INVESTIGAION OF PRODUCTION OF A NON-TOXIC DIPHTHERIA TOXIN VARIANT CRM197 IN ESCHERICHIA COLI CELLS

Abstract


The aim of research: to synthesize the gene, coding the non-toxic variant of diphtheria toxin CRM197, to explore its expression in Escherichia coli cells, to construct bacterial strain - producer of recombinant CRM197 and to develop the method for purification of this CRM197 protein from the biomass of bacteria. Materials and methods of research. the gene of CRM197 was synthesized by chemical and enzymatic methods. Expression vector pColdII-CRM197 construction and assembly were performed by standard genetic engineering methods. CRM197 production by Escherichia coli cells was explored by electrophoresis in polyacrylamide gel and immunoblotting. The recombinant CRM197 was purified with the use of metal-chelate chromatography. Results. The application of the pColdII expression vector made possible to produce recombinant protein after decrease of the cell cultivation temperature from 37° C to 16° C. The method for purification of CRM197 recombinant protein was developed and the protein preparation with the purity 97% was obtained, having molecular mass 60 kDa; this protein was coupled with polyclonal antibodies against diphtheria toxin in the immunoblot. Conclusion. Successful production of CRM197 recombinant protein was reached with the use of pColdII vector at the decreased cell cultivation temperature. The purified CRM197 demonstrated nuclease activity pointing its proper folding. Production of the purified recombinant CRM197 protein allows its use for development of new conjugate vaccines.

Введение. Дифтерия - инфекционное заболевание, вызываемое бактерией Corynebacterium diphtheriae (дифтерийная палочка, или бацилла Лёффлера). При дифтерии степень тяжести заболевания и развитие осложнений обусловлены секретируемым токсином. Токсин дифтерийной палочки первоначально синтезируетс в виде полипептидной цепи с молекул рной массой 62 кДа. В результате о граниченного протеолиза белок протоксина превращается в зрелую форму, состоящую из двух фрагментов, связанных между собой дисульфидной связью: фрагмента А с молекулярной массой 22-24 кДа и фрагмента В с молекулярной массой 38-39 кДа. Фрагмент В отвечает за связывание токсина с клеткой. В клетке фрагмент А токсина, обладающий НАД-гл икогидролазной активностью (гидролизует НАД до АДФ-рибозы и никотинамида) и АДФ-рибозилтрансферазной активностью, посредством переноса АДФ-рибозы на фактор элонгации EF-2 вызывает инакти вацию фактора элонгации EF-2, что приводит к остановке синтеза белка в клетке [1]. Известен мутантный вариант дифтерийного токсина, названный CRM197 и отличающийс от белка дикого типа одной аминокислотной заменой G52E (глутаминовая кислота вместо глицина). Данная мутация приводит к потере аффинности к НАД, вследствие чего CRM197 не способен осуществлять АДФ-рибозилирование фактора EF-2 [2]. CRM197 нетоксичен, но при этом полностью сохран ет свои иммуногенные свойства. Данный белок успешно применяется в качестве носителя в ряде конъюгированных вакцин, в которых капсульные полисахариды патогенов ковалентно св заны с CRM197. Известно, что при иммунизации очищенными бактериальными капсульными полисахаридами происходит их взаимодействие с В-клеточными рецепторами, что, в свою очередь, приводит к диф-ференцировке В-клеток в зрелые плазматические клетки, продуцирующие соответствующие антитела. Однако данный процесс не приводит к экспансии В-клеточных клонов и к формированию долгосрочной клеточной памяти. При иммунизации конъюгированной вакциной, в которой капсульные полисахариды патогена связаны с CRM197, также происходит св зывание полисахаридов с наивными В-клетками, однако одновременно происходит процессинг белка-носител с продукцией и презентацией (через МНС I и II классов) пептидов специфическим Т-хелперным клеткам, которые уже праймированы пептидами через взаимодействие с антигенпрезентирующими клетками, которые уже процессировали данный белок. Участие Т-хелперов в иммунном ответе приводит к более высокой специфичности и аффинности антител, а также к развитию иммунологической памя ти [3, 4]. В качестве носителя различных капсульных углеводных антигенов CRM197 используетс в нескольких широко примен емых в течение последних 30 лет и в р де разрабатываемых в настоя щее время новых конъюгатных вакцин [5-7]. CRM197 обладает также способностью подавлять активность гепарин-св зывающего эпидермального фактора роста (heparin-binding epidermal growth factor (EGF)-like growth factor), участвующего в пролиферации и метастазировании раковых клеток [8, 9]. Интерес представл ет и способность CRM197 проникать в моноциты, что делает возможным его использование для адресованной доставки молекул в данные клетки [10]. Широкое промышленное применение и перспективы дальнейшего использования CRM197 требуют разработки простых и дешевых методов его производства. Между тем CRM197 получают очисткой из культур Corynebacterium diphtheria, лизогенных по бактериофагу ^197tox-, геном которого содержит ген CRM197, при этом процесс ферментации длителен (36-48 ч) и капризен вследствие возникающего на поздней стадии ферментации протеолиза [11]. Альтернативные методы включают экспрессию генов CRM197 в клетках Escherichia coli, Bacillus subtilis и Pseudomonas fluorescens, которые, однако, обладают незначительным уровнем продукции по сравнению с уровнем, характерным дл других рекомбинантных белков, получаемых в насто щее врем в клетках Escherichia coli с применением современных экспрессионных векторов [12, 13]. Цель исследования: разработка надежного и высокопродуктивного метода получения рекомбинантного CRM197 в клетках Escherichia coli. Для достижения данной цели нами были последовательно получены ген, кодирующий CRM197, плазмидный вектор, содержащий данный ген, штамм Escherichia coli - продуцент CRM197, поставлены опыты по культивированию данного штамма-продуцента и очистке рекомбинантного CRM197. Материалы и методы исследования. Получение гена CRM197. Химико-ферментативный синтез гена CRM197 осуществляли путем удлинения взаимоперекрывающихся олигонуклеотидов (праймеров), полученных методом химического синтеза [14]. С 5’- и З’-концов полученный ген фланкировали сайтами рестрикции NdeI и XhoI, соответственно, для последующей вставки в экспрессионный вектор pColdII (Takara Ink., США). Правильность синтеза и сборки полученной экспрессионной плазмиды pColdII-CRM197 провер -ли сиквенированием. Изучение продукции CRM197 в клетках Escherichia coli. Для экспрессии гена CRM197 в клетках бактерий был использован штамм Escherichia coli BL21 Star (DE3) (Invitrogen, USA), F-ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm rne131 (DE3), содержащий в геноме ADe3 лизоген и мзтацию rne131. Мзтированный ген rne (rne131) кодирзет делетированнзю форм3 РНКазы Е, что зменьшает внзтриклеточное разрзшение мРНК, приводя к звеличению ее стабильности. Мзта-ции lon- и отрТ- по генам протеаз позволяют ползчать рекомбинантные белки в больших количествах. Плазмидные ДНК вводили в клетки Escherichia coli методом электропорации. Клетки E. coli BL21 (pColdII-CRM197) кзльтивировали в течение ночи при 37° С на крзговой качалке при 180 об/мин в среде LB, содержавшей 100 мкг/мл ампициллина. К3льт3р3 клеток разводили свежей средой (1:100), и далее кзльтивировали при температзре +16° С. После достижения кзльтзрой А600=0,6 добавляли индзктор - изопропил-Р^-тиогалактозид (IPTG) и продолжали кзльтивирование в течение зказанно-го времени. Для индзкции лактозой по Studier кзльтзрз разводили в 100 раз в среде PYP с 0,2% лактозы и 100 мкг/мл ампициллина и выращивали при +16° С в течение ночи [15]. Аликвоты подвергали центрифзгированию при 4000 g в течение 10 минзт, после чего клеточные осадки лизировали добавлением пятикратного лизирзю-щего раствора (10% SDS, 10 мМ дитиотрей-тол, % глицерин, триси 0,05% бромфенолового синего) и кипятили в течение 10 мин. Электрофорез по методз Ла-эммли [16] проводили в 10% ПААГе в стандартных зсловиях, с последзющей окраской К3-масси G-250 и денситометрированием гелей. Наработка и очистка рекомбинантного CRM197. Для наработки рекомбинантного CRM197 кзльтзрз клеток CRM197) объемом 1 л кзльтивировали при 16° С с добавлением 1 мМ IPTG в течение 5 ч. Клетки осаждали центрифзгированием при 6000 g 15 мин и осадок клеток ресзспендировали в 1/3 объема кзльтзры в растворе PBS, pH=7,2. Клетки обрабатывали зльтразвзком - 10 импзльсов по 20 секзнд каждый с перерывами междз импзль-сами также по 20 секзнд при мощности 15 Вт (Sonicator Q500, QSonica, США) и постоянном охлаждении в ледяной бане, и центрифзгирова-ли при 10 000 g в течение 30 мин. Осадок ре-сзспендировали в бзфере для растворения белка (5 0 мМ натрий-фосфатный бзфер, pH=8,0, 0,5 М NaCl, 8 М мочевина) и лизировали при комнатной температзре с постоянным перемешиванием в течение 3 ч, после чего центрифзгировали при 10 000 g в течение 30 мин. Сзпернатант наносили на металлохелатнзю колонкз объемом 5 мл (Hi-Trap Chelating, GE Healthcare, США), зравнове-шеннзю раствором, содержавшим 50 мМ натрийфосфатный бзфер, pH=8,0, 0,5 М NaCl, 8 М мочевинз и 10 мМ имидазола. Несвязавшиеся белки смывали промывкой колонки 10 объемами зравновешивающего раствора и 5 объемами раствора, содержавшего 50 мМ натрий-фосфатный бзфер, pH=8,0, 0,5 М NaCl, 8 М мочевинз и 30 мМ имидазола, после чего проводили элюцию 1 объемом элюирзющего раствора, в котором концентрация имидазола была повышена до 200 мМ. Очищенный белок диализовали против раствора, содержавшего 50 мМ натрий-фосфатный бзфер, pH=8,0, 2% сахарозы 0,1% твина- 20 и анализировали методом электрофореза в ПААГе по Лаэммли. Концентрацию белка определяли по Лозри [17]. Анализ рекомбинантного CRM197 методами электрофореза и вестерн-блота. Клетки из 1 мл культуры E. coli BL21 (pColdII-CRM197) осаждали центрифзгированием и ре-сзшендировали в 1Х бзфере для образца для электрофореза в восстанавливающих зсловиях с SDS (Био-Рад, США), после чего кипятили 10 мин и наносили на 10% полиакриламидный гель. По окончании электрофореза гель окрашивали красителем Кзмасси R-250 либо переносили белки на нитроцеллюлознзю мембранз для анализа методом вестерн-блота по прописи производителя (Био-Рад, США). Мембранз блокировали 1% раствором обезжиренного молока в забзференном изотоническом растворе натрия хлорида (PBS), рН=7,2 (раствор SMP) 15 мин при комнатной температзре, после чего инкзби-ровали с антителами кролика против дифтерийного токсина (ab151222, Abcam, США) в разведении 1:2,000 в 1% растворе SMP в течение ночи при 37° С, трижды промывали в растворе PBS, содержавшем 0,5% твина-20 (PBST), и далее инкзбировали с антителами к IgG кролика (ab205718, Abcam), конъюгированными с перок-сидазой хрена, разведенными (1:5000) в растворе SMP, в течение часа при комнатной темпера-тзре. Мембранз промывали три раза раствором PBST, один раз - PBS, окрашивали раствором 4-хлор-1-нафтола (Сигма, США). Окрашивание останавливали промывкой мембраны дистиллированной водой. Исследование нуклеазной активности рекомбинантного CRM197. Нзклеазнзю активность определяли пзтем ин^бирования 1 мкг CRM197 с 0,5 мкг плазмиды pET28a (EMD Biosciences, США) при 25° С в растворе 10 мМ Tris-HCl pH=7,6, 2,5 мМ CaCl2, 2,5 мМ MgCl2. Реакцию останавливали добавлением раствора ЭДТА до конечной концентрации 5 мМ, после чего образцы наносили на 0,8% агарозный гель и подвергали электрофорезу с окраской 0,1% раствором бромистого этидия и фотографированием под УФО. Результаты и их обсуждение. Попытка получить экспрессию гена CRM197 в клетках Escherichia coli с использованием высокопродуктивных плаз-мидных векторов серии рЕТ оказалась неудачной - синтеза белка CRM197 при культивировании клеток в среде LB при 37° С) не происходит или происходит в незначительных количествах. Дл синтеза CRM197 в клетках E. coli нами был выбран вектор р^ПП, который содержит, помимо промотора гена cspA, последовательность нуклеотидов, кодирующую N-концевой пептид MNHKV, данная последовательность нуклеотидов, транскрибированна в мРНК, представл ет собой элемент ТЕЕ, стабилизирующий мРНК при пониженных температурах [18]. Вектор pCol-dII также содержит последовательность, кодирующую 6-гистидиновый таг, предназначенный дл очистки рекомбинантных белков, Lac-оператор и набор сайтов рестрикции для клонирования гена целевого белка [19]. В результате стыковки по сайтам NdeI и XhoI гена CRM197 и pColdII была получена плазмида pColdII-CRM197, содержащая искусственный ген, кодирующий в непрерывной рамке считывани , начиная с 5’-конца: - пептид MNHKV (участок мРНК, являю-щийс ТЕЕ -элементом); - 6-гистидиновый таг; - кодон ATG (34-36), кодирующий метионин, помещенный дл создани сайта рестрикции NdeI; - последовательность н уклеотидов длиной 542 аминокислотных остатков, кодирующую полноразмерный CRM197. Анализ экспрессии гена CRM197 в клетках Е. coli BL21 методом электрофореза белков в ПААГе в восстанавливающих услови х показал, что при температуре 16° С и добавлении индуктора IPTG происходит продукция рекомбинантного белка с ожидаемым молекулярной массой около 60 кДа. Максимальна продукци белка наблюдалась при концентрации IPTG 1 мМ через 5 ч после начала индукции, при этом содержание целевого белка составило 35% общего белка клеток. При индукции 0,2% лактозой содержание рекомбинантного CRM197 составило 12% белка клеточных лизатов (рис. 1). И н 1 1 1 I I ■ Г 9 « Рис. 1. Динамика синтеза рекомбинантного CRM197 клетками Escherichia coli при температуре 16° С (Электрофорез лизатов клеток Е. coli BL21(pColdII-CRM197) в 10% ПААГ в восстанавливающих условиях с SDS с последующей окраской Кумасси R-250): 1 - маркеры молекулярной массы (Page Ruler Prestained Protein Ladder); 2 - без индукции, 5 часов; 3 - индукция 0,2% лактозой по Studier, 18 часов; 4 - индукция 1 мМ IPTG, 40 мин; 5 - ин-дукци 1 мМ IPTG, 1 час; 5 - индукци 1 мМ IPTG, 2 часа; 6 - индукци 1 мМ IPTG, 3 часа; 7 - индукци 1 мМ IPTG, 4 часа; 8 - индукци 1 мМ IPTG, 5 часов. Очистка грубой фракции белка, полученной из клеточного лизата Escherichia coli, методом металлохелатной хроматографии, позволила получить белок 96% чистоты по данным денситометрии окрашенного ПААГ (рис. 2). 1 2 3 4 5 Рис. 2. Очистка рекомбинантного CRM197. Анализ белков методом электрофореза в 10% ПААГе в денатурирующих условиях: 1 - маркеры молекулярной массы (Page Ruler Prestained Protein Ladder); 2 - лизат клеток E.coli BL21(pColdII-CRM197), без индукции; 3 - лизат клеток E. coli BL21(pColdII-CRM197), индукция 1 мМ IPTG, 5 часов; 4 - отмытые тельца-включения, содержащие белок CRM197; 5 - CRM197 после металлохелатной хроматографии и диализа. 1 2 3 4 5 6 7 8 Рис. 4. Нуклеазная активность рекомбинантного CRM197. Электрофорез ДНК плазмиды рЕТ28а после инкубации с рекомбинантным CRM197: 1 - плазмида, инкубированная без CRM197, 18 часов инкубации; 2 - 1 час инкубации рЕТ28а + CRM197; 3 - 2 часа инкубации рЕТ28а + CRM197; 4 - 3 часа инкубации рЕТ28а + CRM197; 5 - 5 часов инкубации рЕТ28а + CRM197; 6 - 6 часов инкубации рЕТ28а + CRM197; 7 - 18 часов инкубации рЕ-Т28а + CRM197; 8 - маркер молекулярной массы ДНК (GeneRuler 1 kb DNA ladder (Thermo Scientific, США)). Для подтверждения идентичности полученного белка дифтерийному токсину использовали вестерн-блот с поликлональными антителами кролика к дифтерийному токсину. Как показано на рис. 3, антитела к дифтерийному токсину св зываютс с рекомбинантным CRM197, очищенным из клеточного лизата методом металлохелатной хроматографии. 1 2 3 Рис. 3. Анализ рекомбинантного белка, синтезируемого клетками E.coli BL21 (pColdII-CRM197) при температуре 16° С и индукции лактозой, методом вестерн-блота с антителами против дифтерийного токсина: 1 - маркеры молекулярной массы; 2 - 1 мкг очищенного белка CRM197; 3 - 5 мкг очищенного белка CRM197. Наличие правильного фолдирования белковой молекулы после очистки и диализа проверяли по наличию в препарате CRM197 нуклеазной активности, котора рассматриваетс как дополнительный фактор патогенности дифтерийного токсина [20, 21]. Как показано на рис. 4, при инкубации очищенного CRM197 с плазмидой pET28a в присутствии солей кальци и магни , необходимых дл активации ДНКаз, наблюдаетс постепенное уменьшение количества плазмидной ДНК с ее полным исчезновением к 18 - м у ч а су и нкуб а-ции. При этом уменьшение содержания в образце суперспирализованной формы плазмиды сопровождается временным (заметно на 1$6-м часах инкубации, см. рис. 4) появлением промежуточного продукта распада - открытой кольцевой формы, обладающей меньшей электрофоретической подвижностью, что указывает на наличие в препарате очищенного CRM197 как эндонуклеазной, так и экзонуклеазной активностей. За 18 ч инкубации происходит полна деградаци плазмидной ДНК (см. рис. 4, дорожка 7). Большинство рекомбинантных эукариотических и бактериальных белков эффективно синтезируются в клетках E. coli. Однако некоторые белки относятся к трудноэкспрессируемым, что может быть связано с нестабильностью мРНК, неоптимальным составом кодонов, протеолизом рекомбинантного белка и многими другими причинами [22-24]. Причиной отсутствия экспрессии гена CRM197 при 37° С может являться неоптимальная для трансляции в клетках Escherichia coli вторичная структура мРНК в 5 -участке, преп тствующа эффективной инициации трансл ции данного белка. Изменение последовательности данного участка введением ТЕЕ-элемента и культивирование клеток при пониженной температуре (16° C) позволили получить высокий выход рекомбинантного CRM197 в Escherichia coli, который нака-пливалс в тельцах включени . Вывод. Разработан метод получения очищенного и правильно фолдированного CRM197, обладающего ДНКазной активностью. Финансирование. Работа субсидирована Минобрнауки РФ по теме: «Разработка конъюгированных вакцин на основе синтетических углеводных лигандов против возбудителей госпитальных инфекций». Ун икальный идентификатор проекта RFMEFI57914X0022.

I V Dukhovlinov

FSUE «State Research Institute for Highly Pure Biopreparations» FMBA of the Russian Federation

E G Bogomolova

FSUE «State Research Institute for Highly Pure Biopreparations» FMBA of the Russian Federation

O V Dobrovolskaya

FSUE «State Research Institute for Highly Pure Biopreparations» FMBA of the Russian Federation

CA A Ishuk

FSUE «State Research Institute for Highly Pure Biopreparations» FMBA of the Russian Federation

EA A Fedorova

FSUE «State Research Institute for Highly Pure Biopreparations» FMBA of the Russian Federation

N A Klimov

FSUE «State Research Institute for Highly Pure Biopreparations» FMBA of the Russian Federation

A S Simbirtsev

FSUE «State Research Institute for Highly Pure Biopreparations» FMBA of the Russian Federation

corresponding member of the Russian Academy of Sciences

  1. Lory S., Carroll S.F., Collier R.J. Ligand interactions of diphtheria toxin. II. Relationships between the NAD site and the P site // J. Biol. Chem. 1980. Vol. 255, No 24. P. 12016-12019.
  2. Uchida T, Pappenheimer A.M., Greany R. Diphtheria toxin and related proteins. I. Isolation and properties of mutant proteins serologically related to diphtheria toxin // J. Biol. Chem. 1973. Vol. 248, No 11. P. 3838-3844.
  3. Durando P, Faust S.N., Fletche M, Krizova P, Torres A., Welte T. Experience with pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine (conjugated to CRM197 carrier protein) in children and adults // Clin. Microbiol. Infect. 2013. Vol. 19 (suppl. 1). P. 1$9.
  4. Avci F.Y, Li X., Tsuji M, Kasper D.L. A mechanism for glycoconjugate vaccine activation of the adaptive immune system and its implications for vaccine design // Nat. Med. 2011. Vol. 17, No 12. P. 1602-1609.
  5. Burtnick M.N., Shaffer T.L., Ross B.N., Muruato L.A., Sbrana E, DeShazer D, Torres A.G., Brett P.J. Development of Subunit Vaccines that Provide High Level Protection and Sterilizing Immunity Against Acute Inhalational Melioidosis // Infect. Immun. 2017. Nov. 6. pii: IAI.00724-17. doi: 10.1128/ IAI.00724-17.
  6. Ilyina N, Kharit S., Namazova-Baranova L., Asatryan A., Benashvili M., Tkhostova E., Bhusal C., Arora A.K. Safety and immunogenicity of meningococcal ACWYCRM197-conjugate vaccine in children, adolescents and adults in Russia // Hum. Vaccin. Immunother. 2014. Vol. 10, No 8. P. 2471-2481.
  7. Allison E.B., Turner J.E., Gerson H.Y, So, D.J., Krasznai A.J., Hilaire S, Gerson D.F. Novel polysaccharide-protein conjugates provide an immunogenic 13-valent pneumococcal conjugate vaccine for S. pneumoniae // Synth. Syst. Biotechnol. 2017. Vol. 2, No 1. P. 49$58.
  8. Dateoka S., Ohnishi Y., Kakudo K. Effects of CRM197, a specific inhibitor of HB-EGF, in oral cancer // Med. Mol. Morphol. 2012. Vol. 45, No 2. P. 91-97.
  9. Dateoka S., Kakudo K. CRM197, a specific inhibitor of HB-EGF // Med. Mol. Morphol. 2013. Vol. 415, No 1. P. 83-87.
  10. Schenk G.J., Haasnoot P.C., Centlivre M., Legrand N., Rip J., de Boer A.G., Berkhout B. Efficient CRM197-mediated drug targeting to monocytes // J. Control. Release 2012. Vol. 158, No 1. P. 139-147.
  11. Rappuoli R. Isolation and characterization of Corynebacterium diphtheria nontandem double lysogens hyperproducing CRM197 // Appl. Environ. Microbiol. 1983. Vol. 46, No 3. P. 560-564.
  12. Zhou J., Petracca R. Secretory expression of recombinant diphtheria toxin mutants in B. Subtilis // J. Tongji Med. Univ. Tong Ji Yi Ke Xue Xue Bao. 1999. Vol. 19, No 4. P. 253-256.
  13. Retallack D.M., Jin H., Chew L. Reliable protein production in a Pseudomonas fluorescens expression system // Protein Expr. Purif. 2012. Vol. 81, No 2. P. 157-165.
  14. Majumder K. Ligation-free gene synthesis by PCR: synthesis and mutagenesis at multiple loci of a chimeric gene encoding OmpA signal peptide and hirudin // Gene. 1992. Vol. 110, No 1. P. 89-94.
  15. Studier FW. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli // Methods Mol Biol. 2014. Vol. 1091, No 1. P. 17-32.
  16. Laemmly U.K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4 // Nature. 1970. No 227. P. 680-685.
  17. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193, No 1. P. 265 -275.
  18. Phadtare S., Severinov K. RNA remodeling and gene regulation by cold shock proteins // RNA Biol. 2010. Vol. 7, No 6. P. 788-795.
  19. Takara Cold Shock Expression System pCold™ DNA. Product Manual. http://www.takara-bio.com.
  20. Chang M.P., Baldwin R.L., Bruce C., Wisnieski B.J. Second cytotoxic pathway of diphtheria toxin suggested by nuclease activity // Science. 1989. Vol. 246, No 4934. P. 1165-1168.
  21. Bruce C., Baldwin R.L., Lessnick S.L., Wisnieski B.J. Diphtheria toxin and its ADP-ribosyltransfer-ase-defective homologue CRM197 possess deoxyribonuclease activity // Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 1990. Vol. 87, No 8. P. 2995-2998.
  22. Jia B., Co J. High-throughput recombinant protein expression in Escherichia coli: current status and future perspectives // Open Biol.2016. Vol. 6, No 8. pii: 160196. doi: 10.1098/rsob.160196.
  23. Srnrensen H.P, Mortensen K.K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli // J. Biotechnol. 2005. Vol. 115, No 2. Р. 113-128.
  24. Peleg Y, Unger T. Application of high-throughput methodologies to the expression of recombinant proteins in E. coli // Methods Mol. Biol. 2008. Vol. 426. P. 197-208.

Views

Abstract - 248

PDF (Russian) - 8

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2018 Dukhovlinov I.V., Bogomolova E.G., Dobrovolskaya O.V., Ishuk C.A., Fedorova E.A., Klimov N.A., Simbirtsev A.S.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies