ALDEHYDE DEHYDROGENASE 1L1 IN RAT BRAIN CELLS

Abstract


Aldehyde dehydrogenase belonging to family 1, member L1 (Aldh1L1) is one of the most important enzymes called astrocytes that determine such important functions of these cells as participation in folate metabolism and inactivation of formiate in the CNS. The aim of this study was immunocytochemical detection of cells synthetizing Aldh1L1 in rat brain, and determination of their topography and morphology features. The brain of adult male Wistar rats (n=10) was used at the work. The material was fixed in zinc-ethanol-formaldehyde, a special fixative providing high preservation of antigenic determinants. It was shown that A ldh1L1 is detected in all brain anatomic structures. Among brain cells expressing Aldh1L1 macroglia cells - astrocytes and ep-endymocytes - were identified. In astrocytes the most intensive immunohistochemical reaction was observed in the endfeets of processes of these cells and in superficial astrocytes forming the superficial glial border membrane. In ependymocytes, the product of immune reaction was detected in the cytoplasm as numerous granules of various shapes and size (from 0.1x0.2 to 1.3X3.7 pm). The predominant localization of Aldh1L1 in brain cells involved in transport of substances through blood-brain, CSF-brain, and CSF-blood barriers allows one to expect that this protein will prove to be useful functional marker during experimental investigations of the CNS barrier system and evaluating the reaction of brain to toxic metabolic products of alcohol surrogates.

Введение. Изучение структурно-функциональных особенностей астроглии как в норме, так и при развитии патологического процесса в нервной системе вл етс актуальной задачей современной нейробиологии. В настоящее время известен целый ряд белков, применяемых в практике научных и клинико-диагностических исследований в качестве маркеров астроцитов. Среди этих белков особое место занимают ферментные маркеры астроглии, поскольку они определяют ряд важнейших функциональных характеристик этих клеток. Среди таких маркеров астроцитов наиболее значимыми являются глутаминсинтетаза (GS), дейодиназа второго типа (DIO2) и альдегиддеги-дрогеназа семейства 1, член L1 (AldhlLl) [1]. Однако, как показано в р де недавних исследований, ни глутаминсинтетаза, ни дейодиназа не вл ютс маркерами сугубо специфичными для астроци-тарной глии, поскольку экспрессируются также и другими клетками головного мозга [2_4]. В то же врем большинство исследователей считают, что фермент Aldh1L1 высоко специфичен для астро-цитарной глии и в головном мозге экспрессируетс повсеместно подавляющим большинством клеток этой популяции [5, 6]. Альдегиддегидрогеназа семейства 1, член L1 (aldehyde dehydrogenase 1 family, member L1; Aldh1L1), также известный как 10-формилтетра-гидрофолатдегидрогеназа (10-formyltetrahydrofolate dehydrogenase; FDH, EC 1.5.1.6) - фермент, катализирующий преобразование 10-формилтетрагидрофолата в тетрагидрофолат. Как показано, этот фермент является ключевым в метаболизме фолата, который важен в биосинтезе нуклеотидов и процессах клеточного деления [7]. Утверж-даетс , что в ЦНС именно астроциты вл ютс хранилищем фолата и за счет него участвуют в инактивации формиата (муравьиной кислоты) - токсичного метаболита метанола, окисл его фолат-зависимым путем с помощью Aldh1L1. Таким образом, астроциты выполняют защитную функцию за счет Aldh1L1, предохраняя нейроны от токсичного воздействия формиата [8]. Считается, что Aldh1L1 локализуетс не в отдельном компар-тменте, а равномерно распределена по всей клетке, что позвол ет вы вл ть как клеточное тело астро-цита, так и его многочисленные отростки [9]. Однако в насто щее врем в мировой литературе все же нет единого мнения о том, действительно ли этот фермент синтезируетс только астроцитами. Цель исследования: иммуногистохимическое вы вление клеток головного мозга крысы, синтезирующих Aldh1L1, определение их топографии и морфологических характеристик. Материалы и методы исследования. В работе использован головной мозг половозрелых крыс-самцов породы Вистар (n=10). Умерщвление животных проводили с соблюдением международных правил Хельсинкской декларации о гуманном обращении с животными. Головной мозг крыс фиксировали в цинк-этанол формальдегиде, который обеспечивает высокую сохранность антигенов, необходимую для получения оптимальных результатов при постановке иммуноцитохимических реакций [10, 11]. Фиксированный материал обезвоживали и заливали в парафин по общепри-н той методике. Из полученных блоков готовили фронтальные срезы толщиной 5 мкм на ротационном микротоме Leica RM2125RT (Leica, Гер-мани ). Дл иммуноцитохимического вы влени альдегиддегидрогеназы 1L1 были использованы мышиные моноклональные антитела (клон YY8, разведение 1:100, Santa Cruz, США). Для световой микроскопии в качестве вторичных реагентов использовали набор EnVision+ System Labelled Polymer-HRP A nti-Mouse (Dako, Дания). Перед постановкой реакции проводили тепловое демаскирование антигена в модифицированном ци-тратном буфере (S1700, Dako, Дани ) в течение 25 мин. После постановки иммуногистохимических реакций часть срезов подкрашивали квасцовым гематоксилином. Дл конфокальной лазерной микроскопии в качестве вторичных антител был использован биотинилированный антимышиный Fab-фрагмент иммуноглобулинов осла (Jackson ImmunoResearch, США; разведение 1:200) и стрептавидин, конъюгированный с флуоресцентным красителем карбоцианином (Cy2; Jackson ImmunoResearch, США; разведение 1:50). Для подтверждения астроглиальной природы части выявляемых клеток были проведены двойные иммунофлуоресцентные реакции с использованием наиболее селективного маркера астроцитов [12] - глиального фибриллярного кислого белка (GFAP). При этом в качестве первичных антител примен лись поликлональные кроличьи антитела к GFAP (Dako, Дания), а в качестве вторичных - свиные антикроличьи антитела, конъюгированные с тетраметилродамин-изотиоцианатом (TRITC), в разведении 1:25. Ядра клеток подкрашивали флуоресцентным красителем ToPro3. Анализ препаратов при микроскопии в проход щем свете и фотосъемку выполн ли, использу микроскоп Leica DM750 и цифровую фотокамеру ICC50 (Leica, Германи ). Препараты, обработанные антителами, конъюгированными с флуорохромами, исследовали при помощи конфокального лазерного микроскопа LSM-710 (Zeiss, Германи ), их трехмерную реконструкцию проводили с использованием компьютерной программы Zen-2011 (Zeiss, Германия). Для возбуждения флуоресценции Су2, TRITC и ToPro3 использовали лазеры с длиной волны 488, 561 и 633 нм соответственно. Морфо-метри производилась с помощью компьютерной программы LSM Image Browser (Zeiss, Германия). Результаты и их обсуждение. Исследование срезов при малом увеличении показало, что положительная иммунная реакция на Aldh1L1 присутствует в клетках всех областей головного мозга крысы. При этом отмечается неравномерность ее распределения в различных структурах мозга. Так, наибольшая интенсивность окраски отмечается в области поверхностной гл иальной пограничной мембраны (ПГПМ), вокруг кровеносных сосудов и в стенках желудочков мозга. При микроскопическом исследовании на большом увеличении на конвекситальной поверхности мозга, в теменной и височной областях коры ПГПМ выявляется в виде моно-сло выт нутых (распластанных) вдоль поверхности иммунопозитивных астроцитов, соединенных широколопастными отростками. Широкое основание клеток обращено в сторону поверхности, а от верхушки вглубь нервной ткани отходит единичный недлинный (до 30 мкм) волнистый (максимальная амплитуда волны до 3 мкм) неветвящийся отросток толщиной 0,8-1 мкм. По мере приближения к базальной поверхности мозга астроциты, формирующие ПГПМ, располагаются уже несколькими слоями уплощенных астроцитов, плотно прилежащих друг к другу, с короткими толстыми (около 4 мкм) переплетенными отростками. Кроме того, в этой области коры иммунопозитивную окраску имеют и астроциты звездчатой формы, локализованные в глубине I слоя коры и направляющие часть своих отростков к поверхностным астроцитам, формирующим ПГПМ (рис. 1, а). В сером веществе интенсивная положительная иммунная реакция наблюдается преимущественно в концевых ножках астроцитов, формирующих периваскул рные глиальные пограничные мембраны, или в некоторых астроцитах, имеющих уплощенную форму и непосредственно прилежащих к стенке сосуда. В единичных астроцитах серого вещества средней интенсивности реакция отмечается преимущественно в виде тонкого ободка перинуклеарной цитоплазмы и в начальных сегментах отростков, которые у них малочисленные, слабоветвящиеся, с толстым основанием и резко истончающимся концом. В белом веществе положительная иммунная реакция обнаруживается в перинуклеарной зоне тел единичных астроцитов и в начальных сегментах их крупных отростков. Детальное изучение стенок желудочков показало, что интенсивна окраска наблюдаетс в эпендимоци-тах. При этом при использовании иммерсионного объектива (*100) видно, что продукт иммунной реакции здесь вы вл етс в виде многочисленных, четко визуализирующихс , отграниченных друг от друга гранул различной формы, которые имеют вариабельные размеры от 0,1*0,2 до 1,3*3,7 мкм. Эти гранулы, нередко собираясь в крупные конгломераты, распределены по цитоплазме эпенди-моцитов в хаотичном порядке (рис. 1, б). а б Рисунок. Альдегиддегидрогеназа 1Е1-иммунопозитивные клетки головного мозга крысы: а - астроциты первого слоя базальной области коры больших полушарий; Об - область расположения мозговых оболочек. Одиночные стрелки - астроциты в составе поверхностной глиальной пограничной мембраны; двойная стрелка - астроцит, лежащий в глубоких отделах первого слоя и направляющий свой отросток в сторону поверхностной глиальной пограничной мембраны; б - эпендимоциты бокового желудочка: * - полость бокового желудочка; ССпл - сосудистое сплетение; одиночные стрелки - эпендимоциты; двойна стрелка - астроцит субвентрикул рной зоны, формирующий периваскул рную глиальную пограничную мембрану своими отростками. Иммуноцитохимическая реакция на альдегиддегидрогеназу 1L1 без подкраски. Светова микроскопия. Объектив *100, цифровая камера ICC 50. Полученные данные указывают на распространенность Aldh1L1 в клетках ЦНС крысы. При этом отмечается неравномерность его распределения в различных мозговых структурах. В ходе настоящего исследования одна из наиболее интенсивных иммуноцитохимических реакций была отмечена в концевых ножках отростков астроцитов и поверхностных астроцитах, формирующих ПГПМ, что свидетельствует о том, что именно эти астроциты являются местом хранения и метаболизма фолата в ЦНС. Веро тно, астроциты захватывают фолат из кровеносных капилл ров и спинномозговой жидкости, после чего преобразуют его с помощью Aldh1L1. Образующийся при этом тетрагидрофолат высвобождается в межклеточное пространство, из которого может быть захвачен нейронами через экспрессированные на них рецепторы. Еще одна клеточная популяция головного мозга, в которой была обнаружена интенсивная иммуноцитохимическая реакция на Aldh1L1 - эпендимоциты. Сам по себе этот факт не является удивительным, поскольку известно, что концентрация фолата, служащего субстратом дл Aldh1L1, в спинномозговой жидкости чрезвычайно высока [13]. Однако, в отличие от астроцитов, в которых продукт иммуноцитохимической реакции на Aldh1L1 вы вл етс в виде равномерного диффузного цитоплазматического окрашивания, в эпендимоцитах он представлен в виде рассредоточенных по цитоплазме гранул. Учитывая важность фолата в биосинтезе нуклеотидов и процессах клеточного деления [7], можно предположить, что эпендимоциты транспортируют его к располагающимся в субвентрикулярной зоне мигрирующим нейробластам и нейральным стволовым клеткам [14]. Кроме того, локализация AldhLl именно в клетках, формирующих барьеры головного мозга, веро тно, обусловливает и минимизацию токсического воздействи формиата на клетки ЦНС [15]. В связи с очевидными астроци-тарными морфологическими и топографическими признаками Aldh1L1 -иммунопозитивных клеток в белом веществе головного мозга и отсутствием экспрессии Aldh1L1 в каких-либо других клетках белого вещества маловеро тным вл етс предположение о присутствии этого белка в олигодендро-цитах. Также в рамках настоящего исследования ни в одной из исследованных областей Aldh1L1 не была обнаружена в перикарионах нейронов. Выводы. Таким образом, среди клеток головного мозга, экспрессирующих A ldh1L1, выдел ют-ся клетки макроглии. При этом явная экспрессия Aldh1L1 двумя различными клеточными популяциями, очевидно, свидетельствует об отсутствии абсолютной специфичности этого маркера по отношению к астрогл ии и самостоятельно не может примен тьс дл точной идентификации данной клеточной попул ции. Однако преимущественна локализаци Aldh1L1 в клетках головного мозга, участвующих в транспорте веществ через гематоэнцефалический, ликвороэнцефалический и гематоликворный барьеры, позвол ет рассчитывать на то, что этот белок окажется полезным функциональным маркером при проведении экспериментальных исследований, направленных на изучение барьерной системы ЦНС и оценке реакции головного мозга на воздействие токсичных продуктов метаболизма суррогатов алкогол .

E G Sukhorukova

FSBSI “Institute of Experimental Medicine”

D A Sufieva

FSBSI “Institute of Experimental Medicine”

D E Korzhevskii

FSBSI “Institute of Experimental Medicine”

  1. Сухорукова Е.Г., Гусельникова В.В. Ферменты - маркеры астроцитов // Мед. акад. журн. 2015. Т. 15, No 3. С. 31_37. [Suhorukova E.G., Gusel'nikova VV. Fermenty - markery astrocitov, Med. akad. zhurn. 2015. Vol. 15, No 3. рр. 31-37].
  2. Bernstein H.-G, Bannier J, Meyer-Lotz G, Steiner J, Keilhoff G, Dobrowolny H, Walter M, Bogerts B. Distribution of immunoreactive glutamine synthetase in the adult human and mouse brain. Qualitative and quantitative observations with special emphasis on extra-astroglial protein localization // J. Chemic. Neuroanat. 2014. Vol. 61-62. P. 33-50.
  3. De Vries E.M., Kwakkel J., Eggels L, Kalsbeek A., Barrett P., Fliers E., Boelen A. NFkB signaling is essential for the lipopolysaccharide-induced increase of type 2 deiodinase in tanycytes // Endocrinology. 2014. Vol. 155, No 5. P. 2000-2008.
  4. Сухорукова Е.Г., Гусельникова В.В., Коржевский Д.Э. Слутаминсинтетаза в клетках головного мозга крысы // Морфология. 2017. Т 152, No 6. С. 7-10. [Suhorukova E.G., Gusel'nikova VV., Korzhevskij D.Eh. Glutaminsintetaza v kletkah golovnogo mozga krysy, Morfologiya. 2017. Vol. 152, No 6. рр. 7-10].
  5. Cahoy J.D., Emery B, Kaushal A., Foo L.C., Zamanian J.L., Christopherson K.S., Xing Y, Lubischer J.L., Krieg P.A., Krupenko S.A., Thompson W.J., Barres B.A. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function // J. Neurosci. 2008. Vol. 28, No 1. P. 264-278.
  6. Yang Y, Vidensky S, Jin L, Jie C, Lorenzini I., Frankl M, Rothstein J.D. Molecular comparison of GLT1+ and ALDH1L1+ astrocytes in vivo in astroglial reporter mice // Glia. 2011. Vol. 59. P. 200-207.
  7. Benkovic S.J. The transformylase enzymes in de novo purine biosintheis // Trends Biochem. Sci. 1984. Vol. 9. P. 320-322.
  8. Krupenko S.A. FDH: An aldehyde dehydrogenase fusion enzyme in folate metabolism // Chem. Biol. Interact. 2009. Vol. 178, No 1-3. P. 84-93.
  9. Neymeyer V., Tephly T.R., Miller M.W. Folate and 10-formyltetrahydrofolate dehydrogenase (FDH) expression in the central nervous system of the mature rat // Brain Res. 1997. Vol. 766. P. 195-204.
  10. Коржевский Д.Э., Сухорукова Е.Г., Гилерович Е.Г., Петрова Е.С., Кирик О.В., Григорьев И.П. Преимущества и недостатки цинк-этанол-формальдегида как фиксатора для иммуноцитохимических исследований и конфокальной лазерной микроскопии // Морфология. 2013. Т. 143, No 2. С. 81-85. [Korzhevskij D.Eh., Suhorukova E.G., Gilerovich E.G., Petrova E.S., Kirik O.V., Grigoryev I.P. Preimushchestva i nedostatki cink-ehtanol-formal'degida kak fiksatora dlya immunocitohimicheskih issledovanij i konfokal'noj lazernoj mikroskopii, Morfologiya. 2013. Vol. 143, No 2. рр. 81-85].
  11. Korzhevskii D.E., Sukhorukova E.G., Kirik O.V., Grigorev I.P. Immunohistochemical demonstration of specific antigens in the human brain fixed in zinc-ethanol-formaldehyde // Europ. J. Histochem. 2015. Vol. 59, No 3. P. 5-9.
  12. Сухорукова Е.Г., Коржевский Д.Э., Алексеева O.C. Глиальный фибриллярный кислый белок - компонент промежуточных филаментов астроцитов мозга позвоночных // Журн. эвол. биохим. физиол. 2015. Т. 51, No 1. С. 3$10. [Suhorukova E.G., Korzhevskij D.Eh., Alekseeva O.S. Glial'nyj fibrillyarnyj kislyj belok - komponent promezhutochnyh filamentov astrocitov mozga pozvonochnyh, Zhurn. ehvol. biohim. fiziol. 2015. Vol. 51, No 1. рр. 3-10].
  13. Stanger O. Physiology of folic acid in health and disease // Curr. Drug. Metab. 2002. Vol. 3, No 2. P. 211-223.
  14. Коржевский Д.Э. Нейрогенез и нейральные стволовые клетки // Мед. акад. журн. 2010. Т. 10, No 4. С. 175-182. [Korzhevskij D.Eh. Nejrogenez i nejral'nye stvolovye kletki, Med. akad. zhurn. 2010. Vol. 10, No 4. рр. 175-182].
  15. Tephly T.R. The toxicity of methanol // Life Sci. 1991. Vol. 48, No 11. P. 1031-1041.

Views

Abstract - 163

PDF (Russian) - 6

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2018 Sukhorukova E.G., Sufieva D.A., Korzhevskii D.E.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies