SOME FEATURES OF THE STRESS REACTION IN RATS AFTER EXPOSURE TO STRESS AND ADMINISTRATION OF ANTIMICROBIAL PEPTIDE DEFENSIN RATNP-3

Abstract


Dynamics of corticosterone concentration and redistribution of leukocytes in the blood of rats under stressful impact and administration of the antimicrobial peptide defensin RatNP-3 have been studied. The experimental model of stress - swimming in cold (2-4° C) water in 2 min. Plasma corticosterone levels were evaluated by IFA kit for corticosterone. The number of leukocytes was counted in Goryaev chamber and a manual WBC differential was performed using blood smears. It have been shown that administration of defensin RatNP-3 immediately before stressful impact have normalized stress-induced changes in the number of neutrophils in the blood, and reduces stress-induced increase of corticosterone concentration in the blood of rats. The results of this study results suggest that defensin can act as an adaptogen during experimental stress in rats.

Full Text

Введение. В настоящее время не вызывает сомнения, что антимикробные пептиды (АМП) являются эволюционно отобранными молекулярными компонентами системы врожденного иммунитета - эндогенными пептидными антибиотиками, участвующими в неотложных реакциях противо-инфекционной защиты животных и человека [1-3]. Одной из наиболее распространенных групп АМП у млекопитающих являются дефенсины. Дефенсины - это группа близкородственных коротких полипептидов, богатых цистеином и аргинином, в их состав входит от 29 до 45 аминокислотных остатков. Термин «дефенсины» отражает их основное функциональное назначение, а именно способность обеспечивать защиту макроорганизма от возбудителей инфекционных заболеваний. Существует 4 семейства дефенсинов позвоночных: α-, β-, γ- и θ-дефенсины; отличительной структурной особенностью этих положительно заряженных молекул является наличие у них трех внутримолекулярных дисульфидных связей [4]. Исследованиями функциональной активности антимикробных пептидов в условиях животного организма было показано, что некоторые АМП млекопитающих (в частности, пептиды, содержащиеся в гранулах нейтрофилов) обладают рядом активностей, отличных от антибиотических [5]. Особый интерес представляют иммуномодулирующие свойства этих соединений как эндогенных регуляторов иммунного ответа. Одними из самых 64 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2014 г., ТОМ 14, № 4 распространенных воздействий, вызывающих изменения иммунного ответа, являются стрессирующие, которые приводят к перераспределительным реакциям лейкоцитов крови, изменению продукции цитокинов и гормонального уровня [6, 7]. Несмотря на то, что нейтрофилез является давно известным и одним из классических проявлений стресс-реакции, биологический смысл этого явления остается до конца не ясным. Поиски ведутся преимущественно в направлении изучения стресс-индуцированных изменений функциональной активности этих клеток [8]. В то же время можно предположить, что те антимикробные белки и пептиды, которые секрети-руются из нейтрофилов, обладают не только антибиотическим действием, но и в соответствии с принципами регуляции физиологических реакций могут оказывать влияние на развитие стресс-реакции и иммунного ответа. Данных, подтверждающих это предположение в отношении дефенсинов, пока немного. Так, установлено, что некоторые дефенси-ны могут влиять на антителообразование и на уровень глюкокортикоидных гормонов в условиях экспериментального стресса у животных [9, 10]. Настоящая работа посвящена изучению особен -ностей развития стресс-реакции у лабораторных животных при введении - дефенсина RatNP-3, выделенного из нейтрофилов крысы. Материалы и методы исследования. Экспериментальные животные. Эксперименты выполнены на крысах-самцах гетерозиготного штамма линии Wistar массой 120-150 г, полученных из питомника «Рапполово» (Санкт-Петербург). Животных содержали в условиях вивария при комнатной температуре с 12-часовым циклом свет/темнота, свободным доступом к воде и пище, на стандартной диете в соответствии с нормами содержания лабораторных животных. Получение дефенсина RatNP-3. Выделение дефенсина крысы RatNP-3 проводили по стандартной схеме, традиционно применяемой для выделения дефенсинов [11]. Использовали комплекс методов, включающих экстракцию пептидов из лейкоцитов крысы в кислой среде, их фракционирование методами ультрафильтрации и обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Концентрацию пептидов в пробах определяли спектрофотометрическим методом. Экспериментальная модель. В качестве экспериментальной модели стресса использовали комбинированный эмоционально-физический стресс - плавание в холодной воде (2-4° С) в течение 2 минут. Данная модель ранее была апробирована в отделе общей патологии и патологической физио логии ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН. Препарат RatNP-3 разводили в воде для инъекций и вводили животным внутрибрюшинно непосредственно перед стрессирующим воздействием из расчета 100 мкг/кг массы тела в объеме 500 мкл. Доза дефенсина выбиралась с тем расчетом, чтобы конечная концентрация препарата не превышала концентрацию пептида, имеющую место при процессе адаптации организма животных к неблагоприятным воздействиям. Забор крови осуществляли через 30 минут и 3 часа после окончания стрессирующего воздействия, после быстрой декапитации. Препарат RatNP-3 не содержал примесей липо-сахаридов, оценку содержания эндотоксинов проводили с помощью Лимулюс-теста («Lonza», США). Определение концентрации кортикостерона. Иммуноферментный анализ проводили на коммерческом наборе Corticosterone ELISA EIA-4164 фирмы DRG, согласно инструкции, приложенной к набору. Определение количества лейкоцитов. Подсчет количества лейкоцитов осуществляли в камере Горяева. Подсчет лейкоцитарной формулы крови вели на мазке под микроскопом. Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ Statistica 10.0. Достоверность различий между группами оценивали методом однофакторного дисперсионного анализа по post-hoc t-критериям по методу Бонферрони. Результаты и их обсуждение. В качестве модели экспериментального стресса нами был выбран эмоционально-физический стресс - плавание в течение 2 минут в холодной воде (2-4 °С). Ранее на данной модели стресса было показано, что тотальная фракция дефенсинов крысы (RatNP-1 - RatNP-4) снижает стресс-стимулированное повышение уровня кортикостерона в плазме крови и отменяет стресс-индуцированную иммуносупрессию, т. е. снижение уровня антител, синтезированных в ответ на инъекцию эритроцитов барана. Установлено, что отмена дефенсинами стресс-индуцированной иммуносупрессии имеет место только в том случае, если введение пептидов проводить в определенные сроки - не ранее, чем за 10 минут до стресса или сразу после аппликации стрессирующего воздействия (через 5 минут) [12]. Основываясь на этих данных, мы выбрали режим предварительного введения пептида RatNP-3 - за 2 минуты до стресса. Использованный в настоящей работе стресс сопровождается классической глюкокортикоидной реакцией, а именно повышением уровня кортикосте-рона в крови крыс в течение получаса после стресси- МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2014 г., ТОМ 14, № 4 65 рующего воздействия. К третьему часу после стрес-сирующего воздействия происходит его возвращение к исходному уровню (рис. 1). 2400 2000 1600 1200 800 400 I T п ПII η £L e о Сц 55 50 Н 40 ЗО 20 H 10 I X і д, I і 1 8 123456789 Рис. 1. Концентрация кортикостерона в сыворотке крови крыс через 30 минут и 3 часа после введения RatNP-3 и аппликации стрессирующего воздействия. По оси абсцисс группы экспериментальных животных: 1 - интактные; 2 - через 30 мин после введения растворителя; 3 - через 30 мин после введения RatNP-3; 4 - через 3 часа после введения растворителя; 5 - через 3 часа после введения RatNP-3; 6 - через 30 мин после введения растворителя и аппликации стрессирующего воздействия; 7 - через 30 мин после введения RATNP-3 и аппликации стрессирующего воздействия; 8 - через 3 часа после введения растворителя и аппликации стрессирующего воздействия; 9 - через 3 часа после введения RATNP-3 и аппликации стрессирующего воздействия. - отличается от всех групп; # - отличается от группы 1. p<0,005 по post-hoc t-критерию по методу Бонферрони. Одной из стандартных реакций на стресс является повышение содержания нейтрофилов в крови [13]. В рамках нашей работы вопрос о физиологической значимости явления нейтрофилеза имеет особое значение, поскольку именно нейтрофильные гранулоциты (нейтрофилы) представляют собой основной источник изучаемых нами пептидных молекул в крови. В связи с этим нами были оценены динамика числа нейтрофилов в крови крыс в ходе реализации стресс-реакции и перераспределение лейкоцитарного состава крови. На 30 -й минуте после аппликации стрессирующего воздействия достоверно понижалось процентное содержание нейтрофилов в крови крыс по отношению к контролю, тогда как к 3 часам относительное количество нейтрофилов достоверно повышалось (рис. 2), причем через 3 часа достоверно увеличивалось и абсолютное содержание нейтрофилов в крови крыс (рис. 3). Полученные данные свидетельствуют о том, что в ходе реализации стресс-реакции после комбинированного эмоционально-физического воздействия идет активное перераспределение клеток в системе крови, мобилизуются лейкоцитарные резервы организма. Рис. 2. Процентное содержание нейтрофилов в крови крыс через 30 минут и 3 часа после введения RatNP-3 и аппликации стрессирующего воздействия. По оси абсцисс группы экспериментальных животных: 1 - интактные; 2 - через 30 мин после введения растворителя; 3 - через 30 мин после введения RatNP-3; 4 - через 3 часа после введения растворителя; 5 - через 3 часа после введения RatNP-3; 6 - через 30 мин после введения растворителя и аппликации стрессирующего воздействия; 7 - через 30 мин после введения RATNP-3 и аппликации стрессирующего воздействия; 8 - через 3 часа после введения растворителя и аппликации стрессирующего воздействия; 9 - через 3 часа после введения RATNP-3 и аппликации стрессирующего воздействия. - отличается от групп 1 и 7; # - отличается от групп 1 и 9. p<0,005 по post-hoc t-критерию по методу Бонферрони. Я Є о & #Я 8000 700060005000 400030002000 1000-I I X I -І 1 3 8 9 Рис. 3. Содержание нейтрофилов в крови крыс через 30 минут и 3 часа после введения RatNP-3 и аппликации стрессирующего воздействия. По оси абсцисс группы экспериментальных животных: 1 - интактные; 2 - через 30 мин после введения растворителя; 3 - через 30 мин после введения RatNP-3; 4 - через 3 часа после введения растворителя; 5 - через 3 часа после введения RatNP-3; 6 - через 30 мин после введения растворителя и аппликации стрессирующего воздействия; 7 - через 30 мин после введения RATNP-3 и аппликации стрессирующего воздействия; 8 - через 3 часа после введения растворителя и аппликации стрессирующего воздействия; 9 - через 3 часа после введения RATNP-3 и аппликации стрессирующего воздействия. - отличается от всех групп. p<0,005 по post-hoc t-критерию по методу Бонферрони. Известно, что перераспределение лейкоцитов является следствием изменения уровня стрессорных 66 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2014 г., ТОМ 14, № 4 гормонов, в первую очередь глюкокортикоидов и катехоламинов, хотя у различных видов это проявляется по-разному. Так, у человека и крысы эпи-нефрин (адреналин) вызывает мобилизацию ней-трофилов [14, 15], и в то же время он не влияет на мобилизацию нейтрофилов у собак [16]. Проведенное нами исследование показало, что парентерально введенный дефенсин крысы RatNP-3 в используемых концентрациях не влияет на базальный уровень кортикостерона в крови крыс через полчаса и 3 часа после введения (рис. 1). При этом введение RatNP-3 также не влияло на клеточный состав крови на сроках 30 минут и 3 часа после введения (см. рис. 2, 3). Ранее канадскими исследователями было показано, что некоторые изоформы дефенсинов, названные ими кортикостатинами, в условиях культуры клеток оказывают тормозящее действие на АКТГ-индуциро-ванный стероидогенез клетками коркового слоя надпочечников, конкурентно взаимодействуя с рецепторами АКТГ Однако исследуемый нами дефенсин крысы RatNP-3, хотя и получил наименование кор-тикостатина 3, в этих опытах in vitro не проявлял заметной кортикостатической активности [17]. Мы впервые исследовали кортикостатическое действие RatNP-3 в условиях in vivo и показали, что введение дефенсина RatNP-3 достоверно снижало индуцированное стрессом повышение уровня корти-костерона в крови крыс через 30 минут после аппликации стресса (рис. 1). Полученные результаты позволяют предположить опосредованный механизм действия RatNP-3 на стероидогенез при стрессе (либо совместное действие с каким-либо эндогенным фактором, например, катехоламинами). На данный момент не существует опубликованных работ, посвященных влиянию дефенсинов на клеточный состав крови. Нами впервые было показано, что введение дефенсина крысы влияет на перераспределе ние лейкоцитов в крови при экспериментальном стрессе. Установлено, что введение дефенсина RatNP-3 нормализует процентное содержание нейтрофилов в крови экспериментальных крыс на сроках 30 минут и 3 часа после аппликации стресса (см. рис. 2) и снижает индуцированное стрессом повышение общего числа нейтрофилов через 3 часа после стресса (см. рис. 3). На основании полученных данных можно предположить, что дефенсины, секретируемые ней-трофилами в кровь, включаются в формирование механизмов обратной связи, направленных на снижение числа циркулирующих нейтрофилов. Реализация данных механизмов может дополнительно осуществляться через регуляцию продукции катехоламинов симпатоадреналовой системой путем модулирования работы Са2+ ионных каналов по аналогии с действием некоторых омега-конотоксинов [18], структура которых схожа со структурой дефенсинов - те и другие представляют собой цистинсодержащие катионные пептиды. В дополнение к этому дефенсины могут влиять на нейрогенные механизмы регуляции, воздействуя на медленные натриевые каналы нейронов [19]. Выводы. Продемонстрировано, что парентеральное введение дефенсина RatNP-3 непосредственно перед стрессирующим воздействием нормализует стресс-индуцированые изменения числа нейтро-фильных гранулоцитов в крови. Впервые показано, что введение дефенсина RatNP-3 снижает индуцированное стрессом повышение концентрации корти-костерона в крови крыс, в то время как по данным литературы RatNP-3 не проявляет кортикостатическое действие в условиях in vitro. Результаты данного исследования позволяют сделать вывод о нормализующем (адаптогенном) действии дефенсина RatNP-3 на организм при экспериментальном стрессе у крыс и рассматривать его в качестве медиаторной молекулы в нейроэндокри-ноиммунных взаимодействиях.

About the authors

I A Yankelevich

Institute of Experimental Medicine of the North-West Branch of the Russian Academy of Medical Sciences

Email: irinkab@bk.ru

G M Aleshina

Institute of Experimental Medicine of the North-West Branch of the Russian Academy of Medical Sciences

Email: galina_aleshina@mail.ru

V N Kokryakov

Institute of Experimental Medicine of the North-West Branch of the Russian Academy of Medical Sciences

Email: kokryak@yandex.ru

References

  1. Кокряков В. Н. Очерки о врожденном иммунитете.- СПб.: Наука, 2006.- 262 с.
  2. Boman H. G. Peptide antibiotics and their role in innate immunity // Annu. Rev. Immunol.- 1995.- Vol. 13.- P. 61-92.
  3. Кокряков В. Н., Алешина Г. М., Шамова О. В. и др. Современная концепция об антимикробных пептидах как молекулярных факторах иммунитета // Медицинский академический журнал.- 2010.- Т. 10.- С. 149-160.
  4. Lehrer R. I. Evolution of antimicrobial peptides: a view from the cystine chapel // Antimicrobial Peptides and Innate Immunity, Progress in Inflammation Research / P. S. Hiemstra and S. A. J. Zaat (eds.) - Springer Basel, 2013.- P. 1-28.
  5. Pleskach V. A., Aleshina G. M., Artsybasheva I. V. et al. Cytotoxic and mitogenic effect of antimicrobial peptides from neutrophils on cultured cells // Цитология.- 2000.- Т. 42, № 3.- С. 228-234.
  6. Корнева Е. А., Шхинек Э. К. Гормоны и иммунная система.- Л.: Наука, 1988.- 251 с.
  7. Webster J. I., Tonelli L., Sternberg E. M. Neuroendocrine regulation of immunity // Annu. Rev. Immunol.- 2002.- Vol. 20.- P. 125-163.
  8. Khanfer R., Phillips A. C., Carroll D., Lord J. M. Altered human neutrophil function in response to acute psychological stress // Psychosomatic Medicine.- 2010.- Vol. 72.- P. 636-640.
  9. Шамова О. В., Лесникова М. П., Кокряков В. Н. и др. Действие дефенсинов на уровень кортикостерона в крови и иммунный ответ при стрессе // Бюлл. экспер. биол. и мед.- 1993.- Т. 115, № 6.- С. 646-649.
  10. Cervini L. A., Gray W. R., Kaiser R. et al. Rat corticostatin R4: synthesis, disulfide bridge assignment, and in vivo activity // Peptides.- 1995.- Vol. 16.- P. 837-842.
  11. Цветкова Е. В., Алешина Г. М., Шамова О. В. и др. -Дефенсины из лейкоцитов крови обезьяны Papio hamadryas // Биохимия.- 2006.- Т. 71, вып. 8.- С. 1083-1090.
  12. Орлов Д. С. Эффекты действия дефенсинов при стрессе: автореф. дис.. канд. биол. наук.- СПб., 1998.- 20 с.
  13. Горизонтов П. Д. Стресс. Система крови в механизме гомеостаза. Стресс и болезни // Гомеостаз / Под ред. П. Д. Горизонтова.- М.: Медицина, 1981.- C. 538-570.
  14. Davis J. M., Albert J. D., Tracy K. J. et al. Increased neutrophil mobilization and decreased chemotaxis during cortisol and epinephrine infusions // Journal of Trauma and Acute Care Surgery.- 1991.- Vol. 31.- P. 725-731.
  15. Dhabhar F. S., Malarkey W. B., Neri E., McEwen B. S. Stress-induced redistribution of immune cells - from barracks to boulevards to battlefields: a tale of three hormones // Psychoneuroendocrinology.- 2012.- Vol. 37.- P. 1345-1368.
  16. Parks K. R., Davis J. M. Epinephrine, cortisol, endotoxin, nutrition, and the neutrophil // Surg Infect (Larchmt).- 2012.- Vol. 13.- P. 300-306.
  17. Solomon S. Corticostatins // Trends Endocrinol Metab.- 1993.- Vol. 4.- P. 260-264.
  18. Terlau H., Olivera B. M. Conus venoms: a rich source of novel ion channel-targeted peptides // Physiol. Rev.- 2004.- Vol. 84.- P. 41-68.
  19. Плахова В. Б., Рогачевский И. В., Щееголев Б. Ф. и др. Дефенсин NP-4 уменьшает потенциалочувствительность медленных натриевых каналов сенсорных нейронов // Сенсорные системы.- 2005.- Т. 19, № 2.- С. 123-131.

Statistics

Views

Abstract - 60

PDF (Russian) - 3

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2014 Yankelevich I.A., Aleshina G.M., Kokryakov V.N.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies