СИНЕРГИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ ВОЗДЕЙСТВИЯ ЭКЗОГЕННОГО P53 И БУТИРАТА НАТРИЯ НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК



Цитировать

Полный текст

Аннотация

Актуальность. Белок P53 - транскрипционный фактор, регулирующий экспрессию генов, ассоциированных с множеством клеточных функций, включая остановку клеточного цикла, апоптоз, пролиферацию клеток, репарацию ДНК и др. Статус многофункционального онкосупрессора делает P53 привлекательной и многообещающей мишенью для терапии рака.

Цель - анализ влияния комбинированного воздействия трансфекции плазмиды, кодирующей ген p53 (генетический метод), ингибитора гистоновых деацетилаз бутирата натрия (эпигенетическое регулирование) и сокультивирования с экзосомами, секретируемыми клетками с диким типом P53 (моделирование межклеточной коммуникации) на выживаемость клеточных линий различных опухолей человека.

Материалы и методы. Исследование проведено на четырех перевиваемых клеточных линиях: клетках линий HeLa (эпителиоидная карцинома шейки матки) и HT-1080 (фибросаркома), несущих ген p53 дикого типа, а также клетках линий K562 (хроническая миелогенная лейкемия) и Gl-V (первичная культура клеток глиомы) дефектных по гену p53 (P53-/-).

Трансфекцию клеток проводили созданной в нашей лаборатории плазмидой P53-GFP, кодирующей белок P53, несущий на N-конце зеленый флуоресцентный белок (GFP). Успешное прохождение трансфекции отслеживали по экспрессии белка P53-GFP с помощью конфокального микроскопа. Уровень содержания белка P53 в клетках определяли методом вестерн блоттинга. Для количественной оценки пролиферации и параметров клеточного цикла в условиях ингибирования деацетилаз в культуральную среду добавляли бутират натрия (NaBu) до конечной концентрации 2,5 мМ. Анализ проводили с помощью автоматического счетчика клеток, техники проточной цитометрии, либо по способности клеток образовывать колонии. Экзосомы выделяли из накопленной кондиционированной среды методом ультрацентрифугирования.

Результаты. При использовании только одного из вышеперечисленных подходов результат в значительной степени зависел от статуса P53 в анализируемых опухолевых клетках. Комбинация коррекции эпигенетического профиля посредством ингибирования активности деацетилаз с генетической регуляцией или с экзосомами от клеток с диким типом P53 продемонстрировала значительный синергический эффект и увеличение эффективности подавления роста опухолевых клеток в несколько раз по сравнению с использованием монотерапии.

Заключение. По-видимому, стратегия совместного использования генетических методов, эпигенетической корректировки и особенностей межклеточной коммуникации, влияющих на различные части регуляторной сети P53, позволит существенно усилить эффективность противоопухолевой терапии, нацеленной на P53.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Роман Александрович Ковалёв

Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра «Курчатовский институт»

Email: kovalev_ra@pnpi.nrcki.ru
ORCID iD: 0000-0003-2214-0269
SPIN-код: 1386-2357
Scopus Author ID: 55634543500

Младший научный сотрудник

Россия, 188300, Россия, Ленинградская обл., г.Гатчина, Орловая роща д.1

Елена Вячеславовна Семенова

Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра «Курчатовский институт»

Email: semenova_el.spb@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0852-6595
SPIN-код: 2758-6825
Scopus Author ID: 7102695886

Научный сотрудник

Россия, 188300, Россия, Ленинградская обл., г.Гатчина, Орловая роща д.1

Татьяна Александровна Штам

Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра «Курчатовский институт»

Email: Shtam_ta@pnpi.nrcki.ru
ORCID iD: 0000-0003-0651-4785
SPIN-код: 3738-8187
Scopus Author ID: 6508065266

Старший научный сотрудник

Россия, 188300, Россия, Ленинградская обл., г.Гатчина, Орловая роща д.1

Владимир Станиславович Бурдаков

Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра «Курчатовский институт»

Email: Burdakov_vs@pnpi.nrcki.ru
ORCID iD: 0000-0001-6025-7367
SPIN-код: 8832-9047
Scopus Author ID: 55347037600

Младший научный сотрудник

Россия, 188300, Россия, Ленинградская обл., г.Гатчина, Орловая роща д.1

Елена Юрьевна Варфоломеева

Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра «Курчатовский институт»

Автор, ответственный за переписку.
Email: Varfolomeeva_EY@pnpi.nrcki.ru
ORCID iD: 0000-0003-3287-4709
SPIN-код: 9426-1667
Scopus Author ID: 6701723593

Старший научный сотрудник

188300, Россия, Ленинградская обл., г.Гатчина, Орловая роща д.1

Список литературы

  1. Brown C.J., Lain S., Verma C.S. et al. Awakening guardian angels: Drugging the p53 pathway // Nat. Rev. Cancer. 2009. Vol. 9, No. 12. P. 862–873. doi: 10.1038/nrc2763.
  2. Levine A.J., Oren M. The first 30 years of p53: growing ever more complex // Nat. Rev. Cancer. 2009. Vol. 9, No. 10. P. 749-758. doi: 10.1038/nrc2723.
  3. Goh A.M., Coffill C.R., Lane D.P. The role of mutant p53 in human cancer // J. Pathol. 2011. Vol. 223, No. 2. P. 116-126. doi: 10.1002/PATH.2784.
  4. Vousden K.H., Prives C. Blinded by the light: the growing complexity of p53 // Cell. 2009. Vol. 137 No. 3. P. 413-431. doi: 10.1016/j.cell.2009.04.037.
  5. Li X.L., Zhou J., Chen Z.R. et al. P53 mutations in colorectal cancer - molecular pathogenesis and pharmacological reactivation // World J Gastroenterol. 2015. Vol. 21, No. 1. P. 84-93. doi: 10.3748/wjg. v21.i1.84.
  6. Makarov E.M., Shtam T.A., Kovalev R.A. et al. The rare nonsense mutation in p53 triggers alternative splicing to produce a protein capable of inducing apoptosis // PLOS ONE. 2017. Vol. 12, No. 9, P. e0185126. doi: 10.1371/journal.pone.0185126.
  7. Ventura A., Kirsch D.G., McLaughlin M.E. et al. Restoration of p53 function leads to tumour regression in vivo // Nature. 2007. Vol. 445, No. 7128. P. 661–665. doi: 10.1038/nature05541.
  8. Xue W., Zender L., Miething C. et al. Senescence and tumour clearance is triggered by p53 restoration in murine liver carcinomas // Nature. 2007. Vol. 445, No. 7128. P. 656–660. doi: 10.1038/nature05529.
  9. Lane D.P., Cheok C.F., Lain S. P53-based cancer therapy // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2010. Vol. 2, No. 9. P. a001222. doi: 10.1101/cshperspect. a001222.
  10. Turner B.M. Reading signals on the nucleosome with a new nomenclature for modified histones // Nat. Struct. Mol. Biol. 2005. Vol. 12, No. 2. P. 110-112. doi: 10.1038/nsmb0205-110.
  11. Семенова Е.В., Филатов М.В. Генетические и эпигенетические маркеры глиом // Цитология. 2013. Т. 55, №5. C. 290-299.
  12. Ohashi M., Kanai F., Ueno H. et al. Adenovirus mediated p53 tumour suppressor gene therapy for human gastric cancer cells in vitro and in vivo // Gut. 1999. Vol. 44, No. 3. P. 366-371. doi: 10.1136/gut.44.3.366.
  13. Terui T., Murakami K., Takimoto R. et al. Induction of PIG3 and NOXA through acetylation of p53 at 320 and 373 lysine residues as a mechanism for apoptotic cell death by histone deacetylase inhibitors // Cancer Res. 2003. Vol. 63, No. 24. P. 8948-8954.
  14. Bandyopadhyay D., Mishra A., Medrano E. Overexpression of histone deacetylase 1 confers resistance to sodium butyrate- mediated apoptosis in melanoma cells through a p53-mediated pathway // Cancer Res. 2004. Vol. 64, No. 21. P. 7706-7710. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-03-3897.
  15. Marouco D., Garabadgiu A.V., Melino G. et al. Lysine-specific modifications of p53: a matter of life and death? // Oncotarget. 2013. Vol. 4, No. 10. P. 1556-1571. doi: 10.18632/oncotarget.1436.
  16. Xie C., Wu B., Chen B. et al. Histone deacetylase inhibitor sodium butyrate suppresses proliferation and promotes apoptosis in osteosarcoma cells by regulation of the MDM2-p53 signaling // Onco Targets Ther. 2016. Vol. 9. P. 4005-4013. doi: 10.2147/OTT.S105418.
  17. Ковалев Р.А., Штам Т.А., Карелов Д.В и др. Ингибиторы гистоновых деацетилаз вызывают TP53-зависимую индукцию p21/Waf1 в опухолевых клетках, несущих мутации в гене TP53 // Цитология. 2015. T. 57, № 3. C. 204–211. doi: 10.1134/S1990519X15030086.
  18. Ковалёв Р.А., Штам Т.А., Ибатулин Ф.М. и др. Возможности противоопухолевой терапии эпигенетической направленности на моделях in vitro // Вопросы онкологии. 2012. Т. 58, № 6. С. 800-807.
  19. Sossai P. Butyric acid: what is the future for this old substance? // Swiss Med. Wkly. 2012. Vol. 142: w13596. doi: 10.4414/smw.2012.13596.
  20. Mu D., Gao Z., Guo H. et al. Sodium butyrate induces growth inhibition and apoptosis in human prostate cancer DU145 cells by up-regulation of the expression of annexin A1 // PLoS One. 2013. Vol. 8, No. 9. P. e74922. doi: 10.1371/journal.pone.0074922.
  21. Букреева Е.И., Аксенов Н.Д., Бардин А.А. и др. Действие ингибитора гистоновых деацетилаз на трансформанты E1A + cHa-Ras, экспрессирующие р53 дикого типа с подавленной трансактивирующей активностью // Цитология. 2009. T. 51, № 8. C. 697-705.
  22. Guo H., Choudhury Y., Yang J. et al. Antiglioma effects of combined use of a baculovirual vector expressing wild-type p53 and sodium butyrate // J. Gene Med. 2011. Vol. 13, No. 1. P. 26-36. doi: 10.1002/jgm.1522.
  23. Minucci S., Pelicci P.G. Histone deacetylase inhibitors and the promise of epigenetic (and more) treatments for cancer // Nat. Rev. Cancer. 2006. Vol. 6, No. 1. P. 38-51. doi: 10.1038/nrc1779.
  24. Yoo C.B., Jones P.A. Epigenetic therapy of cancer: past, present and future // Nat Rev Drug Discov. 2006. Vol. 5, No. 1. P. 37-50. doi: 10.1038/nrd1930.
  25. Yu J, Qiu S, Ge Q. et al. A novel SAHA-bendamustine hybrid induces apoptosis of leukemia cells // Oncotarget. 2015. Vol. 6, No. 24. P. 20121-31. doi: 10.18632/oncotarget.4041.
  26. Qiu L., Kelso M.J., Hansen C. et al. Anti-tumour activity in vitro and in vivo of selective differentiating agents containing hydroxamate // Br. J. Cancer. 1999. Vol. 80, No. 8. P. 1252-1258. doi: 10.1038/sj.bjc.6690493.
  27. Lee J.H., Choy M. L., Ngo L. et al. Histone deacetylase inhibitor induces DNA damage, which normal but not transformed cells can repair // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. Vol. 107, No. 33. P. 14639-14644. doi: 10.1073/pnas.1008522107.
  28. Grange C., Tapparo M., Collino F. et al. Microvesicles released from human renal cancer stem cells stimulate angiogenesis and formation of lung premetastatic niche // Cancer Res. 2011. Vol. 71, No. 15. P. 5346-5356. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-11-0241.
  29. Kobayashi M., Salomon C., Tapia J. et al. Ovarian cancer cell invasiveness is associated with discordant exosomal sequestration of Let-7 miRNA and miR-200 // J. Transl. Med. 2014. Vol. 12. P. 4. doi: 10.1186/1479-5876-12-4.
  30. Kovalev R.A., Burdakov V.S., Varfolomeeva E.Y. et al. Exosomes infl uence the engraftment of tumor cell lines in athymic mice BALB/c nude // Biosci. Biotech. Res. Comm. 2018. Vol.11, No. 4. P. 535-54. doi: 10.21786/bbrc/11.4/1.
  31. Raimondo F., Morosi L., Chinello C. et al. Advances in membranous vesicle and exosome proteomics improving biological understanding and biomarker discovery // Proteomics. 2011. Vol. 11, No. 4. P. 709-720. doi: 10.1002/pmic.201000422.
  32. Ung T.H., Madsen H.J., Hellwinkel J.E. et al. Exosome proteomics reveals transcriptional regulator proteins with potential to mediate downstream pathways // Cancer science. 2014. Vol. 105, No. 11. P. 1384-1392. doi: 10.1111/cas.12534.
  33. Yu S., Cao H., Shen B. et al. Tumor-derived exosomes in cancer progression and treatment failure // Oncotarget. 2015. Vol. 6, No. 35. P. 37151-37168. doi: 10.18632/oncotarget.6022.
  34. Webber J., Yeung V., Clayton A. Extracellular vesicles as modulators of the cancer microenvironment // Semin. Cell Dev. Biol. 2015. Vol. 40. P. 27-34. doi: 10.1016/j.semcdb.2015.01.013.
  35. Jørgensen M.M., Bæk R., Varming K. Potentials and capabilities of the extracellular vesicle (EV) array // J. Extracell. Vesicles. 2015. Vol. 4. P. 26048. doi: 10.3402/jev.v4.26048.
  36. Fujita Y., Yoshioka Y., Ochiya T. Extracellular vesicle transfer of cancer pathogenic components // Cancer Sci. 2016. Vol. 107, No 4. P. 385-90. doi: 10.1111/cas.12896.
  37. Shtam T.A., Kovalev R.A., Varfolomeeva E.Y. et al. Exosomes are natural carriers of exogenous siRNA to human cells in vitro // Cell Commun. Signal. 2013. Vol. 11. P. 88. doi: 10.1186/1478-811X-11-88.
  38. Бурдаков B.C., Ковалев Р.А., Пантина Р.А. и др. Экзосомы осуществляют передачу белка p53 между клетками и могут подавлять рост p53-отрицательных клеток // Цитология. 2017. T. 59, № 9. C. 588–594. doi: 10.1134/S1990519X18010030.
  39. Urata Y.N., Takeshita F., Tanaka H. et al. Targeted knockdown of the kinetochore protein D40/Knl-1 inhibits human cancer in a p53 status-independent manner // Sci. Rep. 2015. Vol. 5. P. 13676. doi: 10.1038/srep13676.
  40. Neubauer A., He M., Schmidt C.A. et al. Genetic alterations in the p53 gene in the blast crisis of chronic myelogeneous leukemia - analysis by polymerase chain reaction-based techniques // Leukemia. 1993. Vol. 7, No. 4. P. 593-600.
  41. Filatov M.V., Pantina R.A., Noskin L.A. Methods for registration of spontaneous DNA instability in mammalian cells // Mutat. Res. 1998. Vol. 403, No. 1-2. P. 95-101. doi: 10.1016/s0027-5107(98)00056-6.
  42. Belloc F., Dumain P., Boisseau M.R. at al. A flow cytometric method using Hoechst 33342 and propidium iodide for simultaneous cell cycle analysis and apoptosis determination in unfixed cells // Cytometry. 1994. Vol. 17, No. 1. P.59-65. doi: 10.1002/cyto.990170108.
  43. Naryzhny S.N. Blue Dry Western: Simple, economic, informative, and fast way of immunodetection // Anal. Biochem. 2009. Vol. 392, No. 1. P. 90-95. doi: 10.1016/j.ab.2009.05.037.
  44. Kastenhuber E.R., Lowe S.W. Putting p53 in context // Cell. 2017. Vol. 170, No. 6. P. 1062–1078. doi: 10.1016/j.cell.2017.08.028.
  45. Zhang S., Carlsen L., Hernandez Borrero L. et al. Advanced strategies for therapeutic targeting of wild-type and mutant p53 in cancer // Biomolecules. 2022. Vol. 12, No. 4. P. 548. doi: 10.3390/biom12040548.
  46. Tchelebi L., Ashamalla H., Graves P.R. Mutant p53 and the response to chemotherapy and radiation // Subcell Biochem. 2014. Vol. 85. P. 133-59. doi: 10.1007/978-94-017-9211-0_8.
  47. Saldaña-Meyer R., Recillas-Targa F. Transcriptional and epigenetic regulation of the p53 tumor suppressor gene // Epigenetics. 2011. Vol. 6, No. 9. P. 1068-77. doi: 10.4161/epi.6.9.16683.
  48. Hao Q., Lu H., Zhou X. A potential synthetic lethal strategy with PARP inhibitors: Perspective on ‘Inactivation of the tumor suppressor p53 by long noncoding RNA RMRP’ // J. Mol. Cell Biol. 2021. Vol. 13, No. 9. P. 690–692. doi: 10.1093/jmcb/mjab049.
  49. Tazawa H., Kagawa S., Fujiwara T. Advances in adenovirus-mediated p53 cancer gene therapy // Expert Opin. Biol. Ther. 2013. Vol. 13, No. 11. P. 1569-83. doi: 10.1517/14712598.2013.845662.
  50. Pagliaro L.C., Keyhani A., Williams D. et al. Repeated intravesical instillations of an adenoviral vector in patients with locally advanced bladder cancer: a phase I study of p53 gene therapy // J. Clin. Oncol. 2003. Vol. 21, No. 12. P. 2247-53. doi: 10.1200/JCO.2003.09.138.
  51. Gabrilovich D.I. INGN 201 (Advexin): adenoviral p53 gene therapy for cancer // Expert Opin. Biol. Ther. 2006. Vol. 6, No. 8. P. 823-832. doi: 10.1517/14712598.6.8.823.
  52. Valente J.F.A., Queiroz J.A., Sousa F. p53 as the focus of gene therapy: past, present and future // Curr. Drug Targets. 2018. Vol. 19, No. 15. P. 1801-1817. doi: 10.2174/1389450119666180115165447.
  53. Kijima M., Yoshida M., Sugita K. et al. Trapoxin, an antitumor cyclic tetrapeptide, is an irreversible inhibitor of mammalian histone deacetylase // J. Biol. Chem. 1993. Vol. 268, No. 30. P. 22429-35.
  54. Hsi L.C., Xi X., Lotan R. et al. The histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid induces apoptosis via induction of 15-lipoxygenase-1 in colorectal cancer cells // Cancer Res. 2004. Vol. 64, No. 23. P. 8778-81. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-04-1867.
  55. Takimoto R., Kato J., Terui T. et al. Augmentation of antitumor effects of p53 gene therapy by combination with HDAC inhibitor // Cancer Biol. Ther. 2005. Vol. 4, No. 4. P. 421-428. doi: 10.4161/cbt.4.4.1620.
  56. Lain S., Hollick J.J., Campbell J. et al. Discovery, in vivo activity, and mechanism of action of a small-molecule p53 activator // Cancer Cell. 2008. Vol. 13, No. 5. P. 454-63. doi: 10.1016/j.ccr.2008.03.004.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Эко-Вектор,


СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 74760 от 29.12.2018 г.