Поверхностная экспрессия эпитопов SARS-CoV-2 в Enterococcus faecium L3 для живой пероральной вакцины против новой коронавирусной инфекции

Полный текст

Список сокращений

Ig — иммуноглобулин; ФБ — фосфатно-солевой буфер.

Обоснование

Пандемия SARS-CoV-2 стала стимулом появления новых инъекционных вакцин, обеспечивающих специфический иммунный ответ с выработкой иммуноглобулина G (IgG). Однако известно, что защита от патогенов в воротах инфекции, на поверхностях слизистых оболочек, в основном зависит от IgA-ответа. Некоторые генетически модифицированные бактерии, включая мукозальные вакцины, — это перспективные носители для доставки терапевтических молекул через слизистую оболочку рта или носа. Вакцины для слизистых оболочек на основе пробиотиков легко производить в больших количествах, они имеют низкую стоимость, обеспечивают довольно длительную Т-клеточную память, при этом реакция кишечного IgA-ответа на пероральные вакцины достаточно мощная [1].

Отделом молекулярной микробиологии Института экспериментальной медицины создан новый кандидат на вакцину против SARS-CoV-2 с фрагментом гена S1 SARS-CoV-2 [2]. Этот фрагмент ДНК вставлен в ген белка пилей Enterococcus faecium L3. Секвенирование ДНК доказало наличие вставки в геноме энтерококка.

Цель статьи — исследовать экспрессию мРНК фрагмента гена S1 SARS-CoV-2 в культуре E. faecium L3 и подтвердить встраивание фрагмента белка S1 SARS-CoV-2 в пили исходного (E. faecium L3) и генетически модифицированного штамма (L3-SARS) методом иммуноэлектронной микроскопии с человеческими сыворотками, полученными от пациентов с SARS-CoV-2.

Материалы и методы

Транскрипция фрагмента гена белка SarsS, вставленного в бактериальную ДНК. Экспрессию мРНК изучали с помощью ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией (ОТ–ПЦР–РВ) с использованием праймеров, специфичных для S-белка. Бактерии выращивали в среде THB (бульон Тodd Hewitt Broth) при 37 °C в течение 18 ч. E. faecium L3-SARS культивировали с 5 мкг/мл эритромицина (Sigma, США). Для анализа мРНК применили 10-кратный концентрат. Выделение тотальной РНК проводили GeneJET RNA Purification Kit (Thermo Scientific, США). Выделенную РНК обрабатывали 1 ЕД/мкл ДНКазы (Invitrogen, США), затем проводили одношаговую ОТ–ПЦР–РВ на термоциклере SFX96 (BioRad, США) с HS-qPCR SYBR Blue master-mix (Biolabmix, Новосибирск, Россия). SarsS-специфичные праймеры (F — ТТGCATATGGGTTTCCAACCCACT, R — GTAGAATTCGTTGTTACATGTTCA) применяли для анализа экспрессии гена белка SarsS. Нормализующий ген — ген D-аланин-D-аланин лигазы E. faecium L3 (праймеры F — TTGAGGCAGACCAGATTGACG, R — TATGACAGCGACTCCGATTCC). Данные проанализированы методом сравнительных пороговых циклов (ΔΔCt), нормализованы к гену D-аланин-D-аланин лигазы L3.

Иммуноэлектронная микроскопия. Бактерии выращивали в среде LB (Luria Broth, VWR Life Science Products Amresco, США) при 37 °C в течение 18 ч. E. faecium L3-SARS культивировали с 5 мкг/мл эритромицина. Для микроскопии выбрали 10-кратный концентрат бактерий. Источником первичных антител был пул поликлональных сывороток человека, содержащих IgG, специфичных для S1 Sars-CoV-2. Сыворотки предварительно дважды адсорбировали на чистой культуре L3, чтобы избежать неспецифического связывания.

Мечение проводили козьими IgG, конъюгированными с частицами золота 18 нм (1 мг/мл; Jackson ImmunoResearch Laboratories, США). Образцы бактериальной культуры наносили на сетки для просвечивающей электронной микроскопии (защитная пленка Formvar FF400-AU толщиной 5–6 нм, квадратная, 400-ячеечная золотая сетка, Electron Microscopy Science, США) методом жидких суспензий («капля на сетке») с последующей инкубацией в течение 2 мин при комнатной температуре. Затем сетки фиксировали 1 мин в 2,5 % параформальдегиде с фосфатно-солевым буфером (ФБ).

Блокировку проводили 0,1 % желатином в ФБ в течение 1 ч. Первичные антитела разводили в 2 % БСА/ФБ (бычий сывороточный альбумин/фосфатно-солевой буфер), инкубация продолжалась 1 ч. Вторичные антитела разводили 1 : 20 в 2 % БСА/ФБ, образцы инкубировали 1 ч. Для контрастирования использовали 1 % уранилацетат в капле 20 мкл (20 с). Чтобы уплотнить (предохраняя от разрывов) полученные пленки, их покрыли слоем наноуглерода. Электронную микроскопию проводили на просвечивающем электронном микроскопе JEM-2100 (JEOL, Япония). Фотографии сделаны цифровыми камерами: нижний порт — Gatan Ultrascan 4000 16 Мп, 4 × 4 К, 16 бит; боковой порт — Gatan Erlangshen 500 1,4 Мп, 1,3 × 1 К, 12 бит, 15 кадров в секунду (Gatan, США).

Результаты

Изучение экспрессии фрагмента ДНК спайкового белка S в составе L3-SARS. Показано значительное увеличение амплификации последовательности SarsS по сравнению с контролем (рис. 1). Эти результаты подтвердили, что ДНК sarsS в геноме E. faecium L3 транскрибируется вместе с геном-мишенью в геноме E. faecium L3.

 

Рис. 1. Усредненные уровни экспрессии мРНК фрагмента гена sarsS в культуре E. faecium L3 относительно чистого L3. Планками погрешностей показано стандартное отклонение

Fig. 1. Averaged levels of mRNA expression of sarsS gene fragment in E. faecium L3 culture relatively to pure L3. Error bars show the standard deviation

 

Визуализация расположения экспрессируемого эпитопа белка S1 SARS-CoV-2 на поверхности клеток E. faecium L3. Электронная микроскопия штамма L3-SARS показала многочисленные цепочки из более 10 молекул, взаимодействующих с золотой меткой. Часть метки накапливается только на поверхности клетки, отображая дифференциальную экспрессию белка пилей, измененную в результате генетических манипуляций (рис. 2, a). Как и ожидалось, E. faecium L3 специфически не взаимодействовал с IgG пациентов с COVID-19 (см. рис. 2, b). Данные иммуноэлектронной микроскопии показывают, что фрагмент S-белка SARS-CoV-2 не только экспрессируется на поверхности энтерококкового рекомбинантного штамма, но и способен быть частью правильно собранного энтерококкового пиля. Это открытие делает штамм L3-SARS интересным вакцинным кандидатом из-за легкого доступа пилей к иммунной системе хозяина.

 

Рис. 2. Иммуноэлектронная микроскопия исходного (E. faecium L3) и генетически модифицированного штамма (L3-SARS) после обработки поликлональной сывороткой от пациентов с COVID-19 с последующей обработкой меченным козьим IgG, конъюгированным с частицами золота 18 нм: a — штамм L3-SARS; b — E. faecium L3 [2]

Fig. 2. Immunoelectron microscopy of original (E. faecium L3) and genetically modified strain (L3-SARS) after treatment using polyclonal serum from patients with COVID-19 with subsequent treatment by goat IgG conjugated with 18 nm gold particles: a — strain L3-SARS; b — E. faecium L3 [2]

 

Обсуждение

Микробиота человека обеспечивает дополнительную защиту от вирусных патогенов на поверхности слизистых оболочек, что делает пробиотические бактерии чрезвычайно полезными факторами, положительно влияющими на микроокружение.

Механизм внедрения фрагмента гена S-белка вируса SARS-CoV-2 в энтерококковый штамм основан на способе, разработанном ранее для включения фрагментов ДНК стрептококка в энтерококковый ген, кодирующий основной белок пилей и, таким образом, экспрессирующий чужеродный белок на поверхности пробиотической бактерии [3]. Генетический принцип этого метода базируется на постоянной интеграции суицидальной плазмиды в бактериальный геном. Хорошо известно, что грамположительные бактерии, включая E. faecium, собирают на своей поверхности длинные нитевидные ворсинки, через которые они прикрепляются к клеткам хозяина [4].

S-белок SARS-CoV-2 отвечает за присоединение вируса к рецептору ACE-2 клеток человека. Мы выбрали иммуногенную часть белка, которая расположена в непосредственной близости от ACE-2 связывающего домена (RBD). Данный фрагмент ДНК длиной 501 п. н., кодирующий эту область, был вставлен в геном пробиотика E. faecium L3. Проведенный нами анализ полученного рекомбинантного энтерококкового штамма с помощью ОТ–ПЦР–РВ и последующего секвенирования ДНК выявил наличие последовательности S-белка в геноме энтерококка.

Специфические антигены SARS-CoV-2 на поверхности L3-SARS определены электронной микроскопией, которая продемонстрировала правильную сборку химерных молекул пилей на поверхности бактерий. Протокол для пробоподготовки иммуноэлектронной микроскопии модифицирован с опорой на предыдущие исследования [5].

Выводы

Последовательность ДНК, клонированная в геном пробиотика E. faecium L3 в сочетании с геном белка пилей, направила синтез S-специфической мРНК на образование поверхностного белка, способного связываться с моноклональными антителами к эпитопам S-белка вируса SARS-CoV-2. С помощью электронной микроскопии продемонстрирована правильная сборка молекул пилей на поверхности модифицированных бактерий. Результаты исследования позволяют сделать вывод: выбранные фрагменты ДНК SARS-CoV-2 способны направлять синтез иммуногенного белка, который экспрессировался штаммом E. faecium L3.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Статья не имеет спонсорской поддержки.

Соблюдение этических норм. Выполнение исследования одобрено протоколом местного этического комитета по этике ФГБУ «ИЭМ» (протокол № 3/20 от 06 мая 2020 г.).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, связанного с подготовкой и публикации статьи.

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Наибольший вклад распределен следующим образом: А.Н. Иванова, М.Г. Воробьев — обучение пробоподготовке и работе с электронным микроскопом для иммуноэлектронной микроскопии; Т.В. Гупалова, Е.А. Бормотова — подготовка бактериальных культур; О.С. Коптева — пробоподготовка, иммуноэлектронная микроскопия, ОТ–ПЦР–РВ; Ю.А. Дешева, А.Н. Суворов, Г.Ф. Леонтьева — анализ полученных результатов; Ю.А. Дешева, А.Н. Суворов, Г.Ф. Леонтьева — концептуализация.

Additional information

Funding sources. The work was done without sponsorship.

Compliance with ethical standards. The study was approved by the protocol of the local Ethics Committee on ethics of FSBI “IEM” (Protocol No. 3/20 by May 06, 2020).

Competing interests. The authors declare the absence of obvious and potential conflicts of interest related to the publication of this article.

Authors̕ contribution. All authors made a significant contribution to the development of the concept and preparation of the article, read and approved the final version before publication. The largest contribution is distributed as follows: A.N. Ivanova, M.G. Vorobyev — training on sample preparation and on work with electron microscope for immunoelectronic microscopy; T.V. Gupalova, E.A. Bormotova — preparation of bacterial cultures; O.S. Kopteva — sample preparation, immunoelectronic microscopy, RT–PCR–RV; Yu.A. Desheva, A.N. Suvorov, G.F. Leontieva — analysis of the results obtained; Yu.A. Desheva, A.N. Suvorov, G.F. Leontieva — conceptualization.

Об авторах

Ольга Сергеевна Коптева

Институт экспериментальной медицины; Санкт-Петербургский государственный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: olga.s.kopteva@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2645-3433
SPIN-код: 7630-3067
Scopus Author ID: 57354051000

научный сотрудник Научного центра мирового уровня «Центр персонализированной медицины»; аспирант

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Юлия Андреевна Дешева

Институт экспериментальной медицины; Санкт-Петербургский государственный университет

Email: desheva@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9794-3520
SPIN-код: 4881-3786
Scopus Author ID: 9939567500
ResearcherId: I-1493-2013

д-р мед. наук, ведущий научный сотрудник Научного центра мирового уровня «Центр персонализированной медицины» и ведущий научный сотрудник отдела вирусологии; профессор кафедры фундаментальных проблем медицины и медицинских технологий факультета стоматологии и медицинских технологий

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Александра Николаевна Иванова

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: alexandra.ivanova@spbu.ru
SPIN-код: 4486-1658

канд. биол. наук, специалист по пробоподготовке к просвечивающей электронной микроскопии ресурсного центра «Развитие молекулярных и клеточных технологий»

Россия, Санкт-Петербург

Максим Германович Воробьёв

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: vorobiev.maxim@spbu.ru

специалист по просвечивающей и сканирующей электронной микроскопии ресурсного центра «Развитие молекулярных и клеточных технологий»

Россия, Санкт-Петербург

Галина Фёдоровна Леонтьева

Институт экспериментальной медицины

Email: galeonte@yandex.ru
SPIN-код: 5204-9252

канд. биол. наук, старший научный сотрудник Научного центра мирового уровня «Центр персонализированной медицины», старший научный сотрудник отдела молекулярной микробиологии

Россия, Санкт-Петербург

Татьяна Виталиевна Гупалова

Институт экспериментальной медицины

Email: tvgupalova@rambler.ru
SPIN-код: 1242-3540

д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник Научного центра мирового уровня «Центр персонализированной медицины» и ведущий научный сотрудник отдела молекулярной микробиологии

Россия, Санкт-Петербург

Елена Алексеевна Бормотова

Институт экспериментальной медицины

Email: bormotovae@rambler.ru
SPIN-код: 7962-0043

канд. биол. наук, научный сотрудник Научного центра мирового уровня «Центр персонализированной медицины» и научный сотрудник отдела молекулярной микробиологии

Россия, Санкт-Петербург

Александр Николаевич Суворов

Институт экспериментальной медицины; Санкт-Петербургский государственный университет

Email: suvorov.an@iemspb.ru
SPIN-код: 8062-5281

д-р мед. наук, профессор, чл.-корр. РАН, руководитель отдела микробной терапии Научного центра мирового уровня «Центр персонализированной медицины» и заведующий отделом молекулярной микробиологии; заведующий кафедрой фундаментальных проблем медицины и медицинских технологий факультета стоматологии и медицинских технологий

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы