Влияние хронического эмоционально-физического стресса на показатели нейроэндокринной и иммунной систем

Полный текст

Введение

Стресс является одним из наиболее распространенных дестабилизирующих воздействий, сопровождающих организм на протяжении всей жизни. Физиологическая направленность стресса заключается в усилении адаптивных реакций организма, обеспечивающих поддержание его гомеостаза и сохранение здоровья, отсюда и еще одно название стресс-реакции — общий адаптационный синдром.

В ситуациях, когда стрессирующее воздействие продолжается длительное время и организм исчерпывает все свои адаптивные резервы, наступает «стадия истощения», на которой наблюдается угнетение активности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой и симпатоадреналовой систем, что приводит к подавлению многих защитно-приспособительных реакций организма [1].

Исследования, направленные на изучение изменений в иммунной системе под воздействием стресса, традиционно фокусируются на взаимодействии между центральной нервной, эндокринной и иммунной системами. Регуляция иммунного ответа ЦНС опосредована сетью сложных сигналов, которые функционируют двунаправленно.

К настоящему времени накоплено множество данных о влиянии стресса на продукцию цитокинов в организме. Например, было показано, что при стрессе повышается продукция провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-1 (IL-1), фактор некроза опухолей-α (TNF-α), интерферон-γ (IFN-γ), интерлекин-6 (IL-6) [2]. В то же время существуют данные, что такие провоспалительные цитокины, как IL-1β, IL-6, TNF-α, могут являться активаторами функций гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (ГГНС) [3].

С другой стороны, одна из классических реакцией организма на стресс — выброс глюкокортикоидных гормонов, к физиологическим эффектам которых относят мобилизацию энергетических ресурсов организма путем усиления гликонеогенеза, увеличения сердечно-сосудистого тонуса, противовоспалительное действие, сдерживание долгосрочных реакций, протекание которых не является необходимым во время преодоления кризиса (питание, пищеварение, рост и размножение). При этом важно, что с точки зрения взаимодействия нервной и иммунной систем глюкокортикоиды рассматриваются как основные эффекторные молекулы ГГНС, регулирующие иммунный ответ при стрессе [4].

Традиционно считается, что ГК оказывают в основном иммуносупрессирующее действие, угнетая по принципу отрицательной обратной связи продукцию многих цитокинов и медиаторов воспаления, таких как IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-α, IFN-γ, и стимулируя продукцию противовоспалительных цитокинов, таких как IL-4, IL-10 и IL-13 [5]. Запускаемый комплекс реакций в целом ингибирует продукцию провоспалительных цитокинов и ограничивает степень воспаления [6]. Иммуномодулирующий эффект гормонов может реализовываться не только прямым путем, через связывание гормона со своим рецептором, но и опосредованно, например, вызывая нарушения в регуляции продукции цитокинов [7].

Одной из традиционно оцениваемых характеристик стресс-индуцированных изменений активности нервной системы является перестройка паттернов поведения индивида. Среди возможных причин этих изменений выделяют и нарушение регуляторных сигналов иммунной системы [8].

В целом чрезмерные и длительные стрессорные воздействия, сопровождающиеся, в частности, гиперпродукцией глюкокортикоидных гормонов, а также дерегуляцией продукции цитокинов, вызывают различные метаболические нарушения, чрезмерно подавляют иммунную систему, что в комплексе приводит к развитию различных форм патологии как инфекционной, метаболической, так и психоэмоциональной природы [9]. По этой причине исследования в области нейро-эндокринно-иммунных взаимодействий при стрессе представляют собой важную медико-биологическую задачу.

Для этих целей в настоящий момент разработано большое количество экспериментальных моделей. В то время как модели острого стресса отличаются кратковременностью, высокой степенью воспроизводимости, а также низкой трудозатратностью при исполнении, модели хронического стресса зачастую связаны с многоэтапными, трудновоспроизводимыми, комбинированными, длительными воздействиями, поэтому, ввиду актуальности исследования механизмов реализации патогенеза стресса, развития стресс-опосредованных форм патологии, а также исследований в области изучения нейроиммунных взаимодействий, разработка новых адекватных методологий хронического стресса является важной задачей.

Материалы и методы

Работа выполнена на взрослых крысах-самцах породы Wistar массой 290–310 г. Животных содержали в виварии в стандартных условиях (согласно стандартам содержания лабораторных животных), со свободным доступом к пище и воде и с 12-часовым световым циклом.

В качестве модели хронического стресса использовали модель плавания в холодной воде. В течение 10 дней, без перерывов, животных помещали в бассейн с водой температурой 0–4 °C на 2 минуты. Время подбирали исходя из активности плавания животных в бассейне. Процедуру повторяли каждый день в одно и то же время для того, чтобы исключить влияние циркадных ритмов на иммунную систему, поведение и гормональный фон экспериментальных животных. В качестве контрольных животных брали крыс, не подвергавшихся никаким воздействиям.

После плавания животных высушивали и помещали в домашние клетки на сухие опилки. После окончания десятидневной процедуры стрессирования, на 11-й день, животных выводили из эксперимента декапитацией, извлекали и взвешивали тимус, извлекали гипоталамус, а также собирали сыворотку крови для анализа концентрации кортикостерона. Концентрацию гормона анализировали методом иммуноферментного анализа, набор для которого был предоставлен фирмой DRG Diagnostics.

Из тимусов и гипоталамусов выделяли РНК (Gene Elute Mammalian total RNA mini prepаration kit, Sigma-Aldrich), методом обратной транскрипции синтезировали кДНК (BioRad, iScript cDNA Synthesis Kit) и методом ПЦР в реальном времени определяли относительную степень экспрессии генов IL-4 и IL-6 при помощи готовой смеси реактивов Thermo Scientific Maxima SYBR Green qPCR Master mix (2X). Степень экспрессии генов оценивали относительно степени экспрессии гена домашнего хозяйства глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы. Синтез праймеров осуществляла фирма Beagle (Санкт-Петербург):

• IL-4 прямая последовательность 5’-CGGTGAACTGAGGAAACTCTGTAGA-3’;
• IL-4 обратная последовательность 5’-TCAGTGTTGTGTGAGCGTGGACTC-3’;
• IL-6 прямая последовательность 5’-TCAACTCCATCTGCCCTTCAG-3’;
• IL-6 обратная последовательность 5’-AAGGCAACTGGCTGGAAGTCT-3’;
• GAPDH прямая последовательность 5’-CCTGCACCACCAACTGCTTAGC-3’;
• GAPDH обратная последовательность 5’-GCCAGTGAGCTTCCCGTTCAGC-3’.

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ Statistica 10.0 по U-критерию Манна – Уитни.

Для анализа развития депрессивного и подавленного состояния использовали поведенческий тест «открытое поле». Для этого животное помещали в центр ярко освещенной круглой арены, разделенной на секторы, с норками, расположенными по всей площади арены. Поведение регистрировали в течение 5 минут и анализировали в полуавтоматическом режиме по видеозаписи при помощи компьютерного обеспечения VideoMot 2.0 (TSE Systems, Германия).

Результаты и обсуждение

Глюкокортикоидные гормоны, как известно, одни из первых реагируют на стрессорное воздействие резким увеличением концентрации. Этот механизм направлен на мобилизацию всех систем организма с целью наиболее оперативного избегания стрессогенной ситуации. Особенно сильно концентрация глюкокортикоидных гормонов возрастает в период острого стресса. Однако длительная гиперстимуляция системы глюкокортикоидных гормонов может приводить к торможению других систем организма, например иммунной. Так, измененный профиль глюкокортикоидов может влиять на нарушение метаболических процессов, изменение адекватного поведения «избегания», способствовать развитию депрессии [10].

Таким образом, уровень глюкокортикоидных гормонов (а в случае исследований на крысах — кортикостерон) является важным показателем, характеризующим развитие стрессорной реакции, а также патологических процессов в организме в целом.

В ходе эксперимента на 11-й день после окончания процедуры стрессирования было получено многократное увеличение концентрации кортикостерона в крови экспериментальных животных (рис. 1). Поскольку в день забора материала стрессорные воздействия уже не предъявлялись, из представленных данных можно заключить, что использованная модель хронического стресса приводит к продолжительной гиперстимуляции системы ГГНС.

 

Рис. 1. Концентрация кортикостерона (нмоль/л) в сыворотке крови экспериментальных животных, не подвергавшихся стрессорному воздействию, а также после аппликации хронического стресса. * р < 0,05 по сравнению с интактными животными

Fig. 1. The concentration of corticosterone (nmol/L) in the serum of experimental animals not exposed to stress, as well as after the application of chronic stress. * p < 0.05 in compare with intact animals

 

Несмотря на непродолжительность стрессорного воздействия по сравнению с большинством методик, которые предусматривают целый комплекс воздействий, предъявляемых значительно более длительный период времени, были получены достоверные изменения массы тимуса (рис. 2). Тимус представляет собой один из центральных органов иммунной системы, в котором происходят дифференцировка и клонирование иммунокомпетентных клеток. С возрастом этот орган подвергается естественной инволюции, с чем напрямую связывают снижение активности иммунной системы. Как известно, изменение массы тимуса является одним из основных и базовых параметров для оценки тяжести хронического стресса [11].

 

Рис. 2. Масса тимуса животных после применения модели хронического стресса. * р < 0,05 по сравнению с интактными животными

Fig. 2. The mass of the thymus of animals after applying the model of chronic stress. * p < 0.05 in compar with intact animals

 

Одно из важных проявлений последствий стрессорного воздействия — эмоциональные и поведенческие изменения. Их анализ служит диагностическим и прогностическим критерием развития патологических процессов, поэтому необходим для характеристики разработанной модели.

Для экспериментальных животных, подвергшихся воздействию хронического стресса, было выявлено увеличение количества событий груминга, а также значительное увеличение его продолжительности. Было также показано значительное снижение количества заглядываний в норки. Это свидетельствует о развитии у экспериментальных животных подавленного, тревожного состояния и снижении исследовательской и познавательной активности (табл. 1).

 

Таблица 1 / Table 1

Эмоциональное и исследовательское поведение животных, подвергавшихся экспериментальному хроническому стрессу

Emotional and exploratory behavior of animals under experimental chronic stress

Группа животных	Груминг, кол-во событий	Продолжительность груминга, с	Норки, кол-во событий заглядывания
Контрольные	7 ± 0,7	27 ± 8	8,3 ± 3,2
Стресс	11,2 ± 1,2*	85 ± 27*	3 ± 1,4*

Примечание. * p < 0,05 по сравнению с показателем у контрольной группы животных.

Note. * p < 0.05 in compare with the control group of animals.

 

У группы животных после экспериментального хронического стресса сокращалась общая дистанция пробега, что также может свидетельствовать о снижении исследовательской активности и развитии подавленного состояния. Стоит отметить, что модель экспериментального хронического стресса не имела достоверного влияния на скорость передвижения (табл. 2).

 

Таблица 2 / Table 2

Двигательная активность животных, подвергавшихся экспериментальному хроническому стрессу

Movement of animals under experimental chronic stress

Группа животных	Длина пробега, м	Скорость пробега, см/с
Контрольные	18,8 ± 1,6	5,5 ± 2,3
Стресс	14,6 ± 0,9*	4,9 ± 1,9

Примечание. * p < 0,05 по сравнению с показателем у контрольной группы животных.

Note. * p < 0.05 in compare with the control group of animals.

 

Как уже было сказано выше, стресс оказывает сильнейшее дестабилизирующее воздействие на организм, выводит из состояния гомеостаза все системы, в том числе иммунную. Для оценки наличия изменений в функционировании иммунной системы была проанализирована экспрессия генов IL-4 и IL-6 в тканях гипоталамуса и тимуса экспериментальных животных.

Благодаря анализу относительной степени экспрессии генов IL-4 и IL-6 в тканях тимуса было выявлено значительное увеличение этого показателя для обоих генов, что свидетельствует об увеличении активности генов, кодирующих эти цитокины (рис. 3).

 

Рис. 3. Относительная степень экспрессии генов IL-4 (a) и IL-6 (b) в тимусах экспериментальных животных, не подвергавшихся стрессорному воздействию, а также после аппликации хронического стресса. * р < 0,05 по сравнению с контрольными животными

Fig. 3. Expression of the genes IL-4 (a) and IL-6 (b) in the thymus of experimental animals that were not subjected to stress, as well as after the application of chronic stress. *p < 0.05 in compare with control animals

 

Следует отметить, что увеличение степени экспрессии гена провоспалительного цитокина IL-6 намного более значительное, чем увеличение этого показателя для противовоспалительного цитокина IL-4. Известно, что при стрессе стимуляция системы провоспалительных цитокинов сменяется активацией системы противовоспалительных цитокинов, чтобы ограничить чрезмерное воспаление. Из полученных данных можно сделать вывод, что, несмотря на увеличение активности гена противовоспалительного IL-4, активность гена провоспалительного IL-6 в несколько раз выше. Это может свидетельствовать о цитокиновом дисбалансе и нарушении сигнальных взаимодействий между про- и противовоспалительными цитокинами.

Помимо анализа экспрессии генов про- и противовоспалительных цитокинов в тимусе, был произведен анализ экспрессии генов перечисленных цитокинов и в структурах тканей ЦНС, а именно в гипоталамусе. В результате было показано значительное снижение активности экспрессии генов IL-4 и IL-6 в тканях гипоталамуса после аппликации хронического стресса по сравнению с контрольной группой животных (рис. 4). Важно подчеркнуть, что выявленный эффект противоположно направлен показанному повышению активности этих генов в тимусе.

 

Рис. 4. Относительная степень экспрессии генов IL-4 (a) и IL-6 (b) в гипоталамусах экспериментальных животных, не подвергавшихся стрессорному воздействию, а также после аппликации хронического стресса. * р < 0,05 по сравнению с контрольными животными

Fig. 4. Expression of the IL-4 (a) and IL-6 (b) genes in the hypothalamus of experimental animals not subjected to stress, as well as after the application of chronic stress. * p < 0.05 in compare with control animals

 

Так как цитокины могут участвовать в регуляции поведенческих реакций, в том числе могут быть вовлечены в регуляцию синаптической пластичности, нейрональной трансмиссии и Са²⁺-сигналинга, можно предположить, что наблюдаемые стресс-индуцированные изменения в паттернах поведения экспериментальных животных могут быть связаны с изменениями в экспрессии генов исследуемых цитокинов [12].

Заключение

В результате проведенного исследования были выявлены значимые изменения в функционировании нейроэндокринной и иммунной систем при многократной аппликации эмоционально-физического стресса экспериментальным животным. Анализ нейроэндокринных характеристик экспериментальных животных, подвергшихся хроническому стрессорному воздействию, показал, что депрессивно-подавленное состояние вносит свой вклад в изменения поведенческих паттернов, а также в гиперпродукцию глюкокортикоидного гормона — кортикостерона. Благодаря изучению иммунного ответа на хроническое стрессорное воздействие в рамках разработанной модели было установлено достоверное снижение массы тимусов экспериментальных животных, а также повышение экспрессии генов цитокинов IL-6 и IL-4 в этой ткани. В то же время экспрессия генов указанных цитокинов в тканях гипоталамуса, напротив, значительно снижалась, что косвенно может свидетельствовать о роли указанных цитокинов в регуляции ответа ЦНС на стресс. В комплексе полученные данные позволяют заключить, что представленная модель отвечает параметрам хронического стресса и может быть использована для дальнейших исследований, в том числе при изучении механизмов реализации нейроиммунных взаимодействий.

Работа поддержана грантом РФФИ № 18-315-00312.

Список сокращений

IFN-γ — интерферон-γ; IL-1 — интерлейкин-1; IL-4 — интерлейкин-4; IL-6 — интерлейкин-6; TNF-α — фактор некроза опухолей-α; ГГНС — гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система; ГК — глюкокортикоидные гормоны; кДНК — комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота; ПЦР — полимеразная цепная реакция; РНК — рибонуклеиновая кислота; ЦНС — центральная нервная система.

Об авторах

Ирина Алексеевна Янкелевич

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»; ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет» Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: rina.yankelevich@pharminnotech.com
SPIN-код: 9249-6844

канд. биол. наук, доцент, старший научный сотрудник

Россия, Санкт-Петербург

Татьяна Александровна Филатенкова

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»; ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет» Минздрава России

Email: lero269@gmail.com
SPIN-код: 4198-3636

научный сотрудник

Россия, Санкт-Петербург

Марк Васильевич Шустов

ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет» Минздрава России

Email: shustovmark99@gmail.com

студент

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы