MICROGLIA OF THE HUMAN SUBSTANTIA NIGRA

Abstract


The structure and distribution of microglial cells was studied in the human substantia nigra (the main dopaminergic center of the brain). Microgliocytes were revealed using immunocytochemistry for the protein Iba1, the specific microglial marker. The found microgliocytes in the substantia nigra belong to the ramnified microglia, which is the most common in the adult brain. Predominant distribution of microgliocytes was revealed in the reticular part of the substantia nigra in comparison with the compact part. Atypical concentration of the protein Iba1 was found in the nucleus of the microglial cells and a variety of the intranuclear immunocytochemical reaction is described.

Full Text

Введение. Клетки микроглии - особая разновидность тканевых макрофагов, которые присутствуют в органах нервной системы и имеют мезенхимное происхождение [1, 2]. Микроглия закономерно считается ключевым элементом воспалительного процесса, развивающегося в нервной ткани в ответ на воздействия повреждающих факторов и проникновение возбудителей инфекций [3, 4]. Такая форма воспаления имеет особые характеристики и обозначается как ней-ровоспалительный процесс или нейровоспаление (neuroinflammation) [5, 6]. Последний вариант является транскрипцией английского термина и не совсем удачен для русскоязычных текстов. Нейровоспалительный процесс с участием микроглии характерен для нейродегенеративных заболеваний [6]. Наиболее активно изучается роль микроглии в развитии болезни Альцгеймера [7, 8]. Менее известна ее роль при развитии болезни Паркинсона, затрагивающей черное вещество головного мозга, в котором по мере прогрессирования заболевания происходит дегенерация дофаминергических нейронов. При изучении нейродегенерации дофаминергических нервных центров в эксперименте возникает вопрос о сопоставимости наблюдаемых у лабораторных животных клеточных реакций со структурными изменениями, происходящими в черном веществе головного мозга человека при старении и нейродегенерации. Для того чтобы правильно ответить на поставленный вопрос, необходимо иметь детальные данные об организации микроглии черного вещества у человека при отсутствии нейродегенеративного процесса. Настоящее исследование выполнено с целью получения сведений о структурной организации микроглии черного вещества головного мозга человека, необходимых для сравнительной характеристики изменений, происходящих в этом дофаминергическом нервном центре при развитии нейродегенеративного процесса. Материалы и методы исследования. Исследование выполнено на 10 объектах - фрагментах головного мозга человека (25-78 лет) из архива лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы Института экспериментальной медицины. Программа исследований имеет положительное заключение локального этического комитета ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН. Исследованный материал был фиксирован МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2014 г., ТОМ 14, № 4 69 в цинк-этанол-формальдегиде, который хорошо зарекомендовал себя как универсальный фиксатор для иммуноцитохимических исследований [9-12]. После фиксации материал был обезвожен и залит в парафин по общепринятой методике. Из архивных блоков готовили срезы толщиной 10 мкм на санном микротоме Leica SM2000R (Leica, Германия) и наклеивали их на стекла с фабричным адгезивным покрытием HistoBond (Marienfeld, Германия). После стандартной процедуры депарафинирования и регидратации, проводили тепловое демаскирование антигена в специальном буфере (БиоВитрум, Россия). Для блокирования эндогенной пероксидазы срезы инкубировали в 3% растворе перекиси водорода, а для блокирования неспецифических сайтов связывания антигена - в блокировочном растворе («Protein Block», Spring Bioscience, США). Клетки микроглии выявляли при помощи поликлональных козьих антител к белку Iba-1 (разведение 1:200, AbCam, Великобритания). Для выявления комплекса антиген-антитело для световой микроскопии применяли вторичные антикозьи биотинилированные антитела (разведение 1: 200, номер по каталогу Е0466, Dako, Дания) и стрептавидин, конъюгированный с перокси-дазой (Spring Bioscience, США). Для визуализации продукта иммуноцитохимической реакции при световой микроскопии использовали хромоген DAB+ (Dako, Дания). Препараты исследовали под микроскопом Leica DM750, фотосъемку выполняли с помощью фотокамеры ICC50 (Leica, Германия). Результаты и их обсуждение. Изучение полученных препаратов показало, что во всех исследованных случаях селективно выявились отростчатые клетки, имеющие морфологические признаки микроглиоци-тов. У клеток микроглии имелись многочисленные по-разному ветвящиеся отростки. Кроме типичных микроглиоцитов, в препаратах присутствовали единичные удлиненные и овальные иммунопозитивные клетки, которые располагались периваскулярно. При изучении различных компартментов черного вещества было обнаружено преобладание микроглии в ретикулярной его части (pars reticulata), тогда как в компактной части (pars compacta) клеток микроглии наблюдалось меньше. Отчетливая возрастная связь в характере распределения микроглии в различных участках черного вещества отсутствовала, однако в компактной части черного вещества у лиц старших возрастных групп микроглиоциты имели более сложную организацию отростков. Вокруг дофаминергических нейронов, которые можно было легко идентифицировать по присутствию нейромеланина (рис. 1), часто можно было наблюдать группировку отростков микроглиоцитов, причем эта осо бенность была более характерна для лиц старшего возраста. В ходе исследования обнаружено, что микроглио-циты черного вещества головного мозга человека различаются не только по расположению, характеру ветвления отростков, но и по содержанию белка Iba-1 в ядре клетки. Ранее при проведении исследований микроглии головного мозга лабораторных животных [13-18] создавалось впечатление, что иммуноцитохимически выявляемый белок Iba-1, распределенный в перинуклеарной цитоплазме, Рис. 1. Общий вид Iba-1 иммунопозитивных клеточных элементов в компактной части черного вещества головного мозга человека: а - мужчина 25 лет; б - женщина 78 лет. Стрелками указаны скопления нейромеланина в цитоплазме дофаминергических нейронов. Сами нейроны не видны. Окраска: иммуноцитохимическая реакция на белок Iba-1 без подкраски. Масштабный отрезок равен 50 мкм. экранирует ядро и оно остается недоступным для наблюдения при обычной световой микроскопии. У человека наблюдается меньшая концентрация Iba-1 в перинуклеарной зоне. Обычно более интен 70 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2014 г., ТОМ 14, № 4 сивно окрашиваются отростки, поэтому ядро клетки становится доступным для изучения. Было выявлено четыре формы клеток микроглии, которые различались по характеру внутриядерной реакции на белок Iba-1 (рис. 2). Это клетки, содержащие в ядре равномерно распределенный белок Iba- 1, причем интенсивность реакции ядра не превышала интенсивности реакции в отходящих от клетки отростках (см. рис. 2, а). Нередко встречались клетки с иммунонегативной кариоплазмой и интенсивно окрашенной гранулой, имеющей центральное расположение. Иногда таких гранул встречалось несколько (см. рис. 2, б). Достаточно редко наблюдались клет ки с интенсивно окрашенным ядром, внутренняя структура которого была неразличима (см. рис. 2, в). Встречались и клетки, в которых ядро было окрашено очень слабо и угадывалось только благодаря отходящим от перинуклеарной области иммунопозитив-ным отросткам (см. рис. 2, г). В настоящем исследовании были получены новые данные о микроглии черного вещества головного мозга человека. Первая группа данных относится к клеточным типам, выявляемым при проведении иммуноцитохимической реакции на белок Iba-1. Это отростчатые клетки, имеющие характерные признаки микроглиоцитов, и округлые, овальные и вытянутые Рис. 2. Различные формы микроглиоцитов черного вещества головного мозга человека. Одиночной стрелкой отмечено ядро микроглиоцита, двойной стрелкой отмечено скопление гранул нейромеланина в цитоплазме дофаминергического нейрона, контур которого на препарате не определяется. Окраска: иммуноцитохимическая реакция на белок Iba-1 без подкраски. Масштабный отрезок равен 10 мкм. МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2014 г., ТОМ 14, № 4 71 клетки без отростков, располагающиеся преимущественно периваскулярно. Это два типа клеток выполняющих в головном мозге сходные функции - микро-глиоциты и периваскулярные макрофаги. Необходимо отметить, что микроглиальный маркер Iba-1 (Ionized calcium Binding Adaptor molecule 1) - относится к группе кальций-связывающих белков. Он имеет молекулярную массу 17 кДa и состоит из 147 аминокислот, образующих компактный домен, содержащий два кальций-связывающих участка, богатых гидрофобными аминокислотами [19]. Предполагают, что белок Iba-1 аналогичен другим белкам - AIF-1 (allograft inflammatory factor-1), MRF-1 (microglia response factor) и даинтаину [20, 21]. Про функции Iba-1 известно, что он участвует в реорганизации цитоскелета и изменении конфигурации цитоплазматической мембраны - процессах, происходящих при фагоцитозе [22, 23]. И поэтому закономерным является то, что он экспрессируется в фагоцитирующих клетках нервной системы - микроглиоцитах и макрофагах. Микроглиоциты черного вещества головного мозга могут быть отнесены к основному типу микроглиоци-тов, встречающихся в зрелом головном мозге, рамни-фицированной (или ветвящейся [24]) микроглии. Активированный фенотип - амебоидная микроглия - не характерен для черного вещества головного мозга человека, включая и субъектов старших возрастных групп. Второе важное наблюдение состоит в том, что концентрация микроглиоцитов более характерна для нервной ткани ретикулярной части черного вещества, чем для компактной. Это может быть связано с особой функцией микроглиоцитов, установленной в последние годы. Оказалось, что микроглиоциты непосредственно участвуют в регуляции синаптической пластичности [25, 26], а ретикулярная часть черного вещества - важнейшая синаптическая зона. Третье наблюдение, представляющее несомненный интерес,- обнаружение необычной концентрации белка Iba-1 в ядрах микроглиоцитов. Известно, что другие кальцийсвязывающие белки способны накапливаться в ядрах клеток. Такой способностью, например, обладает кальбиндин, являющийся маркером клеток Пуркинье в коре мозжечка [12]. Однако для других кальцийсвязывающих белков характерно относительно равномерное распределение в ядре клетки. Агрегация Iba-1 в единичной внутриядерной грануле наводит на предположение, что этой гранулой является ядрышко. Однако это предположение нуждается в доказательствах, которые пока отсутствуют. Дело в том, что ядрышки в микроглиоцитах наблюдали ранее только с использованием электронной микроскопии. При световой микроскопии это возможно, применив метод серебрения ядрышек (AgNOR) [27]. Но использование этого метода не позволяет провести идентификацию микроглиоцитов голвного мозга. И поэтому вопрос о том, какие внутриядерные структуры в ядре части микроглиоцитов концентрируют кальций-связывающий белок Iba-1, остается открытым. Таким образом, в настоящем исследовании получены приоритетные данные об организации и распределении микроглии в различных отделах черного вещества головного мозга человека, которые могут служить основой для сравнительного анализа изменений микроглии, происходящих при развитии нейродегенерации дофаминергической нейромедиатор-ной системы. Новые сведения о внутриядерном распределении белка Iba-1 в клетках микроглии нуждаются в дальнейшей проверке с использованием комплексных методических подходов.

About the authors

D E Korzhevskii

Institute of Experimental Medicine of the North West Branch of the Russian Academy of Medical Science

O V Kirik

Institute of Experimental Medicine of the North West Branch of the Russian Academy of Medical Science

Email: iemmorphol@yandex.ru

E G Sukhorukova

Institute of Experimental Medicine of the North West Branch of the Russian Academy of Medical Science

Email: iemmorphol@yandex.ru

M A Syrszova

Institute of Experimental Medicine of the North West Branch of the Russian Academy of Medical Science

Email: marina.syrczova@mail.ru

References

  1. Alliot F., Godin I., Pessac B. Microglia derive from progenitors, originating from the yolk sac, and which proliferate in the brain // Brain Res. Dev. Brain Res.- 1999.- Vol. 117, № 2.- Р. 145-152.
  2. Harry G. J., Kraft A. D. Microglia in the developing brain: a potential target with lifetime effects. Neurotoxicology.- 2012.- Vol. 33.- Р. 191-206.
  3. Graeber M. B., Streit W. J. Microglia: biology and pathology // Acta Neuropathol.- 2010.- Vol. 119.- Р. 89-105.
  4. Kreutzberg G. W. Microglia: a sensor for pathological events in the CNS // Trends Neurosci.- 1996.- Vol. 19, № 8.- Р. 312-318.
  5. Marshall S. A., McClain J. A., Kelso M. L. et al. Microglial activation is not equivalent to neuroinflammation in alcohol-induced neurodegeneration: The importance of microglia phenotype // Neurobiol. Dis.- 2013.- Vol. 54.- Р. 239-251.
  6. Gonzalez H., Elgueta D., Montoya A., Pacheco R. neuroimmune regulation of microgliak activity involved in neuroinflammation and neurodegen-erative diseases // J. Neuroimmunol.- 2014.- Vol. 274, № 1-2.- P. 1-13.
  7. Varnum M. M., Ikezu T. The classification of microglial activation phenotypes on neurodegeneration and regeneration in Alzheimer's disease brain // Arch. Immunol. Ther. Exp.- 2012.- Vol. 60 - Р. 251-266.
  8. Wojtera M., Sobow T., Ktoszewska I. et al. Expression of immunohistochemical markers on microglia in Creutzfeldt-Jakob disease and Alzheimer's disease: morphometric study and review of the literature // Folia neuropathologica.- 2012.- Vol. 50, № 1.- Р. 74-84.
  9. Коржевский Д. Э., Сухорукова Е. Г., Гилерович Е. Г., Петрова Е. С., Кирик О. В., Григорьев И. П. Преимущества и недостатки цинк-этанол-формальдегида как фиксатора для иммуноцитохимических исследований и конфокальной лазерной микроскопии // Морфология.- 2013.- Т. 143, № 2.- С. 81-85.
  10. Коржевский Д. Э., Григорьев И. П., Новикова А. Д., Ковальчук В. А., Кирик О. В. Холинергические структуры поясной коры головного мозга крысы // Медицинский академический журнал.- 2013.- Т. 13, № 4.- С. 49-53.
  11. Сырцова М. А., Колос Е. А., Снегова В. А., Гусельникова В. В. Применение различных флуоресцентных красителей для окраски ядер клеток в фиксированном биологическом материале Медицинский академический журнал.- 2014.- Т. 14, № 2.- С. 34-39.
  12. Коржевский Д. Э., Гусельникова В. В., Гилерович Е. Г., Кирик О. В., Сухорукова Е. Г. Применение иммуноцитохимической реакции на кальбиндин для изучения структурной организации дендритов клеток Пуркинье мозжечка человека // Медицинский академический журнал.- 2014.- Т. 14, № 3.- С. 33-37.
  13. Кирик О. В., Сухорукова Е. Г., Алексеева О. С., Коржевский Д. Э. Субэпендимные микроглиоциты третьего желудочка головного мозга // Морфология.- 2014.- Т. 145, вып. 2.- С. 67-69.
  14. Кирик О. В., Сухорукова Е. Г., Коржевский Д. Э. Кальций-связывающий белок Iba-1/AIF-1 в клетках головного мозга крысы // Морфология.- 2010.- Т. 137, вып. 2.- С. 5-8.
  15. Коржевский Д. Э., Кирик О. В., Сухорукова Е. Г., Власов Т. Д. Структурная организация микроглиоцитов стриатума после транзиторной фокальной ишемии // Морфология.- 2012.- Т. 141, вып. 2.- С. 19-24.
  16. Коржевский Д. Э., Ленцман М. В., Кирик О. В., Отеллин В. А. Морфологические типы активированной микроглии гиппокампа, наблюдаемые после транзиторной общей ишемии головного мозга // Морфология.- 2012.- Т. 142, вып. 5.- С. 30-33.
  17. Сухорукова Е. Г., Захряпин М. С., Аничков Н. Н., Коржевский Д. Э. Выявление микроглии в препаратах головного мозга длительное время хранившихся в растворе формалина // Морфология.- 2012.- Т. 142, вып. 5.- С. 32-35.
  18. Сухорукова Е. Г., Кирик О. В., Коржевский Д. Э. Применение иммуногистохимического метода для выявления микроглии головного мозга в парафиновых срезах // Бюлл. Эксп. Биол. Мед.- 2010.- Т. 149, № 6.- С. 709-712.
  19. Yamada M., Ohsawa K., Imai Y. et al. X-ray structure of the microglia/macrophage-specific protein Iba1 from human and mouse demonstrate novel molecular conformation change induced by calcium binding // J. Mol. Biol.- 2006.- Vol. 364.- Р. 449-457.
  20. Deininger M. H., Meyermann R., Schluesener H. J. The allograft inflammatory factor-1 family of proteins // FEBS Lett.- 2002.- Vol. 514.- Р. 115-121.
  21. Kohler C. Allograft inflammatory factor-1/Ionized calcium-binding adapter molecule 1 is specifically expressed by most subpopulations of macrophages and spermatids in testis // Cell Tissue Res.- 2007.- Vol. 33.- Р. 291-302.
  22. Ohsawa K., Imai Y., Kanazawa H. et al. Involment of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia // J. Cell Sci.- 2000.- Vol. 133.- Р. 3073-3084.
  23. Ohsawa K., Imai Y., Sasaki Y., Kohsaka S. Microglia/macrophages-specific protein Iba1 binds to fimbrin and enhances its actin-bundling activity // J. Neurochem.- 2004.- Vol. 88.- Р. 844-856.
  24. Хожай Л. И., Отеллин В. А. Реактивные изменения микроглии в неокортексе и гиппокампе у крыс после воздействия острой перинатальной гипоксии // Морфология.- 2013.- Т. 143, вып. 1.- С. 23-27.
  25. Wake H., Moorhouse A. J., Jinno S. еt al. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals // J Neurosci.- 2009.- Vol. 29.- Р. 3974-3980.
  26. Salter M. W., Beggs S. Sublime microglia: expanding roles for the guardians of the CNS // Cell.- 2014.- Vol. 158, № 1.- P. 15-24.
  27. Коржевский Д. Э., Кирик О. В. Специальные методы окраски, используемые для изучения структур клеточного ядра // Морфологическая диагностика: подготовка материала для морфологического исследования и электронной микроскопии: руководство / под ред. Д. Э. Коржевского.- Изд -во: СпецЛит.- 2013.- С. 74-84.

Statistics

Views

Abstract - 53

PDF (Russian) - 1

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2014 Korzhevskii D.E., Kirik O.V., Sukhorukova E.G., Syrszova M.A.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies