Влияние длительного эмоционально-болевого стрессорного воздействия на экспрессию гена bdnf в мозге крыс с контрастной возбудимостью нервной системы

Полный текст

Обоснование

Нейротрофический фактор мозга (BDNF) — важный регулятор синаптической пластичности и долговременной потенциации в гиппокампе и в других областях мозга [1], выполняя ключевую роль в формировании памяти и регуляции ответов на действие неблагоприятных факторов, таких как психоэмоциональный [2] или провоспалительный [3] стресс. Роль BDNF в процессах нейропластичности лучше всего изучена в гиппокампе, где нейротрофин действует на пре- и постсинаптическом уровнях [1]. Многие исследования показывают снижение экспрессии BDNF и в других отделах мозга, вовлеченных в эмоциональную регуляцию (префронтальная кора, миндалина), в моделях постстрессорной патологии на животных, а также у пациентов, страдающих тревожными и депрессивными расстройствами [4].

Открытым остается вопрос о роли генетически детерминированных индивидуальных различий в формировании уязвимости к постстрессорным нейрохимическим нарушениям, в том числе к снижению уровня нейротрофического фактора. Уровень возбудимости — один из важных факторов риска развития постстрессорных расстройств. Предыдущие исследования показали, что линии крыс, селектированные по порогу возбудимости нервной системы, различаются своими поведенческими реакциями на длительное эмоционально-болевое стрессорное воздействие [5]. У животных с контрастной возбудимостью нервной системы выявлены также специфические молекулярно-клеточные и эпигенетические изменения в структурах мозга, вовлеченных в эмоциональный контроль и реакцию на стресс [6].

Цель работы — изучить уровень мРНК bdnf в префронтальной коре, гиппокампе и миндалине крыс с высоким порогом (ВП) и низким порогом (НП) возбудимости нервной системы в норме и в разные сроки после длительного эмоционально-болевого стрессорного воздействия.

Материалы и методы

Эксперименты проведены на самцах крыс двух линий в возрасте 5 мес., селектированных по величине порога возбудимости нервной системы, — линий ВП (низковозбудимые) и НП (высоковозбудимые) из Биоколлекции Института физиологии им. И.П. Павлова РАН (госзадание № 0134-2016-0002, патенты на селекционное достижение № 10769 и 10768, выданные Государственной комиссией РФ по испытанию и охране селекционных достижений, зарегистрировано в государственном реестре охраняемых селекционных достижений 15.01.2020). Животных содержали в стандартных условиях вивария лаборатории генетики высшей нервной деятельности Института физиологии со свободным доступом к воде и пище. При проведении экспериментов соблюдались требования, сформулированные в Директивах Совета Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) об использовании животных для экспериментальных исследований. Проведение исследования утверждено Комиссией по гуманному обращению с животными Института физиологии им. И.П. Павлова РАН.

Эксперименты выполнены на самцах крыс линии ВП (n = 48) и линии НП (n = 48). Крысы обеих линий были разделены на две подгруппы (в каждой 4 экспериментальные группы по 6 крыс): 1) подвергнутые длительному эмоционально-болевому стрессу; 2) нестрессированные (контрольные).

Длительное эмоционально-болевое стрессирование осуществляли ежедневно (по 13 мин) в течение 15 дней по стохастической схеме К. Гехта (Hecht et al., 1972, цит. по [5]). На решетчатый электрифицированный пол прозрачной камеры подавали 12 световых вспышек длительностью 10 с каждая, из них шесть неподкрепляемых и шесть подкрепляемых электрическим током (2,5 мА, 4 с). Межсигнальный интервал 1 мин. Согласно схеме, сочетания условных и безусловных стимулов не повторялись, а чередовались с вероятностью 0,5, что не позволяло выработать у животных условный рефлекс. Предыдущие исследования на используемых линиях показали, что данный протокол длительного эмоционально-болевого воздействия способствует возникновению у животных устойчивого патологического состояния — нарушений поведения, сохраняющихся до 6 мес. после стрессирования [5].

Через 24 ч, 7, 24 и 60 дней после окончания стрессирования животные экспериментальных и контрольных групп были декапитированы.

Немедленно после декапитации из мозга были извлечены префронтальная кора, гиппокамп и миндалина. Известно, что данные структуры мозга вовлечены в патогенез постстрессорных расстройств, в них продемонстрированы изменения экспрессии гена bdnf и на других моделях стресса [7, 8]. Выделение суммарной РНК из образцов мозга проводили по протоколу Evrogene ExtractRNA с использованием монофазного водного раствора фенола и гуанидин-изотиоцианата (Evrogene, BC032).

Концентрацию экстрагированной РНК для каждого образца измеряли методом спектрофотометрии (NanoDrop IMPLEN).

Обратную транскрипцию проводили с использованием олиго(dT)-праймера, и обратной транскриптазы вируса лейкемии мышей Молони (MMLV, Evrogenе).

Для определения уровня мРНК гена bdnf был использован метод количественной ПЦР. В качестве референсного гена использовали Gapdh.

Праймеры к участкам генов:

• bdnf прямой (5՛-CTGTCGCACGGTCCCCATT-3՛),
• обратный (5՛-TTCTCGTCTGCCCCAAAGCA-3՛),
• референс глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа (Gapdh),
• прямой (5՛-GTTTGTGATGGGTGTGAACC-3՛),
• обратный (5՛-TCTTCTGAGTGGCAGTGATG-3՛).

Для ртПЦР использовали амплификатор BioRad CFX96. В качестве флуоресцирующей метки использовали интеркалирующий агент SYBR Green 1, входящий в состав реакционной смеси qPCRmix-HS SYBR (Evrogene). Результаты ПЦР-анализа интерпретировали методом ∆∆Ct, основанным на оценке уровня экспрессии целевого гена по отношению к референсному [9].

Для проверки специфичности полученных продуктов амплификации производили анализ кривых плавления продуктов реакции.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Prism 9. Для оценки характера распределения использовали критерий Шапиро – Уилка, для оценки значимости различий в уровне мРНК контрольной и экспериментальных групп применяли непараметрический дисперсионный анализ Краскела – Уоллиса с post-hoc-тестом Манна – Уитни, множественность сравнений контролировали с применением поправки FDR (false discovery rate). Для оценки межлинейных различий уровня мРНК у интактных животных двух линий использовали критерий Манна – Уитни. Сравнение уровня мРНК в каждой структуре мозга каждой временной точки проводили по отношению к объединенному контролю, так как контрольные животные, декапитированные в разные сроки, не отличались по изучаемому параметру (тест Краскела – Уоллиса).

Результаты

Для выявления межлинейных различий была проведена сравнительная оценка уровня мРНК гена bdnf в префронтальной коре, гиппокампе и миндалине интактных крыс двух исследуемых линий.

Межлинейные различия в уровне экспрессии гена bdnf не обнаружены ни в одной из исследованных структур мозга (рис. 1).

 

Рис. 1. Уровень мРНК гена bdnf в префронтальной коре (a), гиппокампе (b) и миндалине (c) интактных крыс линий с высоким порогом (ВП) и низким порогом (НП) возбудимости. По вертикальной оси показано относительное значение изменения экспрессии (–ΔΔCt), графики представляют собой медианы, границы квартилей, а также максимальные и минимальные значения анализируемых данных

Fig. 1. The mRNA level of the bdnf gene in the prefrontal cortex (a), hippocampus (b) and amygdala (c) of intact rats of the high threshold (HT) and low threshold (LT) strains. The vertical axis shows the relative value of the expression change (–ΔΔCt), the graphs represent the medians, quartile boundaries, as well as the maximum and minimum of the analyzed data

 

В префронтальной коре выявили снижение уровня мРНК bdnf через 1 и 7 сут после стрессирования у высоковозбудимой линии НП, у низковозбудимой линии ВП статистически значимых различий уровня мРНК в экспериментальных группах на разных сроках после воздействия по сравнению с контролем выявлено не было (рис. 2).

 

Рис. 2. Уровень мРНК гена bdnf в префронтальной коре крыс линий с высоким порогом (a) и низким порогом (b) возбудимости в разные сроки после длительного эмоционально-болевого стрессорного воздействия. По вертикальной оси показано относительное значение изменения экспрессии (–ΔΔCt), графики представляют собой медианы, границы квартилей, а также максимальные и минимальные значения анализируемых данных. * p < 0,01 (критерий Краскела – Уоллиса, post-hoc-анализ Манна – Уитни, поправка FDR)

Fig. 2. The level of mRNA of the bdnf gene in the prefrontal cortex of rats of the high threshold (a) and low threshold (b) strains at different time points after prolonged emotional and painful stress exposure. The vertical axis shows the relative value of the expression change (–ΔΔCt), the graphs represent the medians, quartile boundaries, as well as the maximum and minimum of the analyzed data. * p < 0.01 (Kraskel–Wallis, Mann–Whitney post-hoc analysis, FDR correction)

 

В гиппокампе снижение уровня мРНК bdnf обнаружили у крыс линии НП через 60 дней после стрессирования. У животных линии ВП изменений экспрессии bdnf в гиппокампе не наблюдали (рис. 3).

 

Рис. 3. Уровень мРНК гена bdnf в гиппокампе крыс линий с высоким порогом (a) и низким порогом (b) возбудимости в разные сроки после длительного эмоционально-болевого стрессорного воздействия. По вертикальной оси показано относительное значение изменения экспрессии (–ΔΔCt), графики представляют собой медианы, границы квартилей, а также максимальные и минимальные значения анализируемых данных. * p < 0,01 (критерий Краскела – Уоллиса, post-hoc-анализ Манна – Уитни, поправка FDR)

Fig. 3. The level of mRNA of the bdnf gene in the hippocampus of rats of the high threshold (a) and low threshold (b) strains at different time points after prolonged emotional and painful stress exposure. The vertical axis shows the relative value of the expression change (–ΔΔCt), the graphs represent the medians, quartile boundaries, as well as the maximum and minimum of the analyzed data. * p < 0.01 (Kraskel–Wallis, Mann–Whitney post-hoc analysis, FDR correction)

 

В миндалине ни у одной из исследованных линий крыс не обнаружили влияния стрессирования на уровень мРНК bdnf (рис. 4).

 

Рис. 4. Уровень мРНК гена bdnf в миндалине крыс линий с высоким порогом (a) и низким порогом (b) возбудимости в разные сроки после длительного эмоционально-болевого стрессорного воздействия. По вертикальной оси показано относительное значение изменения экспрессии (–ΔΔCt), графики представляют собой медианы, границы квартилей, а также максимальные и минимальные значения анализируемых данных

Fig. 4. The level of mRNA of the bdnf gene in the amygdala of rats of the high threshold (a) and low threshold (b) strains at different time points after prolonged emotional and painful stress exposure. The vertical axis shows the relative value of the expression change (–ΔΔCt), the graphs represent the medians, quartile boundaries, as well as the maximum and minimum of the analyzed data

 

Обсуждение

Сравнительный анализ уровня мРНК bdnf в префронтальной коре, гиппокампе и миндалине интактных крыс двух линий ВП и НП указывает на отсутствие межлинейных различий в значениях этого показателя.

Результаты работы свидетельствуют о влиянии длительного эмоционально-болевого стрессорного воздействия на экспрессию гена bdnf в префронтальной коре и гиппокампе крыс линии НП. У крыс данной линии в префронтальной коре снижен уровень мРНК bdnf по сравнению с контролем через 1 и 7 сут, а в гиппокампе — только через 60 дней после стрессирования. У низковозбудимых животных линии ВП экспрессия гена bdnf в изученных структурах мозга в ответ на длительное эмоционально-болевое воздействие не снижалась ни в одной из временных точек после стрессирования.

Хорошо известно, что нейротрофический фактор мозга BDNF выполняет важную роль в синаптической пластичности, участвует в ответе организма на стресс и является патогенетическим фактором стресс-зависимых заболеваний [4, 7, 8].

Измененный уровень BDNF обнаружен у пациентов с психическими и неврологическими заболеваниями [10]. Тем не менее известно, что BDNF может повышать толерантность нервной системы к действию неблагоприятных факторов среды [7]. Эффект зависит от отдела мозга, типа клеток, характеристик стимула. При моделировании у крыс тревожно-подобных состояний иммунореактивность к BDNF в нейронах коры и гиппокампа значимо снижается [7]. В моделях данных патологий у животных наблюдали и снижение основных регуляторов экспрессии BDNF — транскрипционных факторов CREB и NF-êB [11].

Накоплено достаточное количество доказательств тому, что стресс приводит к снижению экспрессии BDNF не только на уровне белка, но и на уровне мРНК [12–14]. Хроническое воздействие глюкокортикоидов, обычно используемое в качестве редукционистской модели хронического стресса, также приводит к снижению экспрессии bdnf [15]. Это свидетельствует о том, что влияние стресса на экспрессию гена bdnf определяется специфическим контролем глюкокортикоидных гормонов. Таким образом, полученные нами данные о снижении уровня мРНК bdnf в ответ на длительное эмоционально-болевое стрессирование у уязвимых к действию стрессоров высоковозбудимых животных находятся в соответствии с ранними исследованиями, которые показали, что высоковозбудимые животные НП имеют повышенную по сравнению с альтернативной линией ВП стресс-реактивность гипофизарно-адренокортикальной системы, более быстрое развитие гормонального ответа на стрессор и сниженную чувствительность гипофизарно-адренокортикальной системы к сигналам обратной связи [16].

При оценке реакции на стресс важно учитывать региональную специфичность ответа. Так, известно, что хронический стресс оказывает противоположное влияние на синаптическую пластичность в гиппокампе и миндалине: в гиппокампе плотность дендритных шипиков и уровень нейротрофина снижаются, а в миндалине — возрастают [8].

В нашем исследовании стресс не повлиял на уровень мРНК bdnf в миндалине ни у одной из исследуемых линий крыс, а в гиппокампе снижение мРНК bdnf происходило только у высоковозбудимых крыс линии НП на отдаленном сроке — 60 дней после стрессирования. Возможно, выявленная специфичность связана с особенностями долгосрочных изменений эпигенетической регуляции, обнаруженных ранее в этих отделах мозга крыс при действии длительного эмоционально-болевого стрессорного воздействия [6].

Наши предыдущие исследования показали, что высоковозбудимые крысы линии НП более подвержены влиянию стресса и достаточно быстро формируют постстрессорные тревожноподобные поведенческие нарушения, сохраняющиеся длительное время и сопровождающиеся проявлением ряда признаков воспаления. У низковозбудимых животных ВП не отмечали каких-либо связанных со стрессом поведенческих изменений по сравнению с контролем в тестах «открытое поле» и «приподнятый крестообразный лабиринт» на протяжении 24 дней после стрессирования. У высоковозбудимых крыс линии НП уже через сутки после окончания стрессового воздействия исследовательское поведение было значимо снижено в обоих тестах, в частности, уменьшилось количество стоек без опоры в тесте «открытое поле», снизились время, проведенное в открытых рукавах приподнятого крестообразного лабиринта, и количество выходов в центр по сравнению с контролем [17].

Выводы

1. Не выявлено межлинейных различий в уровне мРНК bdnf в префронтальной коре, гиппокампе и миндалине интактных крыс с контрастной возбудимостью нервной системы.
2. Длительное эмоционально-болевое стрессорное воздействие приводит к снижению уровня мРНК bdnf в префронтальной коре и гиппокампе высоковозбудимых крыс линии НП и не оказывает влияния на изменение этого показателя ни в оной из исследованных структур мозга у низковозбудимых крыс линии ВП.

Таким образом, полученные нами результаты позволяют предположить, что генетически детерминированные особенности высоковозбудимых животных определяют ослабленные адаптационные возможности их нервной системы, а сниженный уровень мРНК нейротрофина BDNF в ответ на стресс можно рассматривать в качестве одного из маркеров подобного ослабления.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Статья не имела спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Выполнение исследования одобрено Комиссией по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных при Институте физиологии им. И.П. Павлова РАН, Заключение № 04/03 от 4 марта 2019 г.

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Наибольший вклад распределен следующим образом: И.Г. Шалагинова, Н.А. Дюжикова — идея работы и планирование эксперимента, написание и редактирование текста статьи; И.Г. Шалагинова, Т.Г. Зачепило — сбор биологических материалов, проведение эксперимента; И.Г. Шалагинова — обработка данных.

Additional information

Funding source. The article has no sponsorship.

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Ethical approval. The study was approved by the Commission on Control over the Maintenance and Use of Laboratory Animals at the I.P. Pavlov Institute of Physiology of the Russian Academy of Sciences, Conclusion No. 04/03 from March 4, 2019.

Authors̕ contribution. All authors made significant contributions to concept development, research and paper preparation, read and approved the final version before publication. The largest contribution is distributed as follows: I.G. Shalaginova, N.A. Dyuzhikova — the idea of the work and the planning of the experiment, writing and editing the text of the article; I.G. Shalaginova, T.G. Zachepilo — collection of biological materials, experiment; I.G. Shalaginova — data processing.

Список сокращений

ВП — высокий порог; НП — низкий порог; BDNF, brain-derived neurotrophic factor — нейротрофический фактор мозга.

Об авторах

Ирина Геннадьевна Шалагинова

Балтийский федеральный университет им. И. Канта

Автор, ответственный за переписку.
Email: shalaginova_i@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0140-3077
SPIN-код: 1160-1915
Scopus Author ID: 57202052229
ResearcherId: J-3626-2018

старший преподаватель Высшей школы живых систем

Россия, Калининград

Татьяна Геннадьевна Зачепило

Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН

Email: zachepilo_t@infran.ru
ORCID iD: 0000-0001-6350-7050
SPIN-код: 7746-2208
Scopus Author ID: 6506211770
ResearcherId: J-6935-2018

ведущий научный сотрудник, исполняющий обязанности заведующего лабораторией генетики высшей нервной деятельности

Россия, Санкт-Петербург

Наталья Алековна Дюжикова

Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН

Email: dyuzhikova@infran.ru
ORCID iD: 0000-0003-3617-5948
SPIN-код: 6206-3889
ResearcherId: AFO-9318-2022

исполняющая обязанности директора

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы