Correction of acid base disorders in rats with acute ethylene glycol poisoning

Full Text

Введение

Этиленгликоль (ЭГ), будучи нейро- и нефротоксином, метаболизируется в процессе биотрансформации до гликолевой кислоты, которая медленно выводится из организма и приводит к выраженному ацидозу [1–3]. Клетки почечных канальцев гибнут по механизму одного из вариантов некроза — онкозиса (осмотического разрыва) [4, 5]. Высокие значения анионной разницы при отравлении ЭГ являются значимым фактором риска смерти пациентов [6, 7]. При отравлении ЭГ, несмотря на опасность перегрузки объема циркулирующей крови, применяют активную инфузионную терапию с помощью антидота фомепизола, этанола и корректора метаболического ацидоза — натрия гидрокарбоната [8, 9]. Опасность данного терапевтического подхода заключается в том, что если период перехода в олигоанурическую фазу острого повреждения почек (ОПП) сокращается, то инфузируемые растворы могут способствовать гипернатриемии, перегрузке объема циркулирующей крови и развитию отека легких и головного мозга. Перегрузка жидкостью может быть результатом чрезмерного введения жидкости или олигурии или их комбинации. Введение жидкости, а не низкое выделение мочи было независимо связано с прогрессированием от ОПП I стадии до ОПП III стадии. Одна из ключевых проблем заключается в том, что эффекты перегрузки объемом и эффекты ОПП похожи и оба приводят к полиорганной недостаточности [10, 11]. С другой стороны, очевидно, что при подобных отравлениях развивается эксикоз и в раннюю фазу необходимо вводить кристаллоиды, препараты с антигипоксическими и антиоксидантными свойствами для обеспечения защиты тканей от токсического действия метаболитов ЭГ [12–14]. Среди лекарственных препаратов, влияющих на кислотно-основное состояние (КОС), наряду с натрия гидрокарбонатом назначают диметилоксобутилфосфонилдиметилат, или димефосфон (ДМФ), обладающий антиацидотической, мембраностабилизирующей, противовоспалительной и антиоксидантной активностями. Однако его эффективность при отравлении ЭГ ранее не изучали. Анализ фармакодинамических свойств ДМФ показал, что он оказывает кардиопротективное и нейропротективное действие, благодаря чему может позитивно влиять на вызванные отравлением нарушения КОС и функции почек у крыс.

Целью настоящей работы являлось изучение в эксперименте эффективности стандартной антидотной терапии (САТ) и ДМФ в отношении острого метаболического ацидоза с высокой анионной разницей (HAGMA) при отравлении крыс ЭГ. В задачи исследования входило моделирование острого отравления ЭГ у крыс, проведение экспериментальной терапии антидотом этанолом в сочетании с натрия гидрокарбонатом и терапии ДМФ, сравнение эффективности препаратов в отношении показателей нарушения КОС и функции почек.

Материалы и методы исследования

Животные и моделирование патологии. Эксперименты на животных выполняли в соответствии с требованиями этического обращения с лабораторными животными [15] и протоколом № НИР-102-NT/14 (10.06.2014) лаборатории безопасности лекарственных средств в ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России. В качестве яда использовали ЭГ (АО «ЛенРеактив», ТУ 2632-143-444493179-11) с массовой долей этиленгликоля не менее 99,7 %, диэтиленгликоля — не более 0,1 %. Для выбора дозы крысам внутрижелудочно вводили ЭГ в дозах 3, 6 и 12 мл/кг (по две особи на каждую дозу) и регистрировали летальность. Крысы-самцы линии Вистар массой тела 190–210 г, полученные из питомника ПЛЖ «Рапполово», были разделены по 6 особей каждого пола на группы: интактные (негативный контроль), отравление ЭГ (позитивный контроль), ЭГ + САТ, ЭГ + ДМФ. Для оценки эффективности САТ и ДМФ этиленгликоль вводили крысам внутрижелудочно в дозе 6 мл/кг однократно через атравматический зонд.

Исследуемые препараты и схема лечения. Стандартная антидотная терапия предусматривала введение этанола и натрия гидрокарбоната. В качестве конкурентного ингибитора алкогольдегидрогеназы животным вводили этанол в виде 30 % раствора в дозе 2 мл/кг внутрибрюшинно через 1, 4, 6, 12, 18 ч после отравления по схеме, обеспечивающей его концентрацию в крови не менее 25 ммоль/л. Ацидоз корректировали введением 4 % раствора натрия гидрокарбоната в дозе 6 мл/кг три раза внутрибрюшинно в первые сутки после отравления [9]. Препарат ДМФ, 15 % раствор (ОАО «Татхимфармпрепараты», с.30712), разбавляли стерильным апирогенным изотоническим раствором натрия хлорида в четыре раза и вводили в дозе 150 мг/кг внутрибрюшинно три раза с интервалом 3 ч в первые сутки после отравления (450 мг/кг в сутки в объеме 0,40 мл/100 г массы тела).

Анализируемые показатели. Поскольку задачи эксперимента не предусматривали оценку газов крови и артериовенозную разность показателей, в опыте исследовали венозную кровь. В образцах венозной крови через 24 ч терапии определяли величину рН (ISE), уровень натрия (ISE), калия (ISE), кальция (ISE), магния (Thermo Scientific), хлоридов (ISE), гидрокарбонатов (DiaSys), лактата (DiaSys), D-3-гидроксибутирата (Randox), альбумина (Fluitest Analyticon), мочевины (Fluitest Analyticon) и креатинина (Вектор Бест) на автоматическом биохимическом анализаторе KeyLab (BPC+Biosed s.r.l., Италия) и анализаторе электролитов E-Lyte 5 (HTC, США) (измеренные параметры). Концентрационный индекс по креатинину рассчитывали как отношение уровня креатинина в моче к таковому в сыворотке крови. Вычисляли AG (анионную разницу), ∆рН, ∆AG, ∆HCO₃, ∆AG/∆HCO₃, ∆Gap (расчетные параметры). Вычисления проводили по уравнениям, адаптированным для животных: AG = Na – (Cl + HCO₃), ∆рН = 7,4 – рН, ∆AG = AG – 10, ∆HCO₃ = 30 – HCO₃, ∆Gap = = ∆AG – ∆HCO₃ [16–19], а также с помощью онлайн-сервиса https://www.merckmanuals.com/ medical-calculators/AnionGapDeltaGradient.htm. Суточную мочу собирали со 2-х на 3-и сутки после отравления в обменных клетках Tecniplast metabolic cages (Tecniplast Gazzada, Италия). Измеряли концентрацию креатинина в пробах мочи (методом Яффе) на анализаторе UriСКАН-БК (ООО «Эйлитон», Россия), рассчитывали клиренс креатинина.

Патоморфологическое исследование. Определяли причину смерти погибших животных. Для патоморфологического исследования проводили вскрытие с выделением головного мозга, сердца, легких, печени и почек, которые кассетировали и фиксировали в 15 % нейтральном забуференном растворе формалина не менее 48 ч. Затем осуществляли стандартную проводку и заливку в парафиновые блоки, получали срезы толщиной 5 мкм и окрашивали их гематоксилином и эозином, крезиловым фиолетовым по Нисслю, пикро-Маллори по Лендруму, по методике Ли (ГОФП) [20]. Гистологические препараты исследовали под светооптическим микроскопом Leica DM1000 с поляризационными фильтрами POLAR при участии двух независимых патологов. Микрофотографии получали с помощью камеры и программы ADF Image Capture (версия х64, 4.7.14011).

Статистическая обработка данных. Данные обрабатывали с использованием пакета статистических программ GraphPad Prism 6.0 (США). Для регистрируемых количественных переменных рассчитывали параметры описательной статистики. Данные представлены в виде среднего (Mean) и его ошибки (±SEM). Отличия между выборками оценивали с помощью непараметрического критерия Краскела – Уоллиса и Данна для множественных сравнений и считали значимыми при уровне р < 0,05.

Результаты и обсуждение

Для подбора оптимальной дозы ЭГ использовали три дозы, каждую из которых увеличивали в два раза. Введение ЭГ крысам в дозе 3 мл/кг не приводило к существенной интоксикации, в клинической картине преобладали неврологические нарушения только в первые сутки наблюдения в виде атаксии, тахипноэ, чередующихся эпизодов увеличения двигательной активности и бокового положения при наблюдении в клетке. На 2-е и 3-и сутки поведение и внешнее состояние животных не отличались от нормального. В дозе 6 и 12 мл/кг ЭГ вызывал более выраженные неврологические нарушения в первые сутки наблюдения в виде атаксии и увеличения двигательной активности, которые сменялись через 2 ч боковым положением 1 из 2 особей в группе крыс, получавших ЭГ в дозе 6 мл/кг, и 2 из 2 особей в группе крыс, получавших ЭГ в дозе 12 мл/кг. У отравленных животных снижались двигательная активность, потребление корма и воды. На 3-и сутки, не приходя в сознание, обе крысы из группы ЭГ 12 мл/кг погибли.

Вскрытие и патоморфологическое исследование внутренних органов крыс, погибших при отработке дозы ЭГ, позволили установить следующие патологические изменения. В сердце отмечали мелкие темно-красные субэндокардиальные кровоизлияния без видимого распространения на миокард. Подплеврально в легких выявлены очаговые геморрагии среднего и мелкого размеров. На разрезе печень бледно-коричневого цвета с красными полосками, с поверхности разреза вытекала жидкая кровь. Почки значительно увеличены в размере, бледно-коричневого цвета, капсула снялась легко. На разрезе почек граница между слоями стертая, отмечена выраженная гиперемия слоев. Головной мозг отечен, борозды сглажены, сосуды оболочек головного мозга резко расширены, в стволовой части и мозжечке выявлены точечные кровоизлияния. Очаговых изменений в головном мозге не наблюдали.

Гистологические изменения внутренних органов погибших крыс представлены на рис. 1.

 

Рис. 1. Патологические изменения в почках (а — увеличение ×200; b — увеличение ×400), сердце (c, d — увеличение ×400), мозжечке (e — увеличение ×400) и стволовой части головного мозга (f — увеличение ×400) крыс, погибших на 3-и сутки острого отравления этиленгликолем. Объяснения см. в тексте

Fig. 1. Pathological changes in the kidneys (a, ×200; b, ×400), heart (c, d, ×400), cerebellum (e, ×400) and brain stem (f, ×400) of rats died on the 3^rd day of acute poisoning by ethylene glycol. Explanations in the text

 

В почках погибших крыс выявлены острые гемодинамические расстройства в виде резкого полнокровия сосудистого русла с развитием стаза эритроцитов как в корковом, так и в мозговом слоях. Обнаружены выраженные дистрофические и некробиотические изменения эпителия канальцев в виде зернистой и вакуольной дистрофии и крупных фокусов некроза нефротелия проксимальных канальцев, преимущественно в корковом слое. Гидропическая дистрофия носила диффузный характер с поражением около ¹/₃ эпителия канальцев коркового слоя почек. Некротические изменения эпителия наблюдали в ²/₃ канальцев, детритические гомогенные эозинофильные бесструктурные массы были локализованы в просветах поврежденных канальцев. В интерстиции коркового слоя и переходной зоне отмечены отек, диффузная лимфоплазмоцитарная инфильтрация с примесью нейтрофильных гранулоцитов. При поляризационной микроскопии выявлены яркие светящиеся двулучепреломляющие кристаллы в форме вытянутых гирь и октаэдров, соответствующих оксалату кальция, преимущественно локализованные в просвете канальцев (см. рис. 1, а, b). Патологические изменения в почках свидетельствуют о развитии острого канальцевого некроза в результате осмотического, тубулонекротического действия ЭГ и появления его метаболита — оксалата кальция.

В печени отмечали гидропическую дистрофию перипортальных гепатоцитов, лимфоплазмоцитарную инфильтрацию портальных септ, полнокровие синусоидов. В гистологических препаратах сердца погибших крыс при обзорной окраске гематоксилином и эозином наблюдали умеренно выраженное расширение капилляров с полнокровием и наличием сладжа эритроцитов, отек интерстиция, кардиомиоциты с заметным анизокариозом. При элективной окраске гематоксилином, основным фуксином и пикриновой кислотой по Ли в левом желудочке и межжелудочковой перегородке обнаружены очаги фуксинофилии кардиомиоцитов за счет их контрактурных изменений II–III степеней с разволокнением стромы (см. рис. 1, c, d).

В легких выявили полнокровие капилляров микроциркуляторного русла, дистелектазы, диффузное утолщение альвеолярных стенок, расширение просвета терминальных бронхиол, выраженную острую везикулярную эмфизему, как следствие сильных глубоких инспираций перед наступлением смерти. При гистологическом исследовании препаратов головного мозга, окрашенных по методу пикро-Маллори, отмечали периваскулярный отек, расстройства гемодинамики во всех участках в виде микротромбов капилляров в стволе, мозжечке и коре.

В мозжечке обнаружены эктопия клеток Пуркинье ганглионарного слоя (из-за миграции клеток-зерен из зернистого слоя в молекулярный), уменьшение линейной плотности и изменение формы клеток Пуркинье в виде вытягивания (см. рис. 1, e). При окраске по Нисслю крезиловым фиолетовым клетки Пуркинье содержали неодинаковое количество тигроида, ядрышки плохо дифференцировались. В стволовой части мозга в проекции центров ретикулярной формации — гигантоклеточном и латеральном парагигантоклеточном ядрах — наблюдали микротромбы в капиллярах, сочетание гиперхроматоза нейронов с наличием клеток-теней и перицеллюлярного отека, нейронофагию, а также активацию глиальных клеток (см. рис. 1, f). Гистологические изменения в структурах центральной нервной системы крыс соответствуют медленному темпу умирания при отравлении вследствие нейротоксического действия ЭГ.

При сопоставлении выявленных изменений в органах, функции которых остро критичны для жизнедеятельности, установлено, что ЭГ в токсических дозах оказывает комплексное нейротоксическое, нефротоксическое и кардиодепрессивное действие. Нейротоксическое действие спиртов обычно сопровождается симметричными поражениями центральной нервной системы вокруг третьего желудочка, акведука и четвертого желудочка, изменениями в подкорковых структурах, моторных глазодвигательных и вестибулярных ядрах. В наших наблюдениях коматозное состояние животных сопровождалось развитием эксикоза, что приводило к наслоению кетоацидоза на метаболический ацидоз вследствие метаболизма ЭГ и еще больше усиливало угнетение центральной нервной системы [21]. Несостоятельность насосной функции сердца и поражение витальных центров ретикулярной формации на фоне острого токсического повреждения почек приводят к смертельному исходу. Таким образом, причиной смерти животных стало острое отравление ЭГ с развитием токсической энцефалопатии с поражением витальных центров и мозжечка, ОПП с дистрофическими и некробиотическими изменениями эпителия канальцев по типу тубулярного некроза, очаговым контрактурным поражением кардиомиоцитов, гидропической дистрофии гепатоцитов, что соотносилось с данными как экспериментов [22], так и клинических наблюдений за отравленными ЭГ пациентами [1, 23].

На основании полученных результатов, а также литературных сведений мы выбрали дозу ЭГ 6 мл/кг для последующего моделирования и изучения эффективности САТ и ДМФ. Данная доза соответствует диапазону значений LD₅₀, представленных в литературе (полулетальная доза вещества, вызывающая гибель 50 % испытуемых животных) [1].

Клиническая картина отравления в первые 2 ч у крыс из всех опытных групп была однотипной: «опьянение», нарушение координации движений, походки, увеличение частоты дыхательных экскурсий. В группе САТ отмечено уменьшение двигательной активности и частоты дыхания в сравнении с крысами, не получавшими терапии. Терапия ДМФ после первой дозы усиливала атаксию, но затем поведение животных становилось более упорядоченным.

Результаты биохимического исследования КОС крови крыс, а также функции почек представлены в табл. 1 и 2 и на рис. 2. Поскольку величина AG (расчетный показатель) не связана с уровнем лактат-ацидоза (измеренный показатель), то мы определяли эти показатели независимо и отдельно. Острое отравление ЭГ сопровождалось развитием смешанного метаболического ацидоза (∆рН = 0,47, AG = 31,2 ммоль/л) преимущественно за счет неизмеряемых кислот — метаболитов ЭГ (∆Gap = 13,5 ммоль/л), лактат- и кетоацидоза с накоплением D-3-гидроксимасляной кислоты (D-3-HBA) и респираторного ацидоза (∆AG/∆HCO₃ > 2) из-за нейротоксического действия ЭГ. Лактат-ацидоз играет существенную роль в развитии кардиогенного шока у пациентов с различной патологией, в том числе при отравлениях. В то же время известно, что этанол и ЭГ уменьшают печеночный глюконеогенез, что приводит к снижению секреции инсулина, усилению липолиза, нарушению окисления жирных кислот и кетогенезу, вызывая метаболический ацидоз с анионной разницей, а метаболиты ЭГ оказывают прямое повреждающее действие на митохондрии [1, 3, 22]. Развитие «голодного» кетоацидоза связано с активацией бета-окисления жирных кислот в условиях гипогликемического состояния и описано в клинической практике [21]. Снижение уровня хлоридов (на 19 %), вероятно, обусловлено развитием у животных полиурии в первые часы отравления ЭГ.

 

Рис. 2. Влияние стандартной антидотной терапии и димефосфона на анионную разницу у крыс при отравлении этиленгликолем. Обозначения см. в списке сокращений

Fig. 2. The effect of standard antidote therapy and dimephosphon on the anion gap in rats with ethylene glycol poisoning (box-plot with 5–95 percentile)

 

Таблица 1 / Table 1

Биохимические параметры крови крыс при остром отравлении этиленгликолем через 24 ч после проведения антидотной терапии и введения димефосфона (Mean ± SEM)

Blood biochemistry 24 hours after antidote and dimephosphon therapy of rat with acute ethylene glycol poisoning (Mean ± SEM)

Показатель	Экспериментальные группы крыс (n = 6 в каждой)
	интактные	отравление ЭГ	ЭГ + САТ	ЭГ + ДМФ
Альбумин, г/л	33,5 ± 0,9	24,3 ± 0,5*	29,2 ± 1,1	25,8 ± 0,5*
Мочевина, ммоль/л	6,0 ± 0,7	12,3 ± 0,6*	9,5 ± 0,8	8,8 ± 0,8
Креатинин, мкмоль/л	69,7 ± 8,0	159,7 ± 20,5*	129,5 ± 15,8*	97,5 ± 4,7
рН крови, ед.	7,34 ± 0,14	6,93 ± 0,07*	7,01 ± 0,10	7,15 ± 0,05
Натрий, ммоль/л	146,5 ± 2,2	140,8 ± 0,6	143,7 ± 2,6	142,5 ± 1,8
Калий, ммоль/л	6,1 ± 0,4	6,2 ± 0,7	6,9 ± 0,3	5,7 ± 0,3
Кальций, ммоль/л	3,9 ± 0,1	3,2 ± 0,2	3,1 ± 0,2	3,0 ± 0,1*
Магний, ммоль/л	0,7 ± 0,1	1,2 ± 0,1*	1,0 ± 0,1	1,0 ± 0,1
Хлориды, ммоль/л	108,0 ± 1,8	87,3 ± 2,0*	96,0 ± 2,2	98,7 ± 1,6
Бикарбонаты, ммоль/л	28,0 ± 0,4	24,0 ± 0,8*	24,5 ± 0,8*	26,3 ± 0,7
D-3-HBA, мкмоль/л	29,7 ± 5,7	351,7 ± 42,3*	167,0 ± 24,0*	209,7 ± 62,5*
Лактат, ммоль/л	0,7 ± 0,1	2,6 ± 0,4*	1,7 ± 0,2	1,5 ± 0,3
ЛДГ общая, Е/л	400,2 ± 77,5	984,4 ± 76,8*	864,8 ± 82,4*	640,6 ± 61,9
∆рН, у. е.	0,06 ± 0,16	0,47 ± 0,07	0,39 ± 0,10	0,25 ± 0,05
∆AG, ммоль/л	0,5 ± 2,2	21,2 ± 2,3*	13,2 ± 1,8*	7,5 ± 1,3#
∆HCO3, ммоль/л	2,0 ± 0,4	7,7 ± 1,2	5,5 ± 0,8	3,7 ± 0,7
∆AG/∆HCO3, у. е.	1,0 ± 1,0	2,9 ± 0,4	2,7 ± 0,5	2,6 ± 0,8
∆Gap, ммоль/л	–1,5 ± 2,6	13,5 ± 1,9*	7,7 ± 1,9	3,8 ± 1,7

Примечания: * отличия значимы по сравнению с группой интактных крыс при р < 0,05; ^# отличия значимы по сравнению с группой отравленных этиленгликолем крыс при р < 0,05; D-3-HBA — D-3-гидроксимасляная кислота, ЛДГ — лактатдегидрогеназа, ∆рН, ∆AG, ∆HCO3, ∆AG/∆HCO₃ и ∆Gap — расчетные параметры кислотно-основного состояния и метаболического ацидоза (см. «Материалы и методы»). Остальные обозначения см. в списке сокращений.

 

Таблица 2 / Table 2

Функциональные показатели почек крыс при остром отравлении этиленгликолем на третьи сутки (Mean ± SEM)

Kidney function tests of rat with acute ethylene glycol poisoning on day 3 (Mean ± SEM)

Показатель	Экспериментальные группы крыс (n = 6 в каждой)
	интактные	отравление ЭГ	ЭГ + САТ	ЭГ + ДМФ
Диурез, мл/сут	14,8 ± 1,7	7,9 ± 1,5	13,2 ± 1,3	15,1 ± 1,8
Минутный диурез, мкл/мин	10,3 ± 1,2	5,5 ± 2,5	9,2 ± 2,3	10,5 ± 1,3
Креатинин мочи, мкмоль/л	5305,0 ± 602,7	5615,0 ± 637,1	4627,0 ± 1060,0	4907,0 ± 1183,0
Концентрационный индекс по креатинину	85,1 ± 17,5	37,3 ± 6,2	40,6 ± 12,4	50,6 ± 12,6
Клиренс креатинина, мл/мин	0,78 ± 0,08	0,19 ± 0,03*	0,33 ± 0,07*	0,46 ± 0,05

Примечание: * отличия значимы по сравнению с группой интактных крыс при р < 0,01. Обозначения, использованные в таблице, см. в списке сокращений.

 

Мы обратили внимание также на то, что величина ∆Gap у отравленных крыс была больше 6 ммоль/л. Это обычно свидетельствует о наличии смешанного метаболического ацидоза-алкалоза. Однако эти результаты требуют более детального изучения, так как уровень бикарбонатов был снижен умеренно (не ниже 20 ммоль/л) и измеренные значения могли быть неточны из-за высокой лактатдегидрогеназной активности сыворотки крови, причиной увеличения которой могло быть сопорозное состояние животных и гипоксическое повреждение мозга и почек, что в расчетном показателе ∆Gap указывало на метаболический микст — ацидоз – алкалоз [24]. «Истинного» варианта сочетанного нарушения КОС установить не представилось возможным — это достаточно характерно для экзогенных интоксикаций. Мы предполагаем, что все же доминирующим вариантом дисбаланса КОС является метаболический ацидоз с высокой анионной разницей в сочетании с другими обменными нарушениями, что согласуется с данными научной литературы [1, 6–8].

Нефротоксическое действие ЭГ характеризовалось начальным подъемом уровня креатинина в 2,2 раза, мочевины в 2 раза, магния в 1,7 раза, что свидетельствовало об остром нарушении фильтрационной функции почек без гиперкалиемии (снижение клиренса креатинина в 4 раза, р = 0,0005). При этом соотношение креатинина в моче и крови не успело претерпеть статистически достоверного изменения. Было зарегистрировано развитие гипокальциемии (р = 0,0076), связанной, вероятно, с образованием оксалата кальция и его осаждением в органах-мишенях. Выявлено умеренное снижение уровня альбумина (р = 0,0004). Данные представлены в табл. 1 и 2.

Примененная нами терапия частично редуцировала нарушения КОС, которое оценивали по указанным выше показателям. Необходимо отметить, что ДМФ в несколько большей степени, чем САТ, нормализовывал pH и уровень бикарбонатов. Стандартная антидотная терапия ограничивала развитие гипермагнезиемии, лактат-ацидоза, повышение уровня мочевины. Существенного действия САТ в отношении острого нарушения фильтрационной функции почек, оцениваемого по уровню креатинина в крови и его клиренсу (р = 0,0375 по сравнению с группой интактных крыс), а также на величину ∆AG не выявлено, что свидетельствует о недостаточности такой терапии без применения комплекса мер (например, острого диализа) или добавления препаратов, обладающих дополнительно другими положительными фармакодинамическими свойствами.

Экспериментальная терапия частично протектировала нарастание энергодефицита и снижала уровень D-3-гидроксибутирата (САТ — на 52 %, ДМФ — на 40 %). В отношении увеличенной активности лактатдегидрогеназы (в 2,46 раза, р = 0,0012) введение ДМФ, в отличие от САТ, приводило к умеренному снижению активности фермента (на 35 %), носившему характер отчетливой тенденции (р = 0,1337).

Терапия острого отравления ЭГ с помощью ДМФ позитивно влияла на функциональное состояние мочевыделительной системы, что выражалось в ограничении подъема у отравленных крыс уровня креатинина в крови (на 39 %) в сравнении с САТ, когда влияние на этот показатель было не столь значительным (снижение на 19 %). Димефосфон предотвращал снижение клиренса эндогенного креатинина (см. табл. 2). Таким образом, ДМФ оказывал анигипоксическое действие и способствовал сохранению функции мочеобразования, вероятно, за счет нормализации энергетических процессов в тканях-мишенях, обусловленных токсическим действием ЭГ и его метаболитов. Димефосфон существенно ограничивал подъем пула неизмеряемых анионов в крови отравленных крыс, что выражалось в снижении величин анионной разницы (в 2 раза), ∆рН (в 1,9 раза), ∆AG (в 2,8 раза), ∆Gap (в 3,5 раза) за счет интенсификации ренального и дыхательного механизмов регуляции КОС.

Для визуализации статистической чувствительности тестов, характеризующих токсическое действие ЭГ, рассчитывали обратную величину уровня значимости (1/р = р^–1). Наибольший статистически достоверный отклик (2500–5000 р^–1) при отравлении ЭГ имели уровень хлоридов и d-3-гидроксибутирата, ∆AG, затем клиренс креатинина, уровни магния и альбумина (2000–2500 р^–1), AG, мочевина, креатинин крови и ∆Gap (500–1000 р^–1). Полученные данные свидетельствуют о высокой достоверности развития при остром отравлении ЭГ метаболического и кетоацидоза со снижением уровня хлоридов, нарушением фильтрационной функции почек (рис. 3).

 

Рис. 3. Обратная величина уровня значимости измеренных показателей у крыс при отравлении этиленгликолем. Cl^– — хлориды; Lac — лактат; LDH — лактатдегидрогеназа; Alb — альбумин; BUN — азот мочевины крови; s-Cre — сывороточный креатинин; ClCr — клиренс креатинина

Fig. 3. The inverse of the significance level (1/p-level) of the measured parameters in rats with ethylene glycol poisoning. Cl^– — chlorides; Lac — lactic acid; LDH — lactatdehydrogenase; Alb — albumin; BUN — blood urea nitrogen; s-Cre — serum creatinin; ClCr — clearance of creatinine

 

Доклинические исследования ДМФ на крысах показали его активность в качестве регулятора водно-электролитного баланса и КОС, антигипоксическую и антиоксидантную активность при низкой токсичности и отсутствии ингибирования ацетилхолинэстеразы. При воздействии терапевтической дозы ДМФ 500 мг/кг в сутки у крыс наблюдали адаптационно-компенсаторные изменения дендрито-аксонального дерева нейронов коры мозжечка [25, 26]. При введении этого препарата в условиях нашего эксперимента в дозе 150 мг/кг три раза (450 мг/кг в сутки) в течение первых суток при остром отравлении ЭГ происходило статистически достоверное снижение величин AG и ∆AG (р = 0,042), при этом удалось предотвратить раннее снижение клиренса креатинина и развитие гиперазотемии — маркеров скорости клубочковой фильтрации, замедлить развитие лактат- и кетоацидоза. Выявленные эффекты превосходили таковые от САТ этанолом и натрия гидрокарбонатом, что открывает перспективу для применения ДМФ в лечении отравлений ядами, вызывающими метаболический ацидоз с высокой анионной разницей (метанол, ЭГ, салицилаты, нитропруссид натрия). В качестве показателей, на которые необходимо обращать внимание при терапии ДМФ, следует отметить альбумин и кальций крови, так как их уровни в крови крыс были снижены.

Заключение

Острое отравление этиленгликолем приводит к развитию смешанного варианта танатогенеза с поражением центральной нервной и мочевыделительной систем, а также сердца. Причиной смерти животных при воздействии дозы этиленгликоля 12 мл/кг однократно внутрижелудочно стало развитие токсической энцефалопатии, острого поражения почек с дистрофическими и некробиотическими изменениями эпителия канальцев по типу тубулярного некроза, очаговых контрактурных поражений кардиомиоцитов, гидропической дистрофии гепатоцитов. Для моделирования отравления с последующим изучением эффективности антидотной терапии мы использовали однократную дозу 6 мл/кг массы тела крыс. Наиболее достоверными маркерами сдвига кислотно-основного баланса и нефротоксичности у крыс при отравлении этиленгликолем являются уровни хлоридов, d-3-гидроксибутирата, анионная разница и ∆AG, а также клиренс креатинина. Отравление этиленгликолем сопровождалось развитием смешанного варианта метаболического ацидоза с высокой анионной разницей больше 30 ммоль/л. По критерию ∆AG/∆HCO₃ > 2 мы судили о сочетании метаболического и респираторного ацидоза как следствия нейротоксического действия этиленгликоля, а по величине ∆Gap > 6 ммоль/л — о наличии смешанного метаболического ацидоза-алкалоза.

Стандартная антидотная терапия этанолом в сочетании с гидрокарбонатом натрия предотвращала сдвиг рН, ограничивала лактат-ацидоз и кетоацидоз, повышение уровня мочевины, но не влияла на уровень гидрокарбонатов, креатинина и его клиренса, анионную разницу. Димефосфон предотвращал снижение клиренса креатинина и уровня бикарбонатов в крови, ограничивал увеличение активности лактатдегидрогеназы, оказывал статистически достоверное действие в отношении анионной разницы и ∆AG, но не влиял на гипокальциемию и гипоальбуминемию.

Сравнительный анализ двух методов коррекции ацидоза у крыс при остром отравлении этиленгликолем показал, что ДМФ оказывает более выраженное действие в отношении маркеров метаболического ацидоза (анионной разницы и ее производных расчетных величин).

Дополнительная информация

Финансирование. Исследование не имело финансовой поддержки.

Соблюдение этических норм. Исследование одобрено протоколом этического комитета № НИР-102-NT/14 (10.06.2014) лаборатории безопасности лекарственных средств в ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Список сокращений

ДМФ — димефосфон; КОС — кислотно-основное состояние; ЛДГ — лактатдегидрогеназа; ОПП — острое повреждение почек; САТ – стандартная антидотная терапия; ЭГ — этиленгликоль; AG — анионная разница (anion gap); D-3-HBA — D-3-гидроксимасляная кислота (D-3-гидроксибутират); ∆AG — разность в величине анионной разницы; ∆AG/∆HCO₃ — индекс отношения анионной разницы; ∆Gap — разность между изменением анионной разницы и изменением гидрокарбонатов; ∆HCO₃ — разница в уровне гидрокарбонатов крови; ∆рН — разница в величине водородного показателя крови; ISE — ион-селективные электроды; рН — водородный показатель.

About the authors

Konstantin V. Sivak

Smorodintsev Research Institute of Influenza

Author for correspondence.
Email: kvsivak@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-4064-5033

PhD in Biology, Head of the Department of Preclinical Trials

Russian Federation, Saint Petersburg

Mikhail M. Lyubishin

Smorodintsev Research Institute of Influenza

Email: lubishin_m@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2447-5222

PhD in Biology, Researcher in laboratory of drug safety

Russian Federation, Saint Petersburg

Elena Yu. Kalinina

Smorodintsev Research Institute of Influenza; Saint Petersburg State Pediatric Medical University

Email: drkalinina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7077-3584

MD, PhD in Medicine (pathologist), Leading Researcher in Laboratory of Drug Safety; Associate Professor, Department of Pathological Anatomy

Saint Petersburg

References

Supplementary files