Роль рецептор-связывающего домена вируса SARS-CoV-2 в активации нейтрофилов при формировании ответа на частицы размером 100 нм в слизистой оболочке главного бронха мышей

Обложка


Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация

Обоснование. Попадающие в респираторный тракт патогены, в том числе вирусные частицы, выводятся из организма при помощи мукоцилиарного клиренса и фагоцитирующих клеток иммунной системы. Сведения о том, какие именно фагоциты отвечают за интернализацию вирусных частиц в слизистой оболочке главного бронха, необходимы как для понимания механизмов противовирусного иммунного ответа, так и для разработки стратегии регуляции противовирусного иммунитета.

Цель — определить роль рецептор-связывающего домена SARS-CoV-2 в активации нейтрофил-опосредованного ответа, формирующегося в слизистой оболочке главного бронха мышей после введения частиц размером 100 нм.

Материалы и методы. Мыши линии C57BL/6 получали орофарингеально флуоресцентные частицы размером 100 нм в растворе рецептор-связывающего домена вируса SARS-CoV-2. Через 24 ч главный бронх мыши окрашивали при помощи флуоресцентно меченных антител. Трехмерные изображения слизистой оболочки главного бронха получали с использованием конфокального микроскопа. При помощи количественного анализа изображений оценивали фагоцитарную активность нейтрофилов в слизистой оболочке главного бронха.

Результаты. Миграцию нейтрофилов в слизистую главного бронха обнаружили только при введении частиц в растворе рецептор-связывающего домена вируса SARS-CoV-2, но не в фосфатном буфере или в растворе бычьего сывороточного альбумина. Раствор рецептор-связывающего домена вируса SARS-CoV-2 сам по себе также вызывал приток нейтрофилов в слизистую оболочку главного бронха. Мигрировавшие в слизистую оболочку главного бронха в ответ на введение частиц в растворе рецептор-связывающего домена вируса SARS-CoV-2 нейтрофилы принимали активное участие в интернализации частиц.

Заключение. Раствор рецептор-связывающего домена вируса SARS-CoV-2 обладает способностью активировать нейтрофил-опосредованный ответ в слизистой оболочке главного бронха.

Полный текст

Обоснование

Нейтрофилы обеспечивают защиту организма от патогенов, в том числе вирусной природы [1]. В отсутствие патологии нейтрофил-опосредованный ответ завершается разрешением воспаления, но в случае ощутимого повреждения тканей при осложнениях вирусных инфекций разрешение может не наступать [2]. Известно, что нейтрофилы способны инфильтрировать легкие, повреждая эндотелий сосудов и эпителий альвеол, нарушая процесс газообмена [3]. Острый воспалительный нейтрофил-опосредованный ответ обусловливает закупорку легочных сосудов при летальном сепсисе, и иногда причиной образования тромба становятся образуемые нейтрофилами внеклеточные сети [4, 5]. Нейтрофилы крови пациентов с тяжелым течением коронавирусной инфекции в большей степени подвержены нетозу in vitro, кроме того, нетоз наблюдают в гистологических срезах тканей легких таких пациентов [6]. Механизмы, запускаемые SARS-CoV-2 и приводящие к неконтролируемому нейтрофил-опосредованному ответу, не ясны.

Цель настоящей работы — определить роль рецептор-связывающего домена вируса SARS-CoV-2 (RBD) в активации нейтрофил-опосредованного ответа, формирующегося в слизистой оболочке главного бронха мышей после введения частиц размером 100 нм.

Материалы и методы

В исследовании использовали мышей C57BL/6 (самок) в возрасте 8–20 нед. из питомника лабораторных животных «Пущино». Мышей обездвиживали в атмосфере изофлурана и вводили орофарингеально флуоресцентные частицы размером 100 нм (Fluospheres, Thermofisher) в дозе 10 млн частиц на мышь. Предварительно частицы обрабатывали ультразвуком (для предотвращения агломерации) и разводили в 0,1 % растворе RBD (Хайтест) в фосфатном буфере. Контрольные группы мышей получали частицы в фосфатном буфере, в 0,1 % растворе бычьего сывороточного альбумина (Serva) и 0,1 % раствор RBD (без частиц). Через 24 ч легкие мышей извлекали и выдерживали ночь при 4 °C в 2 % растворе параформальдегида (Sigma-Aldrich). Главный бронх вырезали и окрашивали флуоресцентно меченными антителами: Alexa647-Ly6G или APC-CD11b (BioLegend). Филаменты актина окрашивали Atto425-меченым фаллоидином (Sigma-Aldrich), ядра — Hoechst 33342 (Thermofisher). Препараты покрывали монтирующей средой Prolong Gold (Thermofisher). Трехмерные изображения получали при помощи конфокального микроскопа Zeiss LSM 780 (Zeiss). Количественный анализ изображений проводили в программе Imaris (Oxford Instruments).

Результаты

Разведенные в фосфатном буфере флуоресцентные частицы детектировали в слизистой оболочке главного бронха через 24 ч после введения. Частицы находились на обращенной в просвет стороне эпителиального барьера и преимущественно были поглощены клетками-фагоцитами, экспрессирующими актин на уровне эпителиальных клеток (рис. 1, а, с). При окрашивании против Ly6G — антигена нейтрофилов мыши — не выявлено нейтрофилов в слизистой оболочке главного бронха через 24 ч после введения частиц. Было проведено окрашивание при помощи антител к CD11b — общему маркеру фагоцитов, экспрессия которого характерна на высоком уровне для зрелых и незрелых нейтрофилов, а также для других типов фагоцитирующих клеток. Богатые актином клетки, поглощавшие частицы, экспрессировали CD11b на очень низком уровне, других CD11b+-клеток в слизистой оболочке главного бронха обнаружено не было.

 

Рис. 1. Инертные частицы 100 нм, подверженные поглощению актин-богатыми клетками в слизистой оболочке главного бронха: а — окрашивание фаллоидином (светло-голубой), визуализация эпителия главного бронха и богатых актином клеток округлой формы на обращенной в просвет поверхности эпителия; b — частицы (красный) как в свободном виде, так и в виде скоплений (стрелки); с — суммарное изображение скопления частиц, находящихся внутри богатых актином клеток округлой формы. Масштаб — 50 мкм

Fig. 1. Inert 100 nm particles are subjected to internalization by actin-rich cells in conducting airway mucosa: a — phalloidin (cyan) allows visualizing conducting airway epithelium and actin-rich round-shape cells in the luminal side of conducting airway epithelium; b — particles (red) were observed in a free state and as agglomerates (arrows); c — merged image shows that particles agglomerates were inside actin-rich round-shape cells. Scale bar 50 µm

 

Флуоресцентные частицы в растворе RBD, в отличие от частиц в фосфатном буфере, вызывали приток нейтрофилов в слизистую оболочку главного бронха, что детектировали как при помощи антител к Ly6G, так и при помощи антител к CD11b (рис. 2, a). У мышей, получавших орофарингеально раствор RBD без частиц, также были обнаружены нейтрофилы, но в значительно меньшем количестве (рис. 2, b). Введение частиц в растворе бычьего сывороточного альбумина не вызывало притока нейтрофилов в слизистую оболочку главного бронха (рис. 2, c). Приходящие в ответ на введение частиц в растворе RBD нейтрофилы поглощали частицы наряду с высокоэкспрессирующими актин фагоцитами, задействованными в захвате частиц даже в отсутствие RBD (рис. 2, d–f).

 

Рис. 2. Приток нейтрофилов в слизистую оболочку главного бронха, стимулируемый RBD: а —репрезентативное изображение фрагмента главного бронха мыши через 24 ч после введения частиц 100 нм в растворе RBD; b — регион главного бронха мыши, получившей только раствор RBD (без частиц); с — регион главного бронха мыши через 24 ч после введения частиц в растворе бычьего сывороточного альбумина. Шкала — 50 мкм; d–f — увеличенное изображение региона, показанного на рис. а, представляет частицы, в том числе поглощенные нейтрофилами (стрелки). Шкала — 30 мкм. Фаллоидин (светло-голубой) окрашивает эпителиальные клетки и богатые актином клетки-фагоциты, CD11b (зеленый) позволяет определить нейтрофилы, частицы (красный)

Fig. 2. RBD stimulates neutrophil infiltration to conducting airway mucosa: а — representative image of the conducting airway region 24 hours after the application of 100 nm particles in RBD solution; b — the region of conducting airway of mouse that received RBD solution alone (without particles); c — the region of conducting airway of mouse that received particles in bovine serum albumin solution. Scale bar 50 µm; d–f — enlarged images of the region indicated in a shows particles, some of them are internalized by neutrophils (arrows). Scale bar 30 µm. Phalloidin (cyan) allows to visualize epithelium and actin-rich phagocytic cells, CD11b (green) permit to observe neutrophils, particles (red)

 

Обсуждение результатов

Известно, что наночастицы способны индуцировать нейтрофил-опосредованный ответ [7]. Однако в данной работе при орофарингеальном введении частиц размером 100 нм мышам мы не обнаружили нейтрофилов в слизистой оболочке главного бронха. Для определения нейтрофилов применяли маркер Ly6G. Такой подход был использован нами ранее, при визуализации нейтрофилов в слизистой оболочке главного бронха в ответ на введение спор грибов [8]. Однако в ответ на частицы размером 100 нм данный подход не позволил выявить нейтрофилы. Было показано, что в крови пациентов с осложненным течением COVID-19 увеличивалось количество незрелых нейтрофилов [9]. Незрелые нейтрофилы мыши слабо экспрессируют Ly6G [10]. Для обнаружения нейтрофилов независимо от степени их созревания нами были использованы антитела против CD11b. С помощью антител к CD11b также не был выявлен приток нейтрофилов в ответ на инертные частицы. Таким образом, показано, что инертные частицы размером 100 нм не активируют нейтрофил-опосредованный ответ в слизистой оболочке главного бронха. Частицы, вводимые в растворе RBD, стимулировали приток нейтрофилов в слизистую оболочку главного бронха мыши, более того, даже в отсутствие частиц RBD вызывал слабый приток нейтрофилов. Мигрировавшие нейтрофилы поглощали частицы на обращенной в просвет дыхательного пути стороне эпителия главного бронха. Таким образом, RBD вызывал приток нейтрофилов в слизистую оболочку главного бронха и стимулировал фагоцитоз частиц нейтрофилами.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований в рамках проекта № 20-04-60311 Вирусы.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Этическая экспертиза. Выполнение исследования одобрено комиссией по контролю за содержанием и использованием животных Государственного научного центра ФГБУН «Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН (протоколы № 302/2020 от 5 августа 2020 г. и № 319 от 24 марта 2021 г.).

×

Об авторах

Елена Леонидовна Болховитина

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Email: alenkash83@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3386-509X

младший научный сотрудник

Россия, Москва

Юлия Дмитриевна Вавилова

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Email: Juliateterina12@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9075-218X

аспирант, младший научный сотрудник

Россия, Москва

Андрей Олегович Богородский

Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)

Email: bogorodskiy173@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-7589-7823

младший научный сотрудник

Россия, Долгопрудный

Иван Станиславович Охрименко

Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)

Email: ivan.okhrimenko@phystech.edu
ORCID iD: 0000-0002-1053-2778
SPIN-код: 8418-0194

научный сотрудник

Россия, Долгопрудный

Валентин Иванович Борщевский

Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)

Email: borshchevskiy.vi@phystech.edu
ORCID iD: 0000-0003-4398-9712
SPIN-код: 2018-8957

ведущий научный сотрудник

Россия, Долгопрудный

Марина Александровна Шевченко

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: mshevch@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-5278-9937
SPIN-код: 8509-1096

научный сотрудник

Россия, Москва

Список литературы

  1. Ley K., Hoffman H.M., Kubes P. et al. Neutrophils: New insights and open questions // Sci. Immunol. 2018. Vol. 3, No. 30. P. eaat4579. doi: 10.1126/sciimmunol.aat4579
  2. Jamieson A.M., Pasman L., Yu S. et al. Role of tissue protection in lethal respiratory viral-bacterial coinfection // Science. 2013. Vol. 340, No. 6137. P. 1230–1234. doi: 10.1126/science.1233632
  3. Short K.R., Kroeze E.J.B.V., Fouchier R.A.M., Kuiken T. Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome // Lancet Infect. Dis. 2014. Vol. 14, No. 1. P. 57–69. doi: 10.1016/s1473-3099(13)70286-x
  4. Lee E.K.S., Gillrie M.R., Li L. et al. Leukotriene B4-mediated neutrophil recruitment causes pulmonary capillaritis during lethal fungal sepsis // Cell. Host. Microbe. 2018. Vol. 23, No. 1. P. 121–133.e4. doi: 10.1016/j.chom.2017.11.009
  5. Jiménez-Alcázar M., Rangaswamy C., Panda R. et al. Host DNases prevent vascular occlusion by neutrophil extracellular traps // Science. 2017. Vol. 358, No. 6367. P. 1202–1206. doi: 10.1126/science.aam8897
  6. Veras F.P., Pontelli M.C., Silva C.M. et al. SARS-CoV-2-triggered neutrophil extracellular traps mediate COVID-19 pathology // J. Exp. Med. 2020. Vol. 217, No. 12. P. e20201129. DOI: 10.1084%2Fjem.20201129
  7. Keshavan S., Calligari P., Stella L. et al. Nano-bio interactions: a neutrophil-centric view // Cell. Death Dis. 2019. Vol. 10, No. 8. P. 569. doi: 10.1038/s41419-019-1806-8
  8. Bogorodskiy A.O., Bolkhovitina E.L., Gensch T. et al. Murine intraepithelial dendritic cells interact with phagocytic cells during Aspergillus fumigatus-induced inflammation // Front. Immunol. 2020. Vol. 11. P. 298. doi: 10.3389/fimmu.2020.00298
  9. Silvin A., Chapuis N., Dunsmore G. et al. Elevated calprotectin and abnormal myeloid cell subsets discriminate severe from mild COVID-19 // Cell. 2020. Vol. 182, No. 6. P. 1401–1418.e18. doi: 10.1016/j.cell.2020.08.002
  10. Boivin G., Faget J., Ancey P.B. et al. Durable and controlled depletion of neutrophils in mice // Nat. Commun. 2020. Vol. 11, No. 1. P. 2762. doi: 10.1038/s41467-020-16596-9

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Инертные частицы 100 нм, подверженные поглощению актин-богатыми клетками в слизистой оболочке главного бронха: а — окрашивание фаллоидином (светло-голубой), визуализация эпителия главного бронха и богатых актином клеток округлой формы на обращенной в просвет поверхности эпителия; b — частицы (красный) как в свободном виде, так и в виде скоплений (стрелки); с — суммарное изображение скопления частиц, находящихся внутри богатых актином клеток округлой формы. Масштаб — 50 мкм

Скачать (586KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Приток нейтрофилов в слизистую оболочку главного бронха, стимулируемый RBD: а —репрезентативное изображение фрагмента главного бронха мыши через 24 ч после введения частиц 100 нм в растворе RBD; b — регион главного бронха мыши, получившей только раствор RBD (без частиц); с — регион главного бронха мыши через 24 ч после введения частиц в растворе бычьего сывороточного альбумина. Шкала — 50 мкм; d–f — увеличенное изображение региона, показанного на рис. а, представляет частицы, в том числе поглощенные нейтрофилами (стрелки). Шкала — 30 мкм. Фаллоидин (светло-голубой) окрашивает эпителиальные клетки и богатые актином клетки-фагоциты, CD11b (зеленый) позволяет определить нейтрофилы, частицы (красный)

Скачать (1005KB)
Метаданные

© Болховитина Е.Л., Вавилова Ю.Д., Богородский А.О., Охрименко И.С., Борщевский В.И., Шевченко М.А., 2021

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 74760 от 29.12.2018 г.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах