Revealing of immunopositive beta-adrenergic structures, using polyclonal antibodies to ADRB2 (GLN247-SER262) in the lungs of rats

Full Text

Введение

Бета-2-адренорецепторы (ADRB2) относятся к большому семейству трансмембранных рецепторов, сопряженных с G-белком, так называемых семиспиральных рецепторных структур (GPCRs). GPCRs выполняют функцию активаторов внутриклеточных путей передачи сигнала, которые в итоге вызывают клеточный ответ. Нарушение работы GPCRs приводит к возникновению множества различных патологических состояний, кроме того, данные структуры являются мишенью для большинства современных лекарственных препаратов. ADRB2 в основном представлены внесинаптическими рецепторами, а также имеются на пресинаптической мембране постганглионарных нейронов симпатического отдела нервной системы. Считается, что они локализованы на мембранах гладкомышечных клеток, главным образом в мышцах бронхиол и артериях скелетных мышц. Данные рецепторы (наряду с адренергическими рецепторами других типов) присутствуют в том числе и на клетках печени, скелетных мышц, слюнных желез, в жировой ткани, на мембранах лимфоцитов, тромбоцитов и тучных клеток и на клетках других тканей [1]. При этом выполняемые ими функции обусловлены их локализацией в определенной структуре организма.

Предполагают, что дисфункция бета-2-адренорецепторов является одним из триггеров, запускающих воспалительный процесс в легких, что обусловливает изменение уровня экспрессии данного рецептора в бронхах [2]. Результаты ряда экспериментальных исследований свидетельствуют об изменении уровня экспрессии ADRB2 в легких при развитии бронхиальной астмы (БА), ремиссии данного обструктивного заболевания [2] и на фоне длительной терапии агонистами бета-адренорецепторов [3–5]. Кроме того, мутации в гене ADRB2 могут детерминировать развитие терапевтической резистентности при лечении БА [6].

При моделировании БА часто используют крыс линии Вистар [7] и овальбуминовую модель БА, однако данные о распределении бета-2-адренорецепторов у этих животных фрагментарны. Исследования затруднены отсутствием надежных видоспецифичных антител к данным рецепторам.

В связи с этим целью данной работы стало выявление ADRB2-иммунопозитивных структур у крыс линии Вистар при помощи новых поликлональных антител к ADRB2 (Gln247-Ser262), специфичных в отношении Rattus norvegicus.

Материалы и методы

Материалом для исследования служили легкие половозрелых крыс-самцов (n = 6). Материал фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде, который обеспечивает высокую сохранность антигенных детерминант при проведении иммуногистохимической реакции и залит в парафин по общепринятой методике. Для общей характеристики легочных структур применяли классический гистологический метод окраски гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое выявление ADRB2-специфических структур проводили с помощью кроличьих поликлональных антител ADRB2 (Cloud-Clone Corp., США) в разведении 1 : 100 (иммуногеном является синтетический пептид, ADRb2 (Gln247-Ser262), конъюгированный с овальбумином). В качестве вторичных реагентов использовали Reveal-HR Conjugate (Spring BioScience, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Для визуализации продукта иммуноцитохимической реакции применяли хромоген DAB+ (Dako, Дания). После проведения иммуноцитохимической реакции часть срезов окрашивали квасцовым гематоксилином и заключали в перманентную среду Cytoseal 60 (Richard-Allan Scientific, США). Полученные препараты исследовали с помощью микроскопа Leica DM750 (Leica, Германия), фотосъемку выполняли с помощью фотокамеры ICC50 (Leica, Германия).

Результаты и их обсуждение

При анализе препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином, в легких не были обнаружены признаки патологии и воспаления. При иммуногистохимическом выявлении антителами к ADRB2 (Gln247-Ser262), специфичных в отношении Rattus norvegicus, было отмечено, что в легких ADRB2-иммунопозитивные структуры главным образом локализуются в крупных, средних и малых бронхах и частично в терминальных бронхиолах внутрилегочных воздухоносных путей (рис. 1, a, b). Основное место локализации — апикальная часть реснитчатого эпителия бронхов. Продольная исчерченность выявляемых структур, наблюдаемая при большом увеличении (см. рис. 1, a), позволяет предположить, что положительная реакция связана с зоной локализации ресничек.

 

Рис. 1. ADRB2-иммунопозитивные структуры в среднем бронхе. Иммуногистохимическая реакция на ADRB2 с подкраской ядер квасцовым гематоксилином (линейный отрезок равен 0,02 мм) (a); ADRB2-иммунопозитивные структуры в малом бронхе. Иммуногистохимическая реакция на ADRB2 с подкраской ядер квасцовым гематоксилином (линейный отрезок равен 0,05 мм) (b)

Fig. 1. ADRB2-immunopositive structures in the middle bronchus. Immunohistochemical reaction to ADRB2 (hematoxylin staining), scale bar 0.02 mm (a); ADRB2-immunopositive structures in the small bronchus. Immunohistochemical reaction to ADRB2 (hematoxylin staining), scale bar 0.05 mm (b)

 

ADRB2-иммунопозитивные структуры характеризовались четкими границами, со слегка расплывчатым ореолом, имели округлую или сильно вытянутую овальную форму. Во всех представленных образцах (препаратов легких) данные структуры выявлялись селективно. Размер структур варьировал в зависимости от калибра бронха, в котором они были локализованы.

Особый интерес к исследованию адренергической регуляции бронхов вызван их ролью в патогенезе БА [8]. На сегодняшний день известно, что главным фактором, способствующим развитию данной обструктивной патологии легких, является повышенная реактивность бронхиального дерева [9, 10]. Она обусловлена нарушением вегетативной регуляции тонуса гладких мышц и действием медиаторов воспаления и приводит к периодической обратимой обструкции бронхов. Изменение экспрессии и активности бета-2-адренорецепторов, в свою очередь, влияет на развитие этого процесса [11]. При этом морфологических исследований, посвященных изучению распределения ADRB2 в легких животных и человека, выполнено мало, объем их недостаточен. В рамках представленной работы было показано, что ADRB2-иммунопозитивные структуры, обнаруживаемые при помощи антител к ADRB2 (Gln247-Ser262), специфичных в отношении крысы, локализованы в апикальной части реснитчатого эпителия крупных, средних и малых бронхов и терминальных бронхиолах легких в апикальной части бронхиального эпителия. Структуризация иммуногистохимической реакции и ее расположение по отношению к эпителиальному пласту дают возможность предположить, что выявляется зона расположения ресничек в клетках мерцательного эпителия. Это противоречит существующим представлениям о типичной локализации адренорецепторов. Так, согласно подавляющему большинству литературных данных бета-2-адренорецепторы в легком в основном находятся в гладкой мускулатуре бронхов и частично на мембране тучных клеток. В то же время можно найти работы, в которых данный вид адренергических рецепторов обнаруживали на поверхности альвеолярного эпителия [12]. Кроме того, в своей последней работе Nguyen et al. показали, что ADRB2-иммунопозитивные структуры представлены в эпителии воздухоносных путей и количество данных рецепторов сопоставимо с количеством экспрессируемых рецепторов в гладкой мускулатуре бронхов [4]. В нашем исследовании продукт иммуногистохимической реакции селективно выявлялся в эпителии бронхов, что отчасти подтверждает полученные ранее результаты, но в отличие от других работ мы не обнаружили иммунореактивности в мышечной пластинке слизистой оболочки бронхов.

Возможно, выявленная специфическая реакция именно в воздухоносном эпителии бронхов обусловлена существованием нескольких изоформ данного рецептора, среди которых только одна обнаруживается при помощи исходных антител. Можно также предположить, что причина отсутствия четкой реакции в мышечной пластинке слизистой оболочки бронхов заключается в более низкой концентрации выявляемого антигена по сравнению с эпителием.

Заключение

Таким образом, в настоящей работе впервые были выявлены специфические ADRB2-иммунопозитивные структуры, локализованные в поверхностной области эпителия дыхательных путей крысы. Было показано, что ADRB2-иммунопозитивные структуры в легком крысы, реагирующие с вышеупомянутыми антителами, преимущественно локализуются в крупных, средних и малых бронхах. Иммуногистохимическая реакция с использованием данных антител характеризовалась высокой специфичностью и отсутствием фона.

Список сокращений

БА — бронхиальная астма; ADRB2 — бета-2-адренорецепторы; GPCRs — G-белок-сопряженный рецептор.

About the authors

Marina A. Syrczova

Institute of Experimental Medicine

Author for correspondence.
Email: iemmorphol@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-6974-4062
SPIN-code: 7826-8133

research scientist, Laboratory of Functional Morphology of Central and Peripheral Nervous System, Morphology Department

Russian Federation, Saint Petersburg

Dmitriy E. Korzhevskii

Institute of Experimental Medicine

Email: iemmorphol@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2456-8165
SPIN-code: 3252-3029

Doctor of Medical Sciences, Laboratory of Functional Morphology of Central and Peripheral Nervous System, Morphology Department

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files