нельзя сказать, что изучение белкового состава слюны полностью завершено [9]. Следует отметить, что существуют заметные индивидуальные различия, состав слюны подвержен гормональным колебаниям и изменяется в процессе старения организма [10].

Среди наиболее распространенных белков в составе слюны — полипептиды, богатые пролином, амилаза, защитные пептиды (гистатины, статзерины и др.), муцины, иммуноглобулин (Ig) A и карбоангидраза. В то же время слюна содержит неорганические ионы, такие как натрий, калий, кальций, магний, бикарбонат и фосфат (действующие как важные буферные агенты), а также аминокислоты и мочевину. Муцины, представляющие собой высокомолекулярные гликопротеины, составляют более 15% белков слюны и служат основным и наиболее доступным источником сахаров для роста бактерий [11].

Защитные факторы слюны

Слюна является основным фактором, определяющим защищенность полости рта; компоненты слюны, особенно противомикробные соединения, оказывают значительное селективное давление на микробиоту, помогая формировать и контролировать местные сообщества.

Подробные протеомные исследования выявили сложность и разнообразие антимикробных факторов в слюне [12]. Количество и спектр действия некоторых из них дополнительно увеличивается за счет контролируемого последовательного пост-трансляционного протеолиза [13]. Состав и концентрация белков слюны, участвующих в реализации функций систем врожденного и приобретенного иммунитета, значительно отличается у разных людей, а также зависит от возраста и состояния здоровья/заболевания [14], определяется различиями в составе микробиоты и предрасположенностью к инфекциям полости рта, связанной с некоторыми видами патологии, такими, например, как диабет и синдром Дауна [15].

Концентрации антимикробных факторов в слюне у каждого индивидуума могут изменяться в зависимости от того, когда и где эти факторы вступают в контакт с микроорганизмами [16].

В обеспечении защитных реакций ротовой полости, опосредуемых системой врожденного иммунитета, участвуют такие компоненты слюны как лактоферрин, лизоцим, гистатины, β-лизины, муцины, пероксидаза, дефенсины, кателицидины и, возможно, ПББ.

В полости рта различают две подсистемы пероксидазной системы защиты: слюнную пероксидазу (лактопероксидазу) – тиоцианат – пероксид водорода, которая ингибирует жизнедеятельность кариесогенных стрептококков, и миелопероксидазу – галогены – пероксид водорода [17–19].

Комплемент — это комплекс защитных белков, состоящий из нескольких фракций. Условия для активации данной системы в слюне менее благоприятны, чем в крови. Это связано с тем, что в слюне белок комплемента С3 присутствует в существенно более низкой концентрации, чем в плазме крови, а остальные фракции практически отсутствуют. Однако при наличии воспаления в слизистой оболочке ротовой полости происходит активация комплемента, поскольку в этом случае для усиления защитной функции из кровотока поступают остальные белки системы комплемента [17].

Клеточные факторы защиты полости рта — моноциты, лимфоциты и нейтрофилы. Каждую минуту в ротовую полость, главным образом через десневую борозду, попадает около 242 тыс. нейтрофилов, что составляет 97% общего числа лейкоцитов. Как правило, их ключевая функция — фагоцитоз [20]. Развитие инфекционного процесса в полости рта приводит к активации этих клеток, многократному повышению фагоцитарной активности и выделению противомикробных факторов, обеспечивающих гуморальный ответ на вторжение патогена [17, 21].

В слизистой оболочке ротовой полости также присутствуют факторы системы адаптивного иммунитета — IgA, IgG, IgM, IgE и IgD. Среди иммуноглобулинов класса A выделяют сывороточный и секреторный. Наиболее важен для полости рта секреторный sIgA [22, 23]. Данный иммуноглобулин имеет ряд защитных функций, а также препятствует адгезии патогенов к слизистой оболочке рта и таким образом ограничивает процесс воспаления [24].

Характеристика отдельных компонентов протеома слюны

Гистатины представляют собой пептиды массой 3–5 кДа с высоким содержанием гистидина [25]. Преобладающие формы в слюне — гистатин 1, 3 и 5; гистатины 1 и 5 также были обнаружены в приобретенной пленке — пелликуле, возникающей в результате спонтанного осаждения (адсорбции, полимеризации и денатурации) белково-углеводных компонентов слюны на эмали зубов человека [26]. Регуляция экспрессии гена гистатина полностью не изучена, но установлено, что интерлейкин 17 может индуцировать экспрессию гена гистатина через пути сигнальной трансдукции с участием белков STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3), как показано на клеточной линии подчелюстной железы [27].

Основное противомикробное действие гистатинов — антимикотическое, хотя они проявляют некоторую антибактериальную активность; также сообщают о том, что они обладают противовирусной активностью в отношении вируса гриппа [28] и ранозаживляющими свойствами [29].

Считается, что гистатины в зубном налете способствуют реминерализации эмали и защите от деминерализации [26].

Гистатины ингибируют рост многих стрептококков, находящихся в ротовой полости, но не Streptococcus mutans, в концентрации 20 мкг/мл [30]. Гистатин 5 ингибирует индукцию провоспалительных цитокинов (интерлейкинов 6 и 8) в фибробластах десен белками внешней мембраны Porphyromonas gingivalis, а также лейкотоксином Aggregatibacter actinomycetemcomitans, а гистатины 1, 3, 5 ингибируют гингипаины P. gingivalis, тем самым препятствуя росту и коагрегации P. gingivalis и, соответственно, гемагглютинации [31–33].

Дефенсины представляют собой цистеинсодержащие пептиды с тремя дисульфидными связями.

У человека было обнаружено шесть α-дефенсинов: HNP1, HNP2, HNP3, HNP4 — пептиды, вырабатываемые в гранулах нейтрофилов, при этом содержание в слюне первых трех во много раз больше, чем последнего [34]; HNP5 и HNP6 были выявлены в клетках Панета тонкой кишки, в эпителиальных клетках женского урогенитального тракта, а также в смешанной слюне.

На данный момент у человека описано шесть β-дефенсинов (hBD-1–hBD-6), и они продуцируются различными эпителиальными клетками [35]. Три β-дефенсина (hBD-1, hBD-2, hBD-3) синтезируются в кератиноцитах эпителия ротовой полости человека. Ген HBD1 конститутивно экспрессируется во многих эпителиальных тканях, включая дыхательный эпителий и многослойный эпителий полости рта. Гены HBD2 и HBD3 также экспрессируются в оральном эпителии, и экспрессия индуцируется в ответ на воспаление [36].

В дополнение к противомикробной активности дефенсины проявляют иммуномодулирующие свойства, участвуют в заживлении ран, ремоделировании тканей и регуляции процесса воспаления [37].

Порядок антибактериальной активности и спектра активности β-дефенсинов следующий: β-дефенсин 1 < β-дефенсин 2 < β-дефенсин 3. Дефенсины действуют как противовирусные агенты, влияя на жизнеспособность вирусов герпеса, гриппа, папилломавирусов и других с помощью различных механизмов [32].

Пептид LL-37 — наиболее изученный представитель кателицидинов (С-концевой фрагмент белка-предшественника hCAP18). Это единственный пептид данного семейства у человека. LL-37 содержит большое количество остатков аргинина и лизина, был обнаружен в фагоцитах, различных эпителиях, в ротовой жидкости и других биологических жидкостях [38].

LL-37 обладает активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий и метаногенных архей: Methanobrevibacter smithii и Methanosphaera stadtmanae. Данные микроорганизмы — это представители микробиоты человека, обнаруженные в некоторых слизистых оболочках, в основном преобладают в кишечнике человека [39].

Исследование J. Overhage и соавт. [40] впервые описывает способность LL-37 эффективно ингибировать образование бактериальных биопленок in vitro. Это происходит при очень низкой и физиологически значимой концентрации 0,5 мкг/мл, намного ниже той, которая требуется для уничтожения или ингибирования роста микроорганизмов (минимальная ингибирующая концентрация 64 мкг/мл).

Лизоцим обеспечивает часть врожденных защитных механизмов слюны. Он присутствует в цельной слюне, содержится в секретах больших и малых слюнных желез и в незначительной степени в жидкости десневой борозды, присутствует также в лейкоцитах [10]. Данный фермент проявляет антимикробную активность в отношении грамположительных бактерий. Это происходит, в первую очередь, благодаря его ферментативной активности — гидролизу (1→4)-β-связей между N-ацетилмураминовой кислотой и остатками N-ацетил-D-глюкозамина в пептидогликане бактериальной клеточной стенки. Этот белок также обладает способностью агрегировать бактерии ротовой полости, большей частью стрептококки, тем самым влияя на их адгезию к поверхностям полости рта и способствуя очистке ротовой полости от микроорганизмов. Кроме того, лизоцим может активировать бактериальные аутолизины, разрушающие стенки бактериальных клеток [41]. Предполагается, что активность лизоцима увеличивается в ответ на дисбактериоз [42]. Кроме того, было продемонстрировано, что лизоцим оказывает антимикотическое, а также противовирусное действие [43].

Лактоферрин — еще один антимикробный фактор, активный в отношении бактерий, вирусов и низших грибов [44]. Его основные источники в слюне — это непосредственно слюнные железы, нейтрофильные гранулоциты, эпителиальные клетки слизистой оболочки [10]. Лактоферрин представляет собой многофункциональную молекулу, известную как «хелатор ионов железа» благодаря способности связывать и транспортировать железо. Лактоферрин — это защитный белок, проявляющий бактериостатическую/бактерицидную активностью, а также модулирующий широкий спектр реакций систем врожденного и адаптивного иммунитета. Универсальность и важность лактоферрина доказаны его повсеместным присутствием во всех биологических жидкостях и слизистых оболочках, от слюны и слез до желудочного секрета и амниотической жидкости [45].

Пролин-богатые белки. Секреция ПББ осуществляется околоушными железами, при этом доля ПББ в составе белков секрета составляет около двух третей. Исследования методами кругового дихроизма и ЯМР некоторых из этих белков демонстрируют характерные черты неупорядоченных структур с короткими участками полипролиновой спирали II типа [46]. ПББ очень полиморфны, имеется более 50 различных белков, которые кодируются только шестью генами, имеет место перегруппировка генов, а также различные модификации белков уже после их секреции в ротовую полость [47]. Основные аминокислоты (около 75%), входящие в состав данных белков, — пролин, глицин, глутамин и аспарагин.

У детей до появления первых молочных зубов в слюне находятся предшественники ПББ, имеющие высокую молекулярную массу. Затем под действием функционально активных протеиназ они расщепляются на три группы разного характера, но при этом их относительная концентрация постоянно изменяется [5].

Данное семейство белков включает основные (катионные), гликозилированные и кислые белки, которые, несмотря на их структурное сходство (наличие пролин-богатых участков), имеют разные свойства [48].

Функция катионных ПББ на данный момент мало изучена, есть только немногочисленные работы. Например, описан Basic salivary proline-rich protein 1 (PRB1) — основный пролин-богатый белок слюны 1, представляющий собой белок, который у человека кодируется геном PRB1. Исследование F. Chen и соавт. [49] показывает, что экспрессия PRB1 в индуцированной мокроте повышена у пациентов с астмой. Таким образом, PRB1 может быть биологическим маркером бронхиальной астмы 2‐го типа, а результаты эксперимента могут дать новое представление о диагностике и лечении данного заболевания в будущем.

Известно, что катионные ПББ связывают полифенольные растительные соединения, в частности танины, которые содержатся в пище. Возможно, благодаря этому происходит защита полости рта от нежелательных эффектов танинов [50]. Предполагается, что способность связывать танины важна, в первую очередь, для травоядных животных, в слюне которых присутствуют в большом количестве ПББ, что позволяет им потреблять пищу, которая содержит до 5% танинов по массе. Связывание и осаждение танинов происходит за счет пролин-глицин-богатых участков, которые обеспечивают открытую структуру молекулы с многочисленными доступными для белок-белкового взаимодействия сайтами [46]. Предполагается также, что такие белки могут придавать слюне вязко-эластические свойства [5]. Катионные ПББ главным образом являются секретом околоушных желез, в то время как кислые — подчелюстных и околоушных [4].

Доля гликозилированных ПББ составляет 17% всех белков околоушной железы. Они тоже способны связывать танины пищи, а также участвуют в создании и смачивании пищевого комка [46].

Кислые ПББ, которые содержатся в пелликулах зуба, связываются с белком статзерином и блокируют взаимодействие этого белка с гидроксиапатитом при рН <7. Тем самым данные ПББ препятствуют как удалению кальция и фосфора из эмали, так и их избыточному накоплению, то есть поддерживают постоянство количества этих минералов в эмали зуба [5].

Пролин-богатые пептиды. Основная доля ПБП — это фрагменты больших белковых молекул, которые подверглись протеолитическому расщеплению.

Данные пептиды привлекают внимание многих исследователей благодаря особым структурным характеристикам, обусловленным высоким содержанием остатков пролина. Интересно, что в составе их молекул присутствуют мотивы, характерные для связывающих домены SH3 (Src Homology 3) соединений, — RxxPxxP, PxxPxP, PxxPxxP (где R — аргинин, P — пролин, х — другие аминокислотные остатки). Известно, что благодаря наличию таких мотивов в антимикробных ПБП нейтрофилов животных эти пептиды вступают в белок-белковые взаимодействия со многими бактериальными белками, нарушая функции этих белков, а также связываются и с ключевыми белками эукариотических клеток, что определяет противовоспалительные, ранозаживляющие свойства ПБП, как, например, это показано для пептида лейкоцитов свиньи PR-39 [51].

Подобные мотивы имеются и в белках, участвующих в инициации ключевых сигнальных каскадов в различных типах эукариотических клеток. Нарушение белок-белковых взаимодействий, в частности между молекулами, имеющими пролин-распознающие домены, и белками или пептидами, содержащими соответствующие пролин-богатые участки, ведет к развитию различных патологических процессов и играет немаловажную роль в патогенезе болезни Хантингтона, Альцгеймера, опухолевых заболеваний [52, 53]. Исследование функциональных свойств ПБП может дать ключ для раскрытия путей коррекции этих заболеваний [54]. В то же время биологическая роль ПБП слюны остается невыясненной.

Для ряда представителей пролин-богатых АМП нейтрофилов животных показано, что их биологически активной конформацией является полипролиновая спираль II типа [55]. А эксперименты с помощью метода малоуглового рентгеновского рассеяния, проведенные для анализа конформации полипептида слюны человека ПБП IB-5, показали, что пептид обладает неупорядоченной структурой [46]. Такая структура, по-видимому, важна для связывания этих белков с танинами растений [56].

В полости рта ПББ — преобладающий компонент секрета слюнных желез, они делятся на три группы: кислые, основные и гликозилированные. Эти белки кодируются шестью генами, но продуцируется более 20 ПБП, образующихся как путем дифференциального сплайсинга РНК, так и протеолитическим расщеплением после секреции [11]. В слюне человека содержатся кислые и слабощелочные протеиназы, в основном лейкоцитарные или микробного происхождения. Среди них определяются аспартильные, сериновые и матриксные металлопротеиназы [5].

Ниже представлены структуры некоторых катионных ПБП слюны [57–61].

IB-1: ENLNEDVSQEESPSLIAGNPQGAPPQGGNKPQGPPSPPGKPQGPPPQGGNQPQGPPPPPGKPQGPPPQGGNKPQGPPPPGKPQGPPPQGDKSRSPRQ

IB-4: SPPGKPQGPPQQEGNNPQGPPPPAGGNPQQPQAPPAGQPQGPPRPPQGGRPSRPPQ

IB-6: SPPGKPQGPPPQGGNQPQGPPPPPGKPQGPPPQGGNKPQGPPPPGKPQGPPAQGGSKSQSARSPPGKPQGPPQQEGNNPQGPPPPAGGNPQQPQAPPAGQPQGPPRPPQGGRPSRPPQ

IB-9: SPPGKPQGPPPQGGNQPQGPPPPPGKPQGPPPQGGNRPQGPPPPGKPQGPPPQGDKSRSPR

P-B: ERGPRGPYPPGPLAPPQPFGPGFVPPPPPPPYGPGRIPPPPPAPYGPGIFPPPPPQP

P-H: SPPGKPQGPPQQEGNNPQGPPPPAGGNPQQPQAPPAGQPQGPPRPPQGGRPSRPPQ

P-D: SPPGKPQGPPQQEGNKPQGPPPPGKPQGPPPPGGNPQQPQAPPAGKPQGPPPPPQGGRPPRPAQGQQPPQ

P-F: SPPGKPQGPPPQGGNQPQGPPPPPGKPQGPPPQGGNKPQGPPPPGKPQGPPPQGGSKSRSA

Данные полипептиды имеют молекулярную массу около 10–40 кДа. После протеолитического расщепления протеазами преимущественно бактериальной природы образуются фрагменты, содержащие от 8 до 25 аминокислотных остатков [62].

Есть информация, что некоторые кислые ПБП проявляют антимикробную активность, а некоторые катионные — антимикотическую (например, против Candida albicans) и противовирусную, в то время как гликозилированные обладают антибактериальным действием и связывают вирусы [63].

Например, было показано, что пептид р1932 обладает высокой противовирусной активностью в отношении ВИЧ-1, подавляя его репликацию в тестах как in vivo, так и ex vivo [64].

Нами получены данные, которые показывают, что ПБП слюны человека обладают противовоспалительными эффектами, что позволяет предположить их участие в регулировании воспалительных процессов полости рта [65].

Установлено, что фрагменты ПБП P-H (37–51), P-F (43–61), IB6 (98–116) и р1932 в концентрациях 5 и 10 мкмоль/л подавляют реакцию дыхательного взрыва фагоцитов крови человека in vitro, стимулированных добавлением бактериальной культуры Escherichia coli: в концентрации 5 мкмоль/л интенсивность дыхательного взрыва фагоцитов крови снижается на 36–53%, а в концентрации 10 мкмоль/л — на 26–37% [65].

Согласно данным литературы, промежуточные продукты активных форм кислорода, генерируемые фагоцитарной NADPH-оксидазой, являются критически важными компонентами немедленной защиты хозяина при вторжении патогена. Тем не менее эти высокотоксичные окислители могут вызывать значительное повреждение тканей при избыточной реакции воспаления; таким образом, важно, чтобы их генерация и инактивация строго регулировались.

По данным литературы, эндогенный антибактериальный пептид PR-39, богатый пролином-аргинином, может играть значимую роль в воспалительных процессах и восстановлении тканей в дополнение к своим антибактериальным свойствам. Установлено, что он снижает активность NADPH-оксидазы [66]. Механизм этого эффекта связывают с тем, что данный пептид имеет в составе молекулы последовательности, которые взаимодействуют с пролин-распознающими участками, находящимися в доменах SH3 (Src homology 3) различных белков, и, как предполагают, ингибирование оксидазы в нейтрофилах происходит за счет связывания ее субъединицы р47phox, содержащей домен SH3, с PR-39. Тем самым блокируется сборка каталитически активного фермента, и не осуществляется продукция супероксид-аниона (О₂^–). Таким образом, ограничивается чрезмерное повреждение тканей при воспалении [66].

Пептиды P-H (37–51), P-F (43–61), IB6 (98–116) и р1932 также имеют в своем составе такие последовательности, и исходя из этого можно предположить сходный с PR-39 механизм действия.

В целом, имеющиеся данные о ПБП слюны немногочисленны и не дают возможности сделать однозначный вывод о направленности их биологической активности.

Микробиота полости рта

Микробиота полости рта представляет собой важную часть микробиоты человека и включает, по разным данным, от нескольких сотен до нескольких тысяч различных видов. Это разнообразие определяется рядом аспектов:

1. Видовой состав: по оценкам, в полости рта человека встречается не менее 700 видов.
2. Различные локализации: слюна; мягкие ткани, такие как слизистая оболочка и поверхность языка; твердые ткани (зубы), где зубная биопленка (зубной налет) находится в зубных или наддесневых или поддесневых углублениях, а также на твердых искусственных материалах, таких как зубные протезы и ротовые имплантаты.
3. Миграция в ротовой полости: в то время как многие из представителей 700 видов микроорганизмов предпочитают определенные ниши в качестве среды обитания, некоторые встречаются в разных местах. Например, S. mutans обнаружен в слюне, в зубном налете, а также на языке.
4. Возрастные микробиологические изменения. Следует различать две разные ситуации: (i) действительно возрастные изменения; (ii) изменения, вызванные появлением зубов — естественных твердых поверхностей, или имплантацией искусственных твердых поверхностей, таких как ортодонтические конструкции, зубные протезы.
5. Структура биопленки. С помощью методов молекулярной биологии различные бактериальные «обитатели» биопленок были сгруппированы в так называемые «комплексы». Первый «желтый комплекс» состоит в основном из стрептококков, которые представляют собой самых ранних колонизаторов [67]. Во втором «оранжевом комплексе» сгруппированы различные виды, наиболее важный из которых Fusobacterium nucleatum. Этот вид обладает высокой способностью коагрегировать с другими бактериями [68], таким образом «соединяя» виды раннего «желтого» комплекса с видами позднего «красного комплекса». Этот последний комплекс, состоящий из P. gingivalis, Tannerella forsythus и Treponema denticola, тесно связан с поддержанием и ухудшением течения пародонтита. Таким образом, происходит сукцессия в основном от факультативных видов (частично участвующих в развитии кариеса) ко все более и более анаэробному сообществу, которое, в конечном счете, ответственно за развитие гингивита и пародонтита [69].

Смешанная слюна включает «планктонную фазу» микробиоты полости рта. Подобно бактериальным лабораторным жидкостным культурам, слюна содержит до 10⁹ микроорганизмов на 1 мл, которые проглатываются непрерывно. Таким образом, около 5 г бактерий оказываются в желудке ежедневно.

Считается, что слюна не имеет собственной резидентной микробиоты, и количество бактерий в слюне, в отличие от зубного налета, не увеличивается во рту [70].

Белки, в первую очередь гликопротеины, действуют как основные питательные вещества для резидентной микробиоты полости рта, которая существует в виде многовидовых биопленок на различных поверхностях полости рта. Эти консорциумы взаимодействующих микроорганизмов (микробные сообщества) синтезируют многочисленные гликозидазы и протеазы и объединяют свои ферментативные ресурсы для катаболизма гликопротеинов и других молекул и для получения сахаров и аминокислот, необходимых для их роста. Эта резидентная микробиота естественна для полости рта и приносит пользу хозяину, например, предотвращая колонизацию экзогенными микроорганизмами, подавляя воспалительные реакции и превращая поступающие с пищей нитраты в нитриты, которые обладают антимикробной активностью, стимулируют выработку слизи и способствуют расширению сосудов [8].

Микробиота полости рта в здоровом состоянии очень разнообразна [71]. У каждого здорового индивидуума имеется 500–700 постоянных видов, из которых род Streptococcus наиболее распространен [72]. Основные представители микробиоты полости рта также: Leptotrichia, Porphyromonas, Prevotella, Propionibacterium, Staphylococcus, Veillonella и Treponema. Некоторые виды бактерий более специфичны для конкретного участка ротовой полости, в то время как другие могут существовать в разных сайтах одновременно [73]. Поскольку ротовая полость находится под постоянным воздействием экзогенных микроорганизмов при приеме пищи, питье и дыхании, не всегда легко определить, какие конкретные виды местные, а какие лишь транзиторные. Кроме того, микробиота полости рта различается в зависимости от возраста, пола [74]. Тем не менее, однажды установившись, микробиота полости рта остается относительно стабильной [75].

Как уже упоминалось, в норме в полости рта присутствует разнообразная микрофлора. Ротовая полость выполняет важную функцию защиты от колонизации внутренней среды организма патогенными бактериями [76].

Несмотря на то что наиболее распространенные заболевания полости рта, такие как кариес, гингивит и пародонтит, обусловлены присутствием микроорганизмов, наличие бактерий — необходимое, но недостаточное условие для развития этих заболеваний. Принято считать, что экологические условия, а именно микроокружение (микроэкология) играет ключевую роль в развитии этих видов патологии. То же самое относится к инфицированию грибами рода Candida и возникновению зубного стоматита (кандидоза). Большинство людей являются носителями Candida, но кандидоз полости рта встречается очень редко [77].

Подводя итог, можно сказать, что микробиота — важная часть полости рта. Однако когда эта чувствительная экосистема выходит из равновесия либо из-за перегрузки, либо из-за угнетения функций иммунной системы, это становится проблемой как с точки зрения протекания локального патологического процесса, так и для организма в целом. Таким образом, наиболее распространенный способ и золотой стандарт профилактики кариеса, гингивита и периодонтита — механическое удаление бактериальной биопленки путем регулярной чистки зубов, межзубных промежутков и посещение стоматологов [69].

Патологии полости рта

Заболевания пародонта и кариес зубов — наиболее распространенные заболевания полости рта, опосредованные биопленками. Эти виды патологии характерны для жителей как развивающихся, так и развитых стран [78].

Плохое состояние полости рта может оказывать сильное влияние на общее состояние здоровья, а некоторые заболевания полости рта связаны с хроническими болезнями (например, с диабетом) [79].

Пародонтит характеризуется образованием смешанных биопленок на зубах и тканях десны [80]. Данное заболевание представляет собой тип воспалительного процесса, инициированного формированием бактериальной биопленки и разрушающего поддерживающую ткань пародонта, что обычно ведет к потере зубов. Курение, ненадлежащая гигиена полости рта, травматическая окклюзия, воздействие определенных компонентов пищевых продуктов и системные заболевания, включая сердечно-сосудистые, также могут способствовать развитию пародонтита.

Кроме того, при прогрессировании пародонтита большую роль играет несбалансированная реакция иммунной системы на пародонтопатогены [45]. Пациенты, страдающие пародонтитом, имеют в 2–5 раз более высокий риск развития любого онкологического заболевания по сравнению с людьми, не имеющими пародонтита в анамнезе [81].

Из 400 видов бактерий, обнаруженных в пародонтальном кармане, не все являются характерными представителями микробиоты ротовой полости. Например, в исследовании [82] 69 из 400 пародонтальных бактерий были обнаружены только у некоторых индивидуумов.

Тем не менее только восемь видов бактерий постоянно связаны с развитием периодонтита: Actinobacillus actinomycetemcomitans, P. gingivalis, Tannerella forsythia, T. denticola, F. nucleatum, Eubacterium nodatum, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens [83]. Но поскольку эти виды иногда обнаруживаются и у здоровых людей, стало очевидным, что дисбиоз и относительное обилие видов патогенных бактерий — основной триггер возникновения заболевания [84]. Кроме того, в случае формирования межвидовых сообществ патологический процесс протекает намного интенсивнее, так как не один вид бактерий, а несколько работают синергетически.

Избыточная воспалительная реакция играет главную роль в проявлении клинических признаков патологии [85], хотя иммунный ответ должен способствовать защите от пародонтита, однако либо гипореактивность, либо гиперреактивность могут приводить к негативным последствиям [86]. При этом нарушение функций врожденной иммунной системы, представляющей первую линию защиты от патогенов, может играть важную роль в модуляции восприимчивости к заболеваниям, а также их тяжести [87]. Антимикробный пептид β-дефенсин hBD-1 и белок лактоферрин — это два элемента системы врожденного иммунитета, рассматривающиеся некоторыми исследователями [45] как ключевые факторы в реализации защитных механизмов полости рта.

Недавние исследования показали, что полиморфизм нескольких генов влияет на индивидуальную восприимчивость и прогрессирование пародонтита. В частности, результаты L. Zupin [45] предполагают участие генетических вариаций DEFB1 (ген, кодирующий пептид hBD-1) и LTF (кодирует лактоферрин) в предрасположенности к развитию пародонтита. C. Chen и соавт. [88] показали, что полиморфизм гена DEFB1 может быть связан с риском пародонтита.

Кариес зубов — инфекционное заболевание, это наиболее распространенный вид патологии, поражающей детей и подростков во всем мире [89]. Его вызывают многие факторы, но основную роль в патогенезе этого заболевания играет бактерия S. mutans, обладающая очень сильным кариесогенным потенциалом. В литературе сообщается [89] о положительной корреляции между присутствием S. mutans и кариесом зубов.

В области прогнозирования риска кариеса особое внимание уделяется анализу состава слюны [90]. Некоторые исследователи предполагают, что определение концентрации α- и β-дефенсинов и кателицидина в слюне человека можно будет использовать для раннего выявления лиц, подверженных риску развития этого заболевания [91, 92]. Известно, что β-дефенсин hBD2 демонстрирует бактерицидный эффект в отношении кариесогенных микроорганизмов, в первую очередь, S. mutans [93]. Кроме того, кателицидин LL-37 и α-дефенсины также обладают этим антибактериальным эффектом [94]. Однако учитывая, что развитие кариеса зависит от многих причин, в том числе от диеты, образа жизни, наличия хронических заболеваний и прочее, остается неясным, можно ли рассматривать сниженный уровень этих антимикробных пептидов в слюне в качестве предикторов риска развития кариеса, или он связан с сопутствующими патологическими процессами [95].

Рак языка. Плоскоклеточная карцинома языка — наиболее распространенное злокачественное новообразование в полости рта, оно демонстрирует тяжелую клиническую картину с высокими инвазивностью и частотой метастазирования [96]. База данных GLOBOCAN в 2018 г. представила результаты анализа 354 864 новых случаев злокачественных опухолей ротовой полости (включая рак губы) во всем мире. Несмотря на постоянное совершенствование стратегий выявления и лечения рака, показатели выживаемости пациентов с плоскоклеточной карциномой языка остаются удручающими, а в 2018 г. во всем мире рак губы и ротовой полости стал причиной 177 384 смертей [97]. Для улучшения диагностики и лечения пациентов первостепенное значение имеет прогнозирование метастазирования опухоли и понимание факторов, способствующих или ингибирующих инвазию малигнизированных клеток.

На основании анализа противоопухолевых свойств различных защитных пептидов человека установлено, что кателицидин LL-37 проявляет противоопухолевую активность при раке желудка, ротовой полости и гематологических заболеваниях [98]. hCAP18/LL-37 присутствует в нормальной слизистой оболочке полости рта и в эпителии языка человека [99]. Недавно было обнаружено, что уровень экспрессии гена CAMP, кодирующего hCAP18/LL-37, существенно снижается при низкодифференцированной плоскоклеточной карциноме полости рта по сравнению с его уровнем в нормальной слизистой оболочке полости рта. Низкая экспрессия гена hCAP18/LL-37 также коррелировала с метастазированием в лимфатические узлы и прогрессированием опухоли [100]. Тем не менее роль hCAP18/LL-37 в развитии плоскоклеточной карциномы языка до сих пор не ясна [101].

Экспрессия и полиморфизм генов пептидов слюны

На сегодняшний день совершенствование методов диагностики, лечения и профилактики гингивита и пародонтита необходимо в связи с большой распространенностью данных воспалительных заболеваний полости рта. Развитие таких процессов происходит в результате нарушения равновесия между агрессивными факторами внешней среды и защитными факторами макроорганизма [102]. Активация системы врожденного иммунитета в полости рта включает повышение экспрессии генов, продукции, секреции ряда плюрипотентных молекул. Среди них β-дефенсины, а также другие катионные антимикробные пептиды широкого спектра действия (например, гистатин 5), активные в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, грибов и вирусов [103].

Исследование зависимости между уровнем экспрессии генов β-дефенсинов и воспалительными заболеваниями пародонта показало, что уровни экспрессии β-дефенсинов 1, 2 и 3 могут изменяться [104]. Тем не менее исследования, которые сообщают об этом, противоречивы [105].

При проведении сравнительного анализа экспрессии генов HBD1, 2 и 3 в здоровых и воспаленных тканях десны H. Dommisch и соавт. [106] установили, что для трех β-дефенсинов человека наблюдаются различные уровни экспрессии. Авторы не обнаружили существенных различий в экспрессии HBD1, 2 и 3 в здоровой десне. В образцах гингивита экспрессия гена HBD2 была на более высоком уровне, чем экспрессия HBD1 и 3 [107]. В образцах биопсии тканей десны при пародонтите уровни экспрессии генов HBD2 и HBD3 были сходными и значительно превышали уровень экспрессии гена HBD1, что подтверждает сложившиеся ранее представления о конститутивной экспрессии гена HBD1. При этом получены данные, свидетельствующие о более позднем повышении экспрессии гена HBD3 по сравнению с HBD2.

Первая стадия клинических проявлений воспаления полости рта (гингивит) также показывает раннюю активацию экспрессии гена HBD2. Пародонтит приводит к активации гена HBD3, в то время как экспрессия гена HBD2 уже повышена к данному моменту.

Таким образом, экспрессия генов β-дефенсинов человека оказалась сходной в здоровой десне, в то время как для индуцибельной продукции дефенсина hBD-2 показан более высокий уровень транскрипции гена в ткани с развитием воспалительного заболевания [106].

Однако в литературе есть противоположная информация. P. Wang и соавт. [108] обнаружили, что экспрессия генов β-дефенсинов 1, 2 и 3 были несколько ниже в группе больных хроническим пародонтитом по сравнению с группой клинически здоровых лиц. Например, при сравнении уровней экспрессии β-дефенсина 3 и тяжести заболевания методом иммуноферментного анализа показана обратная корреляция [109].

Существует и третья категория данных, в которых сообщается, что нет существенных отличий в экспрессии β-дефенсинов в норме и при патологии. X. Li и соавт. [110] не обнаружили существенных различий в уровне β-дефенсинов 1, 2, 3 и 4 между здоровыми добровольцами и группой пациентов с пародонтитом на уровне белка, либо на уровне гена.

Чтобы понять, чем вызваны такие противоречивые результаты, необходимо иметь в виду многообразие факторов, влияющих на протекание защитных реакций в полости рта, наличие различных стимулов, вызывающих ответ организма, в том числе продукцию цитокинов клетками иммунной системы [111, 112], стадию заболевания, наличие сопутствующей патологии, а также генетический аспект.

Последний фактор связан с тем, что индивидуальные генетические вариации в генах, кодирующих β-дефенсины, могут влиять на экспрессию генов и выработку пептидов. Например, в исследованиях V. Polesello и соавт. [113] было показано, что полиморфизм гена DEFB1 может обусловливать повышенную продукцию пептида hBD-1 и, следовательно, в конечном счете определять характер реакции врожденной иммунной системы и эффективность противоинфекционной защиты полости рта в целом.

Есть также информация об экспрессии генов β-дефенсинов при других патологиях ротовой полости. Например, хотя этиология орального плоского лишая — хронического воспалительного заболевания слизистой оболочки полости рта — еще недостаточно изучена, V. Polesello и соавт. [114] сравнили концентрации hBD-1 в слюне у пациентов с оральным плоским лишаем и у здоровых лиц и обнаружили, что концентрация hBD-1 была значительно выше у пациентов с данным заболеванием по сравнению с контролем.

Исследования S. Joly и соавт. [115] показали, что процессы экспрессии генов и ее регуляция изменяются при развитии опухолевого процесса в ротовой полости. Установлено, что базальная экспрессия мРНК для hBD-1, -2 значительно снижена в клеточной линии, полученной от пациентов с плоскоклеточным раком полости рта, по сравнению с нормальными клетками. Показано, что количество дефенсинов hBD-1, -2 и -3 в клеточных линиях плоскоклеточного рака полости рта, продуцируемых в ответ на стимуляцию цитокинами (интерлейкином 1β, фактором некроза опухоли α, интерфероном γ (100 нг/мл), а также как низкими (200 нг/мл), так и высокими дозами (10 мкг/мл) липополисахарида E. coli), было минимальным.

Эти результаты позволяют предположить значимость β-дефенсинов в реализации защитных реакций при опухолевом росте и указывают на то, что данные пептиды могут быть использованы в качестве маркеров при оценке эффективности химиотерапии у пациентов с плоскоклеточным раком полости рта [115]. Однако работы, посвященные раскрытию молекулярных механизмов участия β-дефенсинов в канцерогенезе, немногочисленны, и их роль в канцерогенезе до конца не ясна.

Таким образом, несмотря на многочисленные исследования, которые указывают на то, что β-дефенсины служат потенциальными биомаркерами различных заболеваний, необходимы дальнейшие исследования [104]. Их прогностическая значимость пока полностью не раскрыта. Хорошо известно, что дефенсины, как и другие АМП, являются аларминами, то есть повышение их уровня в биологической жидкости или изменение экспрессии генов в клетках, где они продуцируются, говорит о развитии воспалительного процесса практически любой этиологии. Поэтому для дифференциальной диагностики заболеваний, в том числе различных видов патологии полости рта, необходим учет дополнительных критериев или более глубокое исследование полиморфизма генов пептидов, что также может предоставить информацию о предрасположенности к развитию определенного инфекционного заболевания. С другой стороны, можно ожидать, что природные защитные пептиды скоро найдут широкое применение в медицине. Даже не связанные с проявлением антимикробного действия свойства АМП уже находят практическое применение, о чем свидетельствует использование hBD-1 для выявления и лечения бесплодия [116], что говорит о перспективности дальнейшего исследования природных защитных пептидов.

Заключение

Полость рта заселена более 700 видами различных микроорганизмов и является сферой, где присутствует баланс между защитными факторами и патогенными микробами. Однако при ослаблении иммунитета такое равновесие нарушается, что приводит к развитию инфекционного процесса в ротовой полости. В настоящее время в связи с появлением новых инфекций, в частности, коронавирусной инфекции, исследование защитных факторов различных барьерных органов и тканей — особо важная задача.

В смешанной слюне присутствует широкий спектр белков и пептидов, проявляющих антимикробную активность: α- и β-дефенсины, кателицидины, гистатины, лизоцим, лактоферрин. Источник этих соединений — эпителиальные клетки, нейтрофильные гранулоциты и ряд других клеток, участвующих в реализации защитных функций. Концентрация данных молекул в норме невысока, повышается при патологии.

Одни из преобладающих компонентов секретов слюнных желез — ПБП. Значимость ПБП слюнной жидкости для осуществления противоинфекционной защиты до настоящего времени остается невыясненной, данные об эффектах этих соединений неоднозначны, зачастую противоречивы. Болезни полости рта, например периодонтит, пародонтоз, гингивит и др., — частая проблема для человека, особенно это касается лиц преклонного возраста, что определяет актуальность исследований, направленных на выяснение роли в патогенезе этих заболеваний как известных защитных молекул — АМП, так и остающихся малоизученными ПБП. Можно предположить, что биологический эффект ПБП реализуется не при их прямом контакте с патогенами, а при взаимодействии с другими компонентами слюны — АМП и др. Именно такое взаимодействие, возможно, позволяет ПБП модулировать функциональную активность защитных факторов слюны. Значимость подобных белок-белковых взаимодействий можно предположить, исходя из наличия в ПБП пролин-богатых участков, сходных с последовательностями, входящими в состав многих регуляторных белков, содержащих специфические обогащенные пролином мотивы, определяющие их биологическую активность. Исследование совместного действия ПБП и антимикробных пептидов слюны представляется важной задачей, учитывая, что концентрация ПБП в ротовой жидкости на порядок выше концентрации дефенсинов, кателицидина и других АМП, и выяснение возможности влияния ПБП на реализацию защитных свойств АМП и других эффекторных и регуляторных молекул представляет несомненный интерес. В заключение хочется подчеркнуть перспективность изучения межмолекулярного взаимодействия многообразных защитных факторов смешанной слюны, которое позволит выявить новые пути диагностики и терапии инфекционных заболеваний ротовой полости. В настоящее время накоплен существенный материал, позволяющий обоснованно рассматривать антимикробные пептиды и ПБП слюны в качестве потенциальных прогностических средств для выявления предрасположенности к заболеваниям ротовой полости различной этиологии, средств оценки эффективности терапии при тяжелых инфекционных процессах, развитии злокачественных новообразований, а также прототипов новых антимикробных препаратов.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Работа выполнена по теме государственного задания № 122020300189-6.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Наибольший вклад распределен следующим образом: М.С. Сухарева — подбор литературы, обобщение, анализ и интерпретация литературных данных, написание рукописи; О.В. Шамова — анализ и интерпретация литературных данных, корректировка рукописи.

Additional information

Funding source: This work is performed according to the State assignments No. 122020300189-6.

Competing interests: The authors declare that they have no competing interests.

Author contribution: All authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the study.

Personal contribution of each author: M.S. Sukhareva: selection the literature, summarizing, analysis and interpretation of literary data, writing the manuscript; O.V. Shamova: analysis and interpretation of literary data, correction the text of the manuscript.

About the authors

Maria S. Sukhareva

Institute of Experimental Medicine

Email: masha.suxareva@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5351-7199
SPIN-code: 5269-4578

Junior Researcher

Russian Federation, Saint Petersburg

Olga V. Shamova

Institute of Experimental Medicine

Author for correspondence.
Email: oshamova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5168-2801
SPIN-code: 2913-4726

Dr. Sci. (Biology), Сorresponding Member of RAS, Head of the Department

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files