Study of immunogenicity and safety of a candidate rotavirus vaccine based on a recombinant hybrid protein

Full Text

Список сокращений

АОК — антителообразующие клетки; в/в — внутривенно; в/м — внутримышечно; ГЗТ — гиперчувствительность замедленного типа; ГФ — государственная фармакопея; Мф — макрофаг; ФИ — фагоцитарный индекс; ИР — изотонический раствор натрия хлорида; ФЧ — фагоцитарное число; у. е. — условные единицы; ЭБ — эритроциты барана; FliC — участок флагеллина Salmonella; EP — European Pharmacopoeia (Европейская Фармакопея); VP — virus protein (вирусный белок).

Обоснование

Ротавирусная инфекция — распространенная причина острого гастроэнтерита у детей как в развитых, так и в развивающихся странах [10, 15]. Ротавирусная инфекция приводит к 611 000 смертельных случаев от диареи в год [10]. Вакцинация является в настоящее время единственным средством, которое позволяет предотвратить тяжелое и смертельное течение данного заболевания [8, 13, 14]. В мире разработаны и применяют вакцины для профилактики ротавирусной инфекции, такие как Rotarix™ (GlaxoSmithKline Biologicals Rixensart, Бельгия), RotaTeq^® (Merck and Co., Inc. Whitehouse Station, New Jersey, США), Rotavac^® (Индия) [8]. Данные вакцины основаны на живых аттенуированных штаммах ротавируса человеческого и/или животного происхождения, но использование в вакцинах даже ослабленного вируса может приводить к нежелательным рискам. Изучаемая кандидатная вакцина против ротавирусной инфекции создана на основе гибридного рекомбинантного белка FliCVP6VP8, который включает фрагмент вирусного белка virus protein 6 (VP6), фрагмент белка virus protein 8 (VP8) ротавируса А, компоненты флагеллина Salmonella typhimurium FliC. Создание гибридного белка FliCVP6VP8 подробно описано авторами ранее [1]. Выбранные фрагменты — это консервативные части белков VP6 и VP8, участвующие в развитии протективного иммунитета против ротавирусной инфекции. Вакцина содержит также компоненты флагеллина S. typhimurium FliC. Флагеллин обладает адъювантным потенциалом за счет провоспалительного и иммуностимулирующего действия [11, 18], поэтому включение флагеллина в качестве адъюванта позволяет создавать безопасные, мощные вакцины. Ранее была продемонстрирована высокая эффективность кандидатной вакцины на модели ротавирусной инфекции у мышей Balb/c [2].

Целью данной работы было изучение иммуногенности и показателей безопасности кандидатной вакцины против ротавирусной инфекции в рамках доклинических исследований.

Материалы и методы

Кандидатная вакцина «Вакцина против ротавирусной инфекции, рекомбинантная» представляет собой суспензию для внутримышечного (в/м) введения. Активный компонент вакцины — химерный белок FliCVP6VP8, полученный методом рекомбинантных ДНК-технологий. Культура клеток E. coli была трансформирована путем включения в их геном гена, кодирующего химерный белок из иммуногенных эпитопов двух поверхностных белков ротавируса VP6, VP8 и фрагмента флагеллина S. typhimurium. В качестве адъюванта в вакцине присутствует гидроксид алюминия. Одна ампула препарата содержит активный компонент — 0,02 мг рекомбинантного белка FliCVP6VP8; вспомогательные компоненты — 25,0 мг маннитола (European Pharmacopoeia, EP); 0,36 мг натрия сукцината (EP/The United States Pharmacopeia, USP); 0,05 мг полисорбата 20 (EP); 0,5 мг гидроксида алюминия (EP); до 0,5 мл воды для инъекций (ФС.2.2.0019.15). Взрослая терапевтическая доза вакцины для человека при в/м введении составляет 0,5 мл. Фармацевтическую разработку композиции вакцины проводили в рамках ПНИЭР «Доклинические исследования кандидатной вакцины против ротавирусной инфекции на основе рекомбинантного белка FliCVP6VP8» (ГК № 14.N08.12.1028).

Животные (мыши, крысы, кролики, морские свинки) поступали из питомника лабораторных животных «Рапполово» и содержались в условиях вивария. Все процедуры по рутинному уходу за животными выполняли в соответствии со стандартными операционными процедурами лаборатории. Основные правила содержания и ухода соответствовали Европейской конвенции по защите позвоночных животных (Страсбург, 1986). Номер ветеринарного регистрационного удостоверения — 78-07095 от 31.05.2016. Эвтаназию проводили путем помещения животных (мышей и крыс) в камеру, содержащую СО₂, и последующей декапитации. Объем работ и перечень процедур одобрен биоэтической комиссией института.

Иммуногенность кандидатной вакцины исследовали на мышах линии BALB/c 9–12-недельного возраста. Мыши были разделены на три группы (по 10 животных в каждой): первая группа — контроль — интактные животные; вторая группа — однократная иммунизация — введение препарата однократно на «0» день по 0,5 мл; третья группа — двукратная иммунизация — введение препарата на «0»день по 0,5 мл и на 14-й день опыта по 0,5 мл. На 28-е сутки опыта (14-й день после второй иммунизации) животных подвергали эвтаназии и после декапитации собирали кровь, из цельной крови получали сыворотку. У 5 мышей из первой группы и 10 мышей из третьей группы также получали селезенку для оценки антиген-специфической пролиферации спленоцитов.

Титр антител в сыворотках крови определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа. Покрывали целевым антигеном (гибридным рекомбинантным белком VP6VP8) в концентрации 3 мкг/мл (в 0,01 М натрий фосфатном буфере, pH 7,2–7,4) 96-луночные планшеты с высокой сорбционной способностью (Greiner, Германия). За титр антител принимали наибольшее разведение сыворотки, которое дает оптическую плотность по крайней мере в 2 раза больше, чем сыворотка неиммунизированных мышей в том же разведении.

Для оценки антиген-специфической пролиферации спленоцитов клетки, полученные путем гомогенизации селезенок, инкубировали с конканавалином А или вакциной. Интенсивность пролиферации спленоцитов в образцах оценивали по интенсивности включения ³H тимидина с помощью жидкостного сцинтиллятора (Rackbeta 1217, Wallac, Финляндия) и выражали в импульсах в минуту.

Доклинические исследования острой и хронической токсичности, местно-раздражающего действия проводили в соответствии с действующими методическими рекомендациями [3]. Острую токсичность оценивали на белых беспородных крысах обоего пола (вес — 180–200 г, возраст — 9–10 нед.) и белых беспородных мышах обоего пола (вес — 19–21 г, возраст — 9–10 нед.). Животные были разделены на группы (по 6 самок и 6 самцов в каждой), препарат вводили двумя путями: внутривенно (в/в) или в/м. Вакцину вводили в/м: мышам в 1, 2, 3 и 5 терапевтических человеческих дозах на животное; крысам в 2, 3, 5, 10 или 20 дозах. Вакцину вводили в/в: мышам в 1, 2 или 3 дозах; крысам в 2, 3, 5 или 10 дозах. Животным контрольных групп по той же схеме вводили изотонический раствор натрия хлорида (ИР). С 1-х по 14-е сутки после введения препарата ежедневно проводили клинический осмотр, взвешивание, измеряли потребление корма и воды, ректальную температуру с помощью термометров с ректальными датчиками Oakton Instruments (США). На 14-е сутки все животные были подвергнуты эвтаназии и патоморфологическому исследованию.

Для оценки местно-раздражающего действия трем кроликам породы Шиншилла, самцам (вес — 2–2,5 кг, возраст — 2–3 мес.), на слизистую оболочку правого глаза наносили 0,1 мл вакцины, на слизистую оболочку левого глаза — 0,1 мл ИР. Возможную реакцию регистрировали в течение 24 ч с момента нанесения растворов.

Хроническую токсичность изучали на белых беспородных крысах обоего пола (вес — 180–200 г, возраст — 9–10 нед.). Вакцину вводили ежедневно в/м в течение 30 дней. Крысы были разделены на четыре группы (по 10 самок и 10 самцов в каждой). Животным контрольных групп вводили ИР. Вакцину вводили в 1, 2 или 3 человеческих терапевтических дозах. В течение периода введения препарата регистрировали массу и температуру тела, потребление корма и воды, анализировали поведенческую и двигательную активность, состояние сердечно-сосудистой системы, выполняли офтальмологические тесты и оценивали респираторную функцию. По окончании курса введения препарата проводили клинический анализ крови на анализаторе Abacus Junior vet5 (Diatron, Германия) и на мазках крови; биохимический анализ крови — на анализаторе Erba Chem 7 (Mannheim, Германия), а также анализ мочи — на анализаторе DocUReader (Elektronika, Венгрия) согласно методикам производителей. Затем крыс подвергали эвтаназии, осуществляли патоморфологическое и патогистологическое исследования.

Анализ пирогенности был проведен на кроликах породы Шиншилла, самцах (вес — 2–2,5 кг, возраст — 2–3 мес.), в соответствии с требованиями Государственной фармакопеи (ГФ XIII, ОФС 1.2.4.0005.15) [4]. Вакцину вводили в ушную вену в объеме 0,2 мл/кг.

Аллергенную активность препарата оценивали по реакциям общей и активной кожной анафилаксии и по реакции, отражающей гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) [3]. Реакцию общей анафилаксии (анафилактический шок) проводили на морских свинках обоего пола (вес — 200–250 г, возраст — 5–6 нед.). Животные были разделены на три группы (по 5 самок и 5 самцов в каждой). Животные контрольной группы получали ИР — первая инъекция подкожно, две последующие в/м через день. Животные первой и второй групп по той же схеме получали вакцину в дозе 0,5 мл или 1,5 мл на животное соответственно. Через 21 день после первого введения всем животным внутрисердечно вводили разрешающую дозу вакцины. Интенсивность анафилактического шока учитывали в индексах по Weigle [17]. Реакцию активной кожной анафилаксии проводили на белых беспородных мышах, мышах — гибридах F1 (CBA × C57Bl/6) обоего пола (вес — 19–21 г, возраст — 9–10 нед.). Мыши были разделены на три группы (по 5 самок и 5 самцов в каждой). Животные контрольной группы получали ИР — первая инъекция подкожно, две последующие в/м через день. Мыши в первой и во второй группах по той же схеме получали вакцину по 0,5 или 1,0 мл на животное соответственно. Через 21 день после первой инъекции вакцины всем мышам внутрикожно вводили вакцину в концентрации, не вызывающей кожно-раздражающего действия. Через 20 мин после введения препарата всем животным вводили в/в по 0,5 мл 1 % раствора красителя синего Эванса. Через 30 мин мышей умерщвляли и определяли размеры синего пятна на внутренней стороне кожи в месте введения препарата. Реакцию ГЗТ проводили на белых беспородных мышах, мышах — гибридах F1 (CBA × C57Bl/6) обоего пола (вес — 19–21 г, возраст — 9–10 нед.). Мыши были разделены на две группы (по 10 самок и 10 самцов в каждой). Животным опытной группы ежедневно в течение 7 дней в/в вводили вакцину в дозе 0,5 мл на животное. Животные контрольной группы по той же схеме получали ИР. Через 5 сут после последней инъекции всем мышам в подушечку задней лапы вводили 50 мкл вакцины, в контралатеральную лапу — ИР. Через 24 ч проводили эвтаназию, обе лапы отрезали выше пяточного сустава и взвешивали. Индекс реакции подсчитывали в процентах прироста массы лапы, в которую вводили препарат (М_о), по отношению к массе контрольной лапы (М_к) по формуле ((М_о – М_к) / М_к) · 100.

Иммунотоксичность исследовали на основании рекомендаций ГОСТ 58173-2018 [5]. Количество антителообразующих клеток (АОК) к эритроцитам барана (ЭБ) в селезенке мыши определяли на гибридах F1 (CBAxC57Bl6), которые были разделены на три группы (по 6 самок и 6 самцов в каждой). Мышам в контрольной группе однократно в/м вводили ИР, животным в первой и во второй группах по той же схеме вводили вакцину по 0,5 мл или по 1,0 мл на животное. Через час после введения вакцины или ИР все животные были проиммунизированы внутрибрюшинной инъекцией ЭБ в субоптимальной дозе 5 ∙ 10⁷ эритроцитов на мышь. Количество АОК в селезенке мышей подсчитывали на 5-е сутки после иммунизации. Определяли количество АОК в селезенках методом локального гемолиза в геле агарозы по методу N.K. Jerne [9]. Реакцию ГЗТ против ЭБ проводили на мышах — гибридах F1 (CBAxC57Bl6), которые были разделены на три группы (по 6 самок и 6 самцов в каждой). Мышам в контрольной группе однократно в/м вводили ИР, в опытных группах по той же схеме — вакцину: в первой группе — по 0,5 мл, во второй группе — по 1,0 мл. Через час после введения вакцины или ИР все животные были сенсибилизированы однократным подкожным введением в межлопаточную область 0,05 мл раствора, содержащего 2 ∙ 10⁵ ЭБ. На 5-е сутки после сенсибилизации всем животным в подушечку задней лапы вводили 10⁸ ЭБ в 0,05 мл ИР (разрешающая инъекция). В контралатеральную лапу вводили ИР в том же объеме. Через 24 ч оценивали реакции и подсчитывали индекс, как описано выше. Был проведен дополнительный эксперимент по оценке обратимости наблюдаемых изменений в реакции ГЗТ к ЭБ. Его отличием от первого эксперимента был 10-дневный интервал между введением вакцины и сенсибилизацией животных ЭБ.

Оценку фагоцитарной функции перитонеальных макрофагов (Мф) выполняли на мышах — гибридах F1 (CBAxC57Bl6), которые были разделены на три группы (по 6 самок и 6 самцов в каждой). Мышам в контрольной группе однократно в/м вводили ИР, в опытных группах по той же схеме животным вводили вакцину: в первой группе — по 0,5 мл, во второй группе — по 1,0 мл. Через сутки после инъекции вакцины осуществляли эвтаназию мышей и промывали брюшную полость культуральной средой. По 2 мл клеточной взвеси с концентрацией клеток 2 ∙ 10⁶/мл вносили в 40 мм чашки Петри и инкубировали в термостате при 37 °С в течение часа, отмывали неадгезированные клетки, после чего добавляли в среду опсонизированные дрожжи и инкубировали еще час. Препараты фиксировали и окрашивали по Романовскому – Гимзе. Под микроскопом подсчитывали количество фагоцитировавших дрожжи Мф, высчитывали фагоцитарный индекс (ФИ) (отношение количества фагоцитировавших Мф к общему количеству Мф, умноженное на 100 %) и среднее количество поглощенных дрожжей одним Мф — фагоцитарное число (ФЧ), которое выражали в условных единицах (у. е.).

Статистический анализ выполняли в программе Microsoft Excel 2007 (Microsoft Corporation). Результаты представлены в виде средних значений и ошибок среднего (М ± m) или стандартных отклонений (М ± ó). Показатели между группами сравнивали с помощью непарного t-критерия Стьюдента с неравными отклонениями, а также U критерия Манна – Уитни. Отличия считали достоверными при р < 0,05.

Результаты исследований

Исследование иммуногенности кандидатной вакцины

Для оценки иммуногенных свойств кандидатной вакцины определяли титр антител в сыворотках крови иммунизированных животных. На рис. 1 представлены результаты определения титров антител при использованных схемах вакцинации. Из полученных данных следует, что введение кандидатной вакцины вызывает значительное повышение титров антител в сыворотках крови мышей по сравнению с титрами мышей в контрольной группе. При этом при схеме опыта с двукратной иммунизацией формируются более высокие титры антител (1 : 128 000) в сравнении с таковыми при однократной иммунизации (1 : 64 000).

 

Рис. 1. Диаграмма зависимости оптической плотности при длине волны 450 нм от степени разведения сыворотки иммунизированных животных в эксперименте по определению иммуногенности кандидатной вакцины методом иммуноферментного анализа; # различия между группами «однократная иммунизация» и «контроль» достоверны, p < 0,05; * различия между группами «двукратная иммунизация» и «контроль» достоверны, p ≤ 0,05; количество мышей в группах n = 10; M ± m; результаты между группами сравнивали по U критерию Манна – Уитни. OD — оптическая плотность

 

Исследование антиген-специфического пролиферативного ответа

Результаты анализа антиген-специфического пролиферативного ответа представлены на рис. 2. Из полученных данных следует, что в группе животных, получивших по схеме двукратную иммунизацию кандидатной вакциной, значения стимулированной пролиферации значительно превосходят аналогичные показатели в контрольной группе животных. У мышей, иммунизированных кандидатной вакциной, пролиферативный ответ на вакцину или на конкавалин А (положительный контроль стимуляции) увеличился в среднем в 2 раза. Различия с контрольной группой были статистически достоверными.

 

Рис. 2. Диаграмма уровня включения 3Н тимидина в эксперименте по оценке антиген-специфической пролиферации спленоцитов; * различия с контрольной группой достоверны, р < 0,01; количество мышей в группах: контроль n = 5, иммунизация вакциной n = 10; M ± s; результаты между группами сравнивали по U критерию Манна – Уитни. Имп/мин — импульсы в минуту

 

Изучение острой токсичности и местно-раздражающего действия

В течение всего периода наблюдения после в/м или в/в введения мышам и крысам исследуемой кандидатной вакцины летальных исходов не наблюдали. При ежедневном клиническом осмотре не были выявлены симптомы интоксикации животных, значительные различия между группами, связанные с введением кандидатной вакцины, в поведении, питании и потреблении воды, динамике прироста массы тела, ректальной температуре. Патоморфологическое исследование крыс и мышей, проведенное в конце эксперимента, также не показало значимых различий между группами. При наружном осмотре у животных не было обнаружено отклонений от нормы. При вскрытии — положение внутренних органов анатомически правильное, а сами органы без патологических изменений. Массовые коэффициенты внутренних органов мышей и крыс также значимо не различались между группами животных, получавших кандидатную вакцину или ИР. При анализе кожи и мышц в местах введения отсутствовали выраженное местно-раздражающее действие, отек или гиперемия. В отдельном эксперименте оценивали возможное местно-раздражающее действие на кроликах. При наблюдении в течение 24 ч не было выявлено патологических изменений (отека или гиперемии глаз) у животных.

При клиническом осмотре значимых различий между контрольными и опытными группами крыс не было, гибели животных не наблюдали. Отсутствовали различия в динамике прироста массы тела, потреблении корма и воды между всеми группами. При анализе спонтанной двигательной активности животных и их поведения в арене открытого поля, электрокардиограммы и артериального давления, частоты дыхательных движений и офтальмологических тестов, а также силовых показателей и болевой чувствительности не обнаружено различий между животными опытных и контрольных групп по результатам физиологических исследований до начала эксперимента и на 30-й день исследования.

При оценке состава периферической крови было показано, что после 30-дневного периода введения кандидатной вакцины увеличилось общее количество лейкоцитов крови и относительное количество палочкоядерных нейтрофилов в группах животных, получавших вакцину в разных дозах, изменения были аналогичными как у самцов, так и у самок. Результаты исследования представлены в табл. 1.

 

Таблица 1 / Table 1

Влияние ежедневного внутримышечного введения вакцины на показатели периферической крови самцов белых крыс на 30-е сутки

Effect of daily intravenous administration of the vaccine on the peripheral blood parameters of male white rats on day 30

Показатель	М ± m
	Экспериментальные группы (доза вакцины, мл)
	контроль n = 10	0,5 n = 10	1,0 n = 10	1,5 n = 10
Количество лейкоцитов, 109/л	7,36 ± 0,53	8,92 ± 0,41*	8,88 ± 0,34*	9,01 ± 0,46*
Количество эритроцитов, 1012/л	8,20 ± 0,38	8,33 ± 0,21	7,98 ± 0,26	7,86 ± 0,37
Концентрация гемоглобина, г/л	165,3 ± 3,80	158,30 ± 4,00	160,20 ± 3,30	165,20 ± 3,70
Гематокрит, %	47,80 ± 0,60	47,20 ± 0,40	47,50 ± 0,40	47,00 ± 0,70
Средний объем эритроцита, fl	54,30 ± 0,60	54,40 ± 0,30	55,90 ± 0,60	54,20 ± 0,40
Среднее содержание гемоглобина в эритроците, пг	18,50 ± 0,30	17,20 ± 0,50	18,40 ± 0,30	18,70 ± 0,50
Количество тромбоцитов, 109/л	692,70 ± 16,00	713,40 ± 24,50	701,60 ± 24,50	691,70 ± 17,20
Палочкоядерные нейтрофилы, %	1,70 ± 0,20	2,80 ± 0,40*	2,90 ± 0,30*	3,10 ± 0,30*
Сегментоядерные нейтрофилы, %	18,00 ± 0,80	18,10 ± 1,20	18,80 ± 0,70	20,70 ± 0,70*
Базофилы, %	0,0 ± 0,0	0,0 ± 0,0	0,0 ± 0,0	0,0 ± 0,0
Эозинофилы, %	1,30 ± 0,30	1,20 ± 0,10	1,30 ± 0,30	1,10 ± 0,30
Моноциты, %	2,40 ± 0,30	2,30 ± 0,40	2,10 ± 0,30	2,20 ± 0,30
Лимфоциты, %	76,00 ± 0,70	75,30 ± 1,00	74,50 ± 0,90	72,60 ± 0,70*
Плазматические клетки, %	0,60 ± 0,30	0,30 ± 0,20	0,40 ± 0,20	0,30 ± 0,20

* различия с контролем достоверны при р < 0,05.

 

Не обнаружено различий между контрольной и опытной группами по результатам исследований биохимических показателей крови, миелограммы, анализу мочи и оценке функциональной активности почек. Патоморфологическое исследование на 30-е сутки не показало отклонений от нормы и различий между опытными и контрольной группами крыс. Кожа в месте инъекций была без визуальных изменений. При изучении мышц в месте инъекций отмечено, что у животных контрольной группы обнаруживались гематомы, у животных опытных групп помимо гематом в ряде случаев наблюдались небольшие нагноения. Не было достоверных различий в массовых коэффициентах органов между экспериментальными группами. По данным патогистологического исследования образцов тканей крыс, получавших кандидатную вакцину в максимальной дозе, а также животных контрольной группы значимые патологические изменения отсутствовали.

Результаты оценки пирогенности

На первом этапе сумма индивидуальных максимальных повышений температур (∆t) у кроликов составила 2,4 °С, поэтому был проведен второй этап испытаний. Сумма индивидуальных максимальных повышений температур (∆t) на втором этапе составила 2,5 °С, то есть суммарное повышение индивидуальных температур по результатам двух этапов равнялось 4,9 °С. Эти показатели превышают порог апирогенности (4,8 °С), что позволяет заключить, что исследуемая кандидатная вакцина обладает пирогенным эффектом.

Результаты изучения аллергизирующего действия

При оценке реакции гиперчувствительности немедленного типа (анафилактическая реакция) у морских свинок в опытных группах, сенсибилизированных вакциной в одной или трех прививочных дозах (0,5 или 1,5 мл соответственно), при введении разрешающей дозы препарата через 21 день (1,5 или 4,5 мл соответственно) развивался выраженный анафилактический шок с гибелью животных в 100 % случаев. Анафилактический индекс, рассчитанный для обеих опытных групп, составил 4,0 (индексы по Weigle). У животных контрольной группы анафилаксия не наблюдалась, анафилактический индекс равнялся нулю.

При оценке реакции активной кожной анафилаксии результаты измерения диаметров цветных пятен, образовавшихся на месте введения разрешающей дозы кандидатной вакцины, показали, что в контрольной группе мышей средние размеры пятен составили 1,40 ± 0,24 мм у самцов и 1,80 ± 0,20 мм у самок (М ± m). В опытных группах, в которых вакцину вводили в одной (0,5 мл) и двух прививочных дозах (1,0 мл), после введения разрешающей дозы анафилактическая реакция возникала у всех животных. Средние размеры пятен составили при дозе 0,5 мл: 6,20 ± 0,20 мм у самцов и 6,40 ± 0,24 мм у самок; при дозе 1,0 мл: 7,60 ± 0,24 мм у самцов и 7,60 ± 0,24 мм у самок (М ± m). Различия по диаметру пятна у животных опытных групп по сравнению с животными контрольной были достоверны при р < 0,05. Достоверные различия между опытными группами, а также половые различия не обнаружены.

После сенсибилизации 0,5 мл вакцины, по данным оценки реакции ГЗТ, индексы изменения массы лапы у мышей составили в контрольной группе у самцов 5,1 ± 0,9 %, у самок — 5,1 ± 0,8 %; в опытной группе у самцов — 5,2 ± 0,9 %, у самок — 5,2 ± 0,9 % (М ± m). Значимые различия по индексу массы лапы между группами не наблюдались, что говорит об отсутствии реакции ГЗТ в ответ на препарат.

Результаты оценки иммунотоксичности

Результаты определения числа АОК, образующихся в селезенке мышей в ответ на ЭБ после однократного введения кандидатной вакцины в дозах 0,5 и 1,0 мл, представлены в табл. 2. Как следует из данных, применение вакцины привело к статистически значимому увеличению количества АОК.

 

Таблица 2 / Table 2

Влияние вакцины на число антителообразующих клеток в селезенке мышей

Effect of the vaccine on the number of antibody-forming cells in the spleen of mice

Группа	Количество антителообразующих клеток (на 106 спленоцитов), М ± m
	самцы	самки
Контроль	11,7 ± 1,1	11,8 ± 1,4
Первая (вакцина 0,5 мл)	24,7 ± 1,5*	23,8 ± 1,6*
Вторая(вакцина 1,0 мл)	25,7 ± 1,8*	24,2 ± 1,3*

* различия с контрольной группой достоверны при р < 0,05, количество мышей в группе — 12 (по 6 самцов и 6 самок).

 

Развитие реакции ГЗТ у мышей с использованием ЭБ в качестве антигена оценивали после однократного введения вакцины в дозах 0,5 мл (первая группа) и 1,0 мл (вторая группа). Результаты представлены в табл. 3. В первом эксперименте сенсибилизацию мышей ЭБ проводили в один день с введением вакцины: отмечали уменьшение интенсивности развития реакции ГЗТ к ЭБ в обеих опытных группах по сравнению с контролем. Для оценки обратимости данного эффекта был поставлен дополнительный эксперимент, в котором сенсибилизацию мышей ЭБ осуществляли спустя 10 дней после однократного введения изучаемой вакцины.

 

Таблица 3 / Table 3

Влияние вакцины на развитие гиперчувствительности замедленного типа

Effect of the vaccine on the development of delayed-type hypersensitivity

Группа	М ± m
	Индекс реакции, %
	самцы	самки
	Иммунизация эритроцитами барана в день вакцинации
Контроль	54,7 ± 1,9	55,7 ± 2,2
Первая (вакцина 0,5 мл)	37,7 ± 2,1*	38,5 ± 1,7*
Вторая (вакцина 1,0 мл)	34,5 ± 1,6*	34,0 ± 1,8*
	Иммунизация эритроцитами барана спустя 10 дней после вакцинации
Контроль	48,5 ± 2,2	50,0 ± 2,2
Первая (вакцина 0,5 мл)	50,3 ± 1,9	52,5 ± 2,5
Вторая (вакцина 1,0 мл)	49,8 ± 2,3	51,5 ± 2,2

* различия с контрольной группой достоверны при р < 0,05, количество мышей в группе — 12 (по 6 самцов и 6 самок).

 

Иммунизация животных ЭБ привела к развитию выраженной реакции ГЗТ во всех экспериментальных группах, что говорит об обратимости наблюдавшихся изменений.

Фагоцитарную функцию Мф оценивали после однократного введения вакцины в дозах 0,5 мл (первая группа) и 1,0 мл (вторая группа). У самцов в контрольной группе фагоцитарный индекс (ФИ) составил 55,8 ± 2,5 %, фагоцитарное число (ФЧ) равнялось 2,5 ± 0,2 у. е.; в первой группе ФИ — 57,0 ± 2,1 % и ФЧ — 3,3 ± 0,4 у. е.; во второй группе ФИ — 57,8 ± 2,4 % и ФЧ — 3,2 ± 0,5 у. е. соответственно (М ± m); у самок результаты были сходными. Таким образом, введение вакцины не влияло на фагоцитарную функцию Мф.

Обсуждение

Вакцины на основе рекомбинантных белков являются новыми, безопасными и перспективными препаратами для профилактики ряда инфекционных заболеваний, вот почему разработка таких вакцин активно ведется в настоящее время [16]. Данные вакцины обладают рядом важных преимуществ, таких как фармакологическая чистота, а также более низкая себестоимость. Иммуногенность кандидатной вакцины была исследована на модели мышиной ротавирусной инфекции (заражение мышей Balb/c ротавирусом штамма EDC), которую применяют для изучения эффективности и иммуногенности подобных препаратов. Так, Lapalainen и соавт. использовали модель мышиной ротавирусной инфекции (заражение штаммом EDIM) для изучения формирования защитного иммунного ответа на кандидатную вакцину на основе белка VP6 [19]. При оценке иммуногенности рекомбинантных гибридных белков VP6VP8 ранее было показано, что данные белки обладают высокой антигенной активностью. При этом применение компонентов флагеллина в составе гибридного белка позволяет повысить ответ на вакцинацию [6]. При последующем исследовании кандидатной вакцины на основе белка FliCVP6VP8 был продемонстрирован высокий уровень защиты от мышиного ротавируса EDC, которая ассоциировалась с продукцией вирусспецифичных иммуноглобулинов — IgA и IgG в кишечнике и сыворотке крови [2]. В нашей работе в рамках изучения иммуногенных свойств двукратная иммунизация кандидатной вакциной оказалась более эффективной, чем однократная, в отношении повышения титра антител и усиления пролиферации спленоцитов у мышей Balb/c. Результаты согласуются с полученными ранее данными о том, что при двукратной иммунизации наблюдается высокий уровень защиты от ротавирусной инфекции [2]. Ранее мы установили, что протективная активность кандидатной вакцины сопоставима с активностью препарата сравнения — коммерческой вакцины Rotarix (Glaxo Smith Kline) — при большей безопасности кандидатной вакцины [2]. Следует отметить, что все коммерческие вакцины против ротавирусной инфекции содержат живой вирус, что осложняет их использование в качестве препарата сравнения, так как для этого необходимы особые условия.

Таким образом, дозы кандидатной вакцины в тысячи раз большие, чем разовая терапевтическая доза для человека, нетоксичны для грызунов, поскольку не вызывают ни летальности, ни симптомов интоксикации животных. На основании оценки местно-раздражающего действия в сочетании с данными патоморфологического исследования можно заключить, что изучаемая кандидатная вакцина не оказывает раздражающего действия при однократном местном применении. При длительном использовании в течение 30 дней в высоких дозах, превышающих в тысячи раз дозу для человека, кандидатная вакцина не вызывает токсичности, что говорит о ее высокой безопасности. Выявленная пирогенность может быть проявлением биологического действия, поскольку в состав вакцины входит флагеллин, который, как известно, обладает свойством индуцировать провоспалительные цитокины [18]. Проявление лейкоцитоза в периферической крови, сопровождавшегося увеличением количества палочкоядерных нейтрофилов, может свидетельствовать об иммуностимулирующем действии препарата. Известно, что флагеллин способен активировать функции нейтрофилов посредством связывания с TLR5 (Toll-like receptor 5 — Толл-подобный рецептор) на поверхности этих клеток [12]. При длительном ежедневном введении высоких доз кандидатной вакцины наблюдали проявления местно-раздражающего действия, что может быть следствием использования в составе адъюванта. Воспалительные реакции в месте введения также могут служить признаком стимуляции иммунной системы. Наблюдаемый побочный эффект не является противопоказанием для клинических испытаний препарата из-за его умеренного проявления, а также из-за того, что при клиническом применении вакцину планируется вводить лишь двукратно.

В связи с тем что нами была выявлена анафилактогенная активность кандидатной вакцины, необходимо уточнить, что активное образование антител и аллергические реакции у лабораторных животных следует рассматривать как предостережение, но не как противопоказание для проведения клинических исследований. Так, для лекарственных препаратов на основе человеческих белков тесты анафилаксии на морских свинках достаточно часто бывают положительными, но эти результаты не являются прогностическими для пациентов [7]. Реакций ГЗТ в ответ на иммунизацию кандидатной вакциной не отмечено. Показано выраженное неспецифическое иммуностимулирующее действие кандидатной вакцины в отношении гуморального иммунного ответа, поскольку в ответ на введение ЭБ увеличивалось количество АОК в селезенке. Выявленное ингибирующее воздействие на развитие реакции ГЗТ к ЭБ (иммунотоксический эффект) носило обратимый характер, и нарушенные функции полностью восстанавливались спустя 10 дней после однократного введения, что может свидетельствовать об иммуномодулирующей активности кандидатной вакцины.

Таким образом, проведенные в рамках доклинических испытаний исследования продемонстрировали иммуногенность и безопасность кандидатной вакцины против ротавирусной инфекции. Данная кандидатная вакцина может быть рекомендована для дальнейших испытаний.

Дополнительная информация

Финансирование. Исследование выполнено в рамках государственного контракта № 14.N08.12.1028 от 01.06.2015 с Минобрнауки РФ по теме «Доклинические исследования кандидатной вакцины против ротавирусной инфекции на основе рекомбинантного гибридного белка».

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

Elena A. Varyushina

State Research Institute of Highly Pure Biopreparations

Author for correspondence.
Email: elenavaryush@gmail.com

Dr. Sci. (Biology), Leading Biotechnologist, Protein Biochemistry Laboratory

Russian Federation, Saint Petersburg

Georgy V. Alexandrov

State Research Institute of Highly Pure Biopreparations

Email: g.v.aleksandrov@hpb.spb.ru

PhD, Deputy Head, Department of Preclinical Research

Russian Federation, Saint Petersburg

Mikhail S. Zakharov

State Research Institute of Highly Pure Biopreparations

Email: m.s.zakharov@hpb.spb.ru

сonsultant, Department of Preclinical Research

Russian Federation, Saint Petersburg

Anna S. Kiryanova

State Research Institute of Highly Pure Biopreparations

Email: a.s.kirianova@hpb.spb.ru

Quality Specialist, Quality Assurance Department

Russian Federation, Saint Petersburg

Olga E. Huttunen

State Research Institute of Highly Pure Biopreparations

Email: o.e.khuttunen@hpb.spb.ru

biologist, Department of Preclinical Research

Russian Federation, Saint Petersburg

Alina B. Rumyantseva

State Research Institute of Highly Pure Biopreparations

Email: a.b.rumyantseva@hpb.spb.ru

Senior Biologist, Department of Preclinical Research

Russian Federation, Saint Petersburg

Ilya D. Mitrofanov

State Research Institute of Highly Pure Biopreparations

Email: i.d.mitrofanov@hpb.spb.ru

biologist, Department of Preclinical Research

Russian Federation, Saint Petersburg

Irina V. Bendt

State Research Institute of Highly Pure Biopreparations

Email: i.v.bendt@hpb.spb.ru

Senior Biotechnologist, Department of Preclinical Research

Russian Federation, Saint Petersburg

Anna E. Krylova

State Research Institute of Highly Pure Biopreparations

Email: a.e.polyanskaya@hpb.spb.ru

biologist, Department of Preclinical Research

Russian Federation, Saint Petersburg

Anastasia B. Chistyakova

State Research Institute of Highly Pure Biopreparations

Email: a.b.chistyakova@hpb.spb.ru

biologist, Department of Preclinical Research

Russian Federation, Saint Petersburg

Natalya A. Artemova

State Research Institute of Highly Pure Biopreparations

Email: n.a.artemova@hpb.spb.ru

Senior Biologist, Department of Preclinical Research

Russian Federation, Saint Petersburg

Irina M. Shatillo

North-West State Medical University named after I.I. Mechnikov

Email: elenavaryush@gmail.com

MD, PhD, Associate Professor of the Department of Pediatrics with a course in Neonatology

Russian Federation, Saint Petersburg

Elena G. Bogomolova

State Research Institute of Highly Pure Biopreparations

Email: bogomolovaele@inbox.ru

Deputy Head of the Laboratory for Vaccine Genetic Engineering

Russian Federation, Saint Petersburg

Olga A. Dobrovolskaya

State Research Institute of Highly Pure Biopreparations

Email: bogomolovaele@inbox.ru

Junior Researcher, Laboratory for Genetic Engineering of Vaccines

Russian Federation, Saint Petersburg

Sergey A. Ischuk

State Research Institute of Highly Pure Biopreparations

Email: bogomolovaele@inbox.ru

Junior Researcher, Laboratory for Genetic Engineering of Vaccines

Russian Federation, Saint Petersburg

Ilya V. Dukhovlinov

State Research Institute of Highly Pure Biopreparations

Email: bogomolovaele@inbox.ru

PhD, Head of the Laboratory for Genetic Engineering of Vaccines

Russian Federation, Saint Petersburg

Andrey S. Simbirtsev

State Research Institute of Highly Pure Biopreparations

Email: a.s.simbirtsev@hpb.spb.ru

Dr. Sci. (Med.), Professor, Corresponding Member of the Russian Academy of Sciences, Chief Researcher of the Protein Biochemistry Laboratory

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files