Отправить статью по E-mail 
Выявление иммунопозитивных бета-адренергических структур при помощи поликлональных антител к ADRB2 (GLN247-SER262) в легких крыс линии вистар
- Авторы: Сырцова М.А.1, Коржевский Д.Э.1
-
Учреждения:
- ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»
- Выпуск: Том 19, № 1 (2019)
- Страницы: 81-84
- Раздел: Оригинальные исследования
- URL: https://journals.eco-vector.com/MAJ/article/view/15193
- DOI: https://doi.org/10.17816/MAJ19181-84
- ID: 15193
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Цель исследования состояла в выявлении ADRB2-иммунопозитивных структур в легких крыс в норме.
Материал и методы. Материалом для исследования служили легкие половозрелых крыс-самцов (n = 6) с верифицированным отсутствием признаков воспаления. Материал фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде по стандартной методике. Выявление ADRB2-иммунопозитивных структур проводили с помощью метода иммуногистохимии.
Результаты. В ходе работы было выявлено интенсивное и селективное окрашивание апикальной части воздухоносного эпителия бронхов, отражающее преимущественное распределение ADRB2-иммунопозитивных структур в крупных и средних бронхах и частично в терминальных бронхиолах внутрилегочных воздухоносных путей. ADRB2-иммунопозитивные структуры характеризовались четкими границами, со слегка расплывчатым ореолом, имели округлую или сильно вытянутую овальную форму. Размер структур варьировал в зависимости от калибра бронха, в котором они были локализованы.
Заключение. В результате исследования были обнаружены специфические ADRB2-иммунопозитивные структуры, локализованные в эпителии дыхательных путей. Было показано, что ADRB2-иммунопозитивные структуры в легком крысы располагаются в крупных и средних бронхах, кроме того, в части случаев позитивную реакцию наблюдали и в терминальных бронхиолах. Была выявлена специфичная реакция эпителия бронхов, которая во всех случаях наблюдалась в апикальной части эпителия бронхов. Кроме того, было продемонстрировано, что использованные в нашем исследовании поликлональные антитела селективно выявляют ADRB2-иммунопозитивные структуры только в эпителии бронхов, не вступая в иммуногистохимическое взаимодействие с бета-2-адренорецепторами гладких мышц, что, видимо, обусловлено более высокой концентрацией иммунореактивного продукта в эпителиальных клетках в сравнении с гладкомышечными.
Ключевые слова
Полный текст
Введение
Бета-2-адренорецепторы (ADRB2) относятся к большому семейству трансмембранных рецепторов, сопряженных с G-белком, так называемых семиспиральных рецепторных структур (GPCRs). GPCRs выполняют функцию активаторов внутриклеточных путей передачи сигнала, которые в итоге вызывают клеточный ответ. Нарушение работы GPCRs приводит к возникновению множества различных патологических состояний, кроме того, данные структуры являются мишенью для большинства современных лекарственных препаратов. ADRB2 в основном представлены внесинаптическими рецепторами, а также имеются на пресинаптической мембране постганглионарных нейронов симпатического отдела нервной системы. Считается, что они локализованы на мембранах гладкомышечных клеток, главным образом в мышцах бронхиол и артериях скелетных мышц. Данные рецепторы (наряду с адренергическими рецепторами других типов) присутствуют в том числе и на клетках печени, скелетных мышц, слюнных желез, в жировой ткани, на мембранах лимфоцитов, тромбоцитов и тучных клеток и на клетках других тканей [1]. При этом выполняемые ими функции обусловлены их локализацией в определенной структуре организма.
Предполагают, что дисфункция бета-2-адренорецепторов является одним из триггеров, запускающих воспалительный процесс в легких, что обусловливает изменение уровня экспрессии данного рецептора в бронхах [2]. Результаты ряда экспериментальных исследований свидетельствуют об изменении уровня экспрессии ADRB2 в легких при развитии бронхиальной астмы (БА), ремиссии данного обструктивного заболевания [2] и на фоне длительной терапии агонистами бета-адренорецепторов [3–5]. Кроме того, мутации в гене ADRB2 могут детерминировать развитие терапевтической резистентности при лечении БА [6].
При моделировании БА часто используют крыс линии Вистар [7] и овальбуминовую модель БА, однако данные о распределении бета-2-адренорецепторов у этих животных фрагментарны. Исследования затруднены отсутствием надежных видоспецифичных антител к данным рецепторам.
В связи с этим целью данной работы стало выявление ADRB2-иммунопозитивных структур у крыс линии Вистар при помощи новых поликлональных антител к ADRB2 (Gln247-Ser262), специфичных в отношении Rattus norvegicus.
Материалы и методы
Материалом для исследования служили легкие половозрелых крыс-самцов (n = 6). Материал фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде, который обеспечивает высокую сохранность антигенных детерминант при проведении иммуногистохимической реакции и залит в парафин по общепринятой методике. Для общей характеристики легочных структур применяли классический гистологический метод окраски гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое выявление ADRB2-специфических структур проводили с помощью кроличьих поликлональных антител ADRB2 (Cloud-Clone Corp., США) в разведении 1 : 100 (иммуногеном является синтетический пептид, ADRb2 (Gln247-Ser262), конъюгированный с овальбумином). В качестве вторичных реагентов использовали Reveal-HR Conjugate (Spring BioScience, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Для визуализации продукта иммуноцитохимической реакции применяли хромоген DAB+ (Dako, Дания). После проведения иммуноцитохимической реакции часть срезов окрашивали квасцовым гематоксилином и заключали в перманентную среду Cytoseal 60 (Richard-Allan Scientific, США). Полученные препараты исследовали с помощью микроскопа Leica DM750 (Leica, Германия), фотосъемку выполняли с помощью фотокамеры ICC50 (Leica, Германия).
Результаты и их обсуждение
При анализе препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином, в легких не были обнаружены признаки патологии и воспаления. При иммуногистохимическом выявлении антителами к ADRB2 (Gln247-Ser262), специфичных в отношении Rattus norvegicus, было отмечено, что в легких ADRB2-иммунопозитивные структуры главным образом локализуются в крупных, средних и малых бронхах и частично в терминальных бронхиолах внутрилегочных воздухоносных путей (рис. 1, a, b). Основное место локализации — апикальная часть реснитчатого эпителия бронхов. Продольная исчерченность выявляемых структур, наблюдаемая при большом увеличении (см. рис. 1, a), позволяет предположить, что положительная реакция связана с зоной локализации ресничек.
Рис. 1. ADRB2-иммунопозитивные структуры в среднем бронхе. Иммуногистохимическая реакция на ADRB2 с подкраской ядер квасцовым гематоксилином (линейный отрезок равен 0,02 мм) (a); ADRB2-иммунопозитивные структуры в малом бронхе. Иммуногистохимическая реакция на ADRB2 с подкраской ядер квасцовым гематоксилином (линейный отрезок равен 0,05 мм) (b)
Fig. 1. ADRB2-immunopositive structures in the middle bronchus. Immunohistochemical reaction to ADRB2 (hematoxylin staining), scale bar 0.02 mm (a); ADRB2-immunopositive structures in the small bronchus. Immunohistochemical reaction to ADRB2 (hematoxylin staining), scale bar 0.05 mm (b)
ADRB2-иммунопозитивные структуры характеризовались четкими границами, со слегка расплывчатым ореолом, имели округлую или сильно вытянутую овальную форму. Во всех представленных образцах (препаратов легких) данные структуры выявлялись селективно. Размер структур варьировал в зависимости от калибра бронха, в котором они были локализованы.
Особый интерес к исследованию адренергической регуляции бронхов вызван их ролью в патогенезе БА [8]. На сегодняшний день известно, что главным фактором, способствующим развитию данной обструктивной патологии легких, является повышенная реактивность бронхиального дерева [9, 10]. Она обусловлена нарушением вегетативной регуляции тонуса гладких мышц и действием медиаторов воспаления и приводит к периодической обратимой обструкции бронхов. Изменение экспрессии и активности бета-2-адренорецепторов, в свою очередь, влияет на развитие этого процесса [11]. При этом морфологических исследований, посвященных изучению распределения ADRB2 в легких животных и человека, выполнено мало, объем их недостаточен. В рамках представленной работы было показано, что ADRB2-иммунопозитивные структуры, обнаруживаемые при помощи антител к ADRB2 (Gln247-Ser262), специфичных в отношении крысы, локализованы в апикальной части реснитчатого эпителия крупных, средних и малых бронхов и терминальных бронхиолах легких в апикальной части бронхиального эпителия. Структуризация иммуногистохимической реакции и ее расположение по отношению к эпителиальному пласту дают возможность предположить, что выявляется зона расположения ресничек в клетках мерцательного эпителия. Это противоречит существующим представлениям о типичной локализации адренорецепторов. Так, согласно подавляющему большинству литературных данных бета-2-адренорецепторы в легком в основном находятся в гладкой мускулатуре бронхов и частично на мембране тучных клеток. В то же время можно найти работы, в которых данный вид адренергических рецепторов обнаруживали на поверхности альвеолярного эпителия [12]. Кроме того, в своей последней работе Nguyen et al. показали, что ADRB2-иммунопозитивные структуры представлены в эпителии воздухоносных путей и количество данных рецепторов сопоставимо с количеством экспрессируемых рецепторов в гладкой мускулатуре бронхов [4]. В нашем исследовании продукт иммуногистохимической реакции селективно выявлялся в эпителии бронхов, что отчасти подтверждает полученные ранее результаты, но в отличие от других работ мы не обнаружили иммунореактивности в мышечной пластинке слизистой оболочки бронхов.
Возможно, выявленная специфическая реакция именно в воздухоносном эпителии бронхов обусловлена существованием нескольких изоформ данного рецептора, среди которых только одна обнаруживается при помощи исходных антител. Можно также предположить, что причина отсутствия четкой реакции в мышечной пластинке слизистой оболочки бронхов заключается в более низкой концентрации выявляемого антигена по сравнению с эпителием.
Заключение
Таким образом, в настоящей работе впервые были выявлены специфические ADRB2-иммунопозитивные структуры, локализованные в поверхностной области эпителия дыхательных путей крысы. Было показано, что ADRB2-иммунопозитивные структуры в легком крысы, реагирующие с вышеупомянутыми антителами, преимущественно локализуются в крупных, средних и малых бронхах. Иммуногистохимическая реакция с использованием данных антител характеризовалась высокой специфичностью и отсутствием фона.
Список сокращений
БА — бронхиальная астма; ADRB2 — бета-2-адренорецепторы; GPCRs — G-белок-сопряженный рецептор.
Об авторах
Марина Александровна Сырцова
ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»
Автор, ответственный за переписку.
Email: iemmorphol@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-6974-4062
SPIN-код: 7826-8133
научный сотрудник, лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы отдела общей и частной морфологии
Россия, Санкт-ПетербургДмитрий Эдуардович Коржевский
ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»
Email: iemmorphol@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2456-8165
SPIN-код: 3252-3029
д-р мед наук, лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы отдела общей и частной морфологии
Россия, Санкт-ПетербургСписок литературы
- Nasser Y, Ho W, Sharkey KA. Distribution of adrenergic receptors in the enteric nervous system of the guinea pig, mouse, and rat. J Comp Neurol. 2006;495(5):529-553. https://doi.org/10.1002/cne.20898.
- Amrani Y, Bradding P. Beta2-adrenoceptor function in asthma. Adv Immunol. 2017;136:1-28. https://doi.org/10.1016/bs.ai.2017.06.003.
- Chowdhury BA, Dal Pan G. The FDA and safe use of long-acting beta-agonists in the treatment of asthma. N Engl J Med. 2010;362(13):1169-1171. https://doi.org/10.1056/NEJMp1002074.
- Nguyen LP, Al-Sawalha NA, Parra S, et al. beta2-Adrenoceptor signaling in airway epithelial cells promotes eosinophilic inflammation, mucous metaplasia, and airway contractility. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017;114(43):E9163-E9171. https://doi.org/10.1073/pnas.1710196114.
- Nguyen LP, Lin R, Parra S, et al. Beta2-adrenoceptor signaling is required for the development of an asthma phenotype in a murine model. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106(7):2435-2440. https://doi.org/10.1073/pnas.0810902106.
- Трофимов В.И., Миронова Ж.А., Дубина М.В. Генетический профиль терапевтически резистентной бронхиальной астмы // Медицинский академический журнал. – 2013. – Т. 13. – № 2. – С. 44–50. [Trofimov VI, Mironova ZA, Dubina MV. Genetic profile of therapy-resistant asthma. Med Acad J. 2013;13(2);44-45. (In Russ.)]
- Ворончихин П.А., Сырцова М.А., Талантов С.В., и др. Влияние метопролола и бисопролола на течение экспериментальной бронхиальной астмы // Биомедицина. – 2013. – № 2. – С. 42–51. [Voronchikhin PA, Syrtsova MA, Talantov SV, et al. Effect of metoprolol and bisoprolol on the course of experimental bronchial asthma. Biomeditsina. 2013;(2):42-51. (In Russ.)]
- Lelliott A, Nikkar-Esfahani A, Offer J, et al. The role of extracellular-signal regulate kinase (ERK) in the regulation of airway tone in porcine isolated peripheral bronchioles. Eur J Pharmacol. 2012;674(2-3):407-414. https://doi.org/10.1016/j.ejphar.2011.10.042.
- Grayson MH, Feldman S, Prince BT, et al. Advances in asthma in 2017: Mechanisms, biologics, and genetics. J Allergy Clin Immunol. 2018;142(5):1423-1436. https://doi.org/10.1016/j.jaci.2018.08.033.
- Yarova PL, Stewart AL, Sathish V, et al. Calcium-sensing receptor antagonists abrogate airway hyperresponsiveness and inflammation in allergic asthma. Sci Transl Med. 2015;7(284):284ra260. https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aaa0282.
- Thanawala VJ, Forkuo GS, Al-Sawalha N, et al. beta2-Adrenoceptor agonists are required for development of the asthma phenotype in a murine model. Am J Respir Cell Mol Biol. 2013;48(2):220-229. https://doi.org/10.1165/rcmb.2012-0364OC.
- Koryakina YA, Fowler TW, Jones SM, et al. Characterization of a panel of six beta2-adrenergic receptor antibodies by indirect immunofluorescence microscopy. Respir Res. 2008;9:32. https://doi.org/10.1186/1465-9921-9-32.
Дополнительные файлы
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).