Том 21, № 3 (2021)

Цель — обобщить данные научной литературы о частоте и особенностях инфекционных осложнений, развивающихся при лечении больных лимфопролиферативными заболеваниями новым классом препаратов — селективными ингибиторами тирозинкиназы Брутона. Показаны участие тирозинкиназы Брутона в образовании и активации В-клеток и роль хронической активации В-лимфоцитов при развитии хронического лимфолейкоза. Определены условия, при которых назначение указанных препаратов имеет преимущества перед ранее примененными схемами терапии, так как чаще позволяет добиваться полной или частичной ремиссии. Рассмотрены основные характеристики ингибиторов тирозинкиназы Брутона, используемых в клинической практике, и осложнения, вызванные, как предполагают, нарушениями активности нецелевых тирозинкиназ. Описаны основные типы выявленных инфекционных осложнений, развивающихся при приеме препаратов указанной группы, временные особенности их появления и характерные возбудители.

В обзоре представлены данные об истории открытия первых эндогенных антибиотических соединений, о вкладе отечественных исследователей, в частности сотрудников ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», в изучение структурных и функциональных свойств антимикробных белков и пептидов — важных молекулярных факторов врожденного иммунитета, которые могут выступать альтернативой конвенциональным антибиотикам в борьбе за контроль над патогенными микроорганизмами.

Обоснование. Серьезной проблемой здравоохранения является резистентность к традиционным антибиотикам микроорганизмов, вызывающих опасные для здоровья человека инфекции. В связи с этим разработка новых эффективных антимикробных препаратов и терапевтических подходов представляется актуальной задачей. Антимикробные пептиды считают перспективной альтернативой традиционным антибиотикам в борьбе с резистентными микроорганизмами.

Цель — изучение влияния новых синтетических антимикробных пептидов медицинской пиявки Hirudo medicinalis на функциональную активность гранулярных белков нейтрофилов — основных эффекторных клеток иммунитета, в том числе в условиях развития окислительного/галогенирующего стресса.

Материалы и методы. Пероксидазную активность миелопероксидазы оценивали по скорости окисления o-дианизидина. Амидолитическую активность нейтрофильной эластазы определяли флуоресцентным методом с использованием специфического субстрата MeOSuc-AAPV-AMC. Железосвязывающую активность лактоферрина оценивали спектрофотометрическим методом по изменению поглощения раствора при добавлении соли Fe³⁺. Активность лизоцима определяли по скорости лизиса бактериальных клеток M. lysodeikticus.

Результаты. Нативные антимикробные пептиды 536_1 и 19347_2 ингибировали, а антимикробный пептид 12530 — усиливал пероксидазную активность миелопероксидазы, данная тенденция сохранялась и после модификации указанных пептидов хлорноватистой кислотой (HOCl). В отличие от нативного галогенированный антимикробный пептид 3967_1 усиливал ферментативную активность миелопероксидазы. В присутствии антимикробного пептида 3967_1 амидолитическая активность нейтрофильной эластазы незначительно увеличивалась, в то время как антимикробный пептид 19347_2 ингибировал активность фермента. После модификации HOCl данные соединения сохраняли свою способность регулировать активность нейтрофильной эластазы. Синергетические эффекты (~20 %) против грамположительных бактерий M. lysodeikticus выявлены для комбинации лизоцима с антимикробными пептидами 12530 и 3967_1. Ингибирование антимикробной активности лизоцима наблюдалось в присутствии антимикробных пептидов 19347_2 и 536_1, но выраженность данного эффекта снижалась после их модификации под действием HOCl. После модификации HOCl антимикробный пептид 3967_1 усиливал, в то время как 12530, наоборот, приобретал способность ингибировать муколитическую активность лизоцима.

Заключение. Использование препаратов на основе исследуемых антимикробных пептидов медицинской пиявки будет оказывать благоприятное влияние на борьбу организма с возбудителями инфекций не только за счет антимикробного действия самих антимикробных пептидов, но и за счет модуляции данными соединениями биологической активности собственных эндогенных антимикробных белков и пептидов: усиления — в случае необходимости элиминации патогена и ингибирования — для защиты от повреждения собственных тканей организма.

Цель исследования — оценить возможные психосоматические нарушения, такие как нервный срыв, острая временная фаза конкретного расстройства, которое проявляется в первую очередь признаками депрессии и невроза, у лиц молодого возраста, перенесших COVID-19, в процессе реабилитации для улучшения медико-психологического сопровождения после выписки из стационара.

Материалы и методы. Обследованы 60 ранее практически здоровых реконвалесцентов, перенесших COVID-19, мужчины в возрасте 19,87 ± 1,64 года. Основными клиническими формами COVID-19 в нашем исследовании были инаппарантная форма болезни (19 человек, 31,67 %), острая респираторная вирусная инфекция (21 человек, 35,0 %), пневмония без дыхательной недостаточности (20 человек, 33,33 %), которые имели легкую и среднюю степень тяжести течения болезни. Диагностику всех клинических случаев COVID-19, обследование, лечение и выписка больных из стационара проводили в соответствии с нормативными документами. После выписки из стационара у обследованных лиц прошло в среднем 6–8 мес. Психометрическое обследование для разделения у них клинических проявлений дистресса, соматизации, проявлений депрессии и тревоги было выполнено по опроснику The Four-Dimensional Symptom Questionnaire – 4DSQ, разработанному в 1996 г. голландскими специалистами [переведен на русский язык и адаптирован под названием «Четырехмерный опросник по симптомам дистресса, депрессии, тревоги и соматизации (4ДДТС)»]. У всех обследованных было получено добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Результаты и обсуждение. Уровень дистресса, тревоги, соматизации после COVID-19 был умеренно повышен, что свидетельствует о перенесенном серьезном заболевании, в ряде случаев имеющем неблагоприятный исход. Значительно повышенный уровень депрессии в нашем исследовании обусловлен, вероятно, наличием астено-невротического синдрома вследствие перенесенной COVID-19. Данные по корреляции между шкалами методик указывают на направление возможной психопрофилактической работы с реконвалесцентами.

Заключение. Результаты исследования показали, что у молодых пациентов без сопутствующих заболеваний, перенесших COVID-19, даже при легком и малосимптомном течении, могут развиваться такие психосоматические последствия, как дистресс, тревога, соматизация и некоторые другие. Причины, продолжительность, потенциальные факторы риска их развития необходимо в дальнейшем изучать, тем не менее своевременно проведенные профилактические и лечебно-диагностические мероприятия, учитывающие индивидуальные особенности пациента, могут оказать положительное влияние.

Обоснование. Среди всех групп пациентов с вирус-ассоциированным острым повреждением легких при гриппозной инфекции наиболее тяжелое течение отмечают у пациентов с иммуносупрессией. При этом, несмотря на изученный механизм течения сочетанной патологии, вопрос о применении терапии у данной группы пациентов остается актуальным.

Цель — изучить особенность течения острого повреждения легких при гриппозной инфекции со вторичной иммуносупрессией в эксперименте для последующей оценки возможности поиска экспериментальной терапии данной сочетанной патологии

Материалы и методы. Эксперименты выполнены на 115 аутбредных мышах-самках. Вирус-ассоциированное острое повреждение легких моделировали с помощью материала, содержащего вирус гриппа A/California/7/09МА (mouse-adapted) (H1N1) pdm09. Экспериментальную иммуносупрессию воспроизводили путем введения метотрексата (в дозе 1,25 мг/кг внутрибрюшинно один раз в 3 дня в течение 3 нед. до инфицирования). Течение патологии оценивали по динамике летальности, уровня сатурации крови, концентрации провоспалительных цитокинов в легких и выраженности повреждения легочной паренхимы.

Результаты. Экспериментальная иммуносупрессия привела к отягощению течения острого повреждения легких у инфицированных животных по таким показателям, как уровень летальности и выраженность повреждения легочной паренхимы. Отмечены изменение динамики величины провоспалительных цитокинов (TNF-á, IL-6, IL-1â) в легких в течение острого повреждения легких и замедленное восстановление функциональной активности легких.

Заключение. Экспериментальная иммуносупрессия способствовала как отягощению течения острого повреждения легких, так и увеличению продолжительности течения патологии. Данные изменения могли быть связаны с нарушением процесса элиминации патогена, а модель сочетанной патологии использована для поиска терапии данных осложнений.

Обоснование. Современная живая гриппозная вакцина содержит вакцинные штаммы на основе актуальных эпидемических вирусов гриппа подтипов А/H1N1, A/H3N2 и B. Вирусы гриппа A/H3N2 наиболее сильно подвержены дрейфовым антигенным изменениям, в связи чем данный компонент живой гриппозной вакцины необходимо постоянно обновлять. Вакцинные штаммы живой гриппозной вакцины получают методом классической реассортации донора аттенуации и эпидемического вируса в развивающихся куриных эмбрионах. В процессе подготовки вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины отдельные реассортанты могут приобрести различные яично-адаптационные аминокислотные замены в гемагглютинине и нейраминидазе, что может повлиять на биологические свойства вакцинного штамма и тем самым снизить его эффективность в составе живой гриппозной вакцины.

Цель — изучение влияние аминокислотной замены T203I в гемагглютинине на термостабильность гемагглютинина и ростовые характеристики штаммов A/H3N2.

Материалы и методы. Для исследования были подготовлены три пары вакцинных реассортантов сероподтипа A/H3N2, различающиеся по аминокислотной позиции 203 (Thr/Ile) в гемагглютинине. Ростовые свойства вакцинных штаммов исследовали путем культивирования реассортантов в развивающихся куриных эмбрионах при температурах 26–40 °С и в культуре клеток MDCK при 33 °С. Термостабильность гемагглютинина исследуемых вирусов гриппа оценивали путем определения их способности к агглютинации 1 % куриных эритроцитов после воздействия повышенных температур в диапазоне 37–70 °С.

Результаты. Приобретенная в процессе подготовки вакцинных штаммов аминокислотная замена T203I в гемагглютинине не влияет на температурочувствительность вирусов, увеличивает способность штаммов к росту при пониженных температурах. Кроме того, такие штаммы обладают более высокой репродуктивной активностью в культуре клеток MDCK по сравнению со штаммами без данной мутации. Выявлено, что гемагглютинин реассортантов с Ile в позиции 203 значительно более термостабилен, чем с Thr 203.

Заключение. Полученные нами данные свидетельствуют, что аминокислотная замена T203I в гемагглютинине у современных вирусов гриппа A/H3N2 улучшает ростовые характеристики in ovo и в культуре клеток MDCK, а также повышает термостабильность гемагглютинина вирусов.

Обоснование. Попадающие в респираторный тракт патогены, в том числе вирусные частицы, выводятся из организма при помощи мукоцилиарного клиренса и фагоцитирующих клеток иммунной системы. Сведения о том, какие именно фагоциты отвечают за интернализацию вирусных частиц в слизистой оболочке главного бронха, необходимы как для понимания механизмов противовирусного иммунного ответа, так и для разработки стратегии регуляции противовирусного иммунитета.

Цель — определить роль рецептор-связывающего домена SARS-CoV-2 в активации нейтрофил-опосредованного ответа, формирующегося в слизистой оболочке главного бронха мышей после введения частиц размером 100 нм.

Материалы и методы. Мыши линии C57BL/6 получали орофарингеально флуоресцентные частицы размером 100 нм в растворе рецептор-связывающего домена вируса SARS-CoV-2. Через 24 ч главный бронх мыши окрашивали при помощи флуоресцентно меченных антител. Трехмерные изображения слизистой оболочки главного бронха получали с использованием конфокального микроскопа. При помощи количественного анализа изображений оценивали фагоцитарную активность нейтрофилов в слизистой оболочке главного бронха.

Результаты. Миграцию нейтрофилов в слизистую главного бронха обнаружили только при введении частиц в растворе рецептор-связывающего домена вируса SARS-CoV-2, но не в фосфатном буфере или в растворе бычьего сывороточного альбумина. Раствор рецептор-связывающего домена вируса SARS-CoV-2 сам по себе также вызывал приток нейтрофилов в слизистую оболочку главного бронха. Мигрировавшие в слизистую оболочку главного бронха в ответ на введение частиц в растворе рецептор-связывающего домена вируса SARS-CoV-2 нейтрофилы принимали активное участие в интернализации частиц.

Заключение. Раствор рецептор-связывающего домена вируса SARS-CoV-2 обладает способностью активировать нейтрофил-опосредованный ответ в слизистой оболочке главного бронха.

Обоснование. Применение системы CRISPR/Cas9 представляется одним из быстро развивающихся направлений в биотехнологии. Данный метод был использован для получения клонов клеточной линии человеческого происхождения с нокаутом одного или нескольких генов семейства IFITM, являющихся факторами рестрикции гриппозной инфекции. Ранее было показано, что амфотерицин В способствует увеличению гриппозной инфекции за счет блокировки функции IFITM3.

Цель — оценить влияние амфотерицина В на чувствительность клеток с нокаутом генов семейства IFITM к инфекции вирусом гриппа А.

Методология. Клетки WI-38 VA-13 и их мутантные клоны с нокаутом гена IFITM3 (клон F3) или генов IFITM1, IFITM3 (клон Е12) заражали вирусом гриппа A/PR/8/34 (H1N1) в присутствии или отсутствие амфотерицина В. Через 48 ч после заражения отбирали культуральную среду для определения инфекционной активности вируса методом титрования в клеточной культуре MDCK, а также гемагглютинирующей активности вируса. Зараженные клетки окрашивали флуоресцентно меченными антителами против вирусного белка NP и определяли количество инфицированных клеток методом проточной цитометрии.

Результаты. Добавление амфотерицина В повышало гемагглютинирующую и инфекционную активность вируса при его внесении в клеточную культуру WI-38 VA-13, а для клонов с нокаутом генов IFITM разница была незначительная. Аналогичное соотношение было получено для доли зараженных клеток.

Заключение. Мутантные клетки с нокаутом одного или нескольких генов семейства IFITM были одинаково чувствительны к гриппозной инфекции вне зависимости от добавления амфотерицина В, что подтверждает решающее значение дефекта в белке IFITM3 в повышении пермиссивности клеток к вирусу гриппа А.

Обоснование. Пациенты с онкологическими заболеваниями подвержены развитию инфекционных осложнений, которые значительно отягощают течение основного заболевания и ухудшают качество жизни больных. Возникновению инфекций в значительной мере способствует иммунодепрессия, связанная с применением цитостатических препаратов, высокодозной химиотерапией и трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток у онкогематологических больных. Среди возбудителей инфекций значительную роль придают респираторным вирусам, особенно вирусам гриппа. Актуальность данной проблемы многократно возросла в связи с пандемией COVID-19.

Цель — изучить особенности течения респираторных, в том числе коронавирусных (сезонных и COVID-19), инфекций у онкологических и онкогематологических больных в период госпитализации и в амбулаторно-поликлинических условиях.

Материалы и методы. Частоту и течение респираторных вирусных инфекций изучали у пациентов с онкологическими заболеваниями, находившихся под диспансерным наблюдением в поликлинике г. Кировска Ленинградской области. Ретроспективный анализ частоты и особенностей течения коронавирусной инфекции, вызванной HCoVs (OC43, 229E, NL63, HKU1), проводили у больных, находившихся на лечении в клиниках РосНИИ гематологии и трансфузиологии. Проспективное исследование коронавирусной инфекции COVID-19 выполнено у пациентов, госпитализированных в РосНИИ гематологии и трансфузиологии и Кировскую межрайонную больницу Ленинградской области, в период ее перепрофилироания в специализированный инфекционный стационар.

Результаты. Коронавирусная инфекция, вызванная HCoVs (OC43, 229E, NL63, HKU1), чаще протекает у онкогематологических больных в ассоциации с другими респираторными вирусами. При выявлении SARS-CoV-2 у госпитализированных больных необходимо переводить их в специализированные инфекционные стационары. Лечение пациентов с основным заболеванием может быть возобновлено после получения отрицательных результатов на SARS-CoV-2.

Заключение. Респираторные вирусные инфекции относятся к факторам риска у онкологических и онкогематологических больных. Амбулаторные онкологические и онкогематологические больные подлежат диспансерному наблюдению, им необходимо уделять особое внимание в период пандемии COVID-19, вспышек гриппа и других вирусных инфекций.

Разработка универсальной гриппозной вакцины с широким спектром и длительностью действия — одна из актуальных проблем здравоохранения. В данной работе продемонстрированы этапы оптимизации иммуногена, охватывающего эпитопы M2e вирусов гриппа А, циркулирующих в природном резервуаре, а также создание прототипа универсальной гриппозной вакцины с последующей количественной и качественной оценкой индуцируемого анти-M2e-ответа в эксперименте на хорьках.

Обоснование. Современные отечественные живые гриппозные вакцины производят в развивающихся куриных эмбрионах. При пассировании в эмбрионах вирус, выделенный из дыхательных путей человека, адаптируется к рецепторам, наиболее распространенным в эмбрионах. Популяция вируса на любом пассаже в куриных эмбрионах гетерогенна и содержит варианты вирусов с тем или иным набором адаптационных замен. Перед подготовкой вакцинного штамма клонируют популяции «дикого» вируса и анализируют генетическую последовательность гемагглютинина и нейраминидазы клонов. От правильного выбора варианта вируса зависят ростовые характеристики вакцинного штамма и его антигенные свойства.

Цель — выбор варианта вируса подтипа H3N2 для подготовки вакцинного реассортанта на основе данных о составе популяции и оценки его ростовых свойств.

Материалы и методы. Вирусы клонировали в развивающихся куриных эмбрионах, секвенировали гены гемагглютинина и нейраминидазы полученных клонов. На основе вариантов, выбранных по результатам анализа популяции, методом реассортации в развивающихся куриных эмбрионах получали штаммы живой гриппозной вакцины. Оценивали ростовые характеристики штаммов, фенотип в развивающихся куриных эмбрионах и антигенные свойства в двустороннем тесте реакции торможения гемагглютинации.

Результаты. Рекомендованный Всемирной организацией здравоохранения на эпидемический сезон 2019/2020 гг. вирус гриппа A/Kansas/14/2017 на седьмом пассаже в развивающихся куриных эмбрионах приобрел пару замен D190N + N246T, доминирующих в популяции. Из популяции A/Kansas/14/2017-подобного штамма A/Brisbane/34/2018 с третьего пассажа в развивающихся куриных эмбрионах удалось получить вариант вируса с заменами G186V + S219Y в гемагглютинине. Ростовые характеристики штамма на основе A/Kansas/14/2017 (пассаж Е7) значительно уступали характеристикам штамма на основе A/Brisbane/34/2018 (пассаж Е3) при отсутствии различий в антигенных свойствах.

Заключение. Вариант яичной адаптации гемагглютинина G186V у штаммов клайда 3с.3а является предпочтительным при подготовке штаммов живой гриппозной вакцины, вариант N246T — неоптимальным. При подготовке штаммов необходимо анализировать состав популяции вируса путем клонирования и выбирать для подготовки штаммов наиболее оптимальный вариант. Закрепление яично-адаптационных замен в пассированных вариантах вируса не всегда оптимально для штаммов живой гриппозной вакцины, в связи с чем для начала работы над штаммом предпочтительно использовать популяцию, наиболее близую к исходному варианту.

Обоснование. Грипп — опасное, широко распространенное, социально значимое инфекционное заболевание, которое уносит десятки тысяч жизней в период ежегодных эпидемий, а также наносит существенный ущерб экономике страны. Наиболее эффективное средство борьбы с вирусом гриппа — вакцинопрофилактика населения. Из-за высокой изменчивости вирусов гриппа штаммовый состав гриппозных вакцин необходимо обновлять практически ежегодно. В этой связи актуальной задачей является усовершенствование существующих гриппозных вакцин с целью расширения их спектра действия. Один из перспективных подходов заключается в направленной индукции гуморального иммунного ответа к консервативным линейным эпитопам нейраминидазы вируса гриппа А.

Цель. Настоящий проект направлен на оценку иммуногенности и кросс-протективной активности консервативных эпитопов нейраминидазы с целью отбора перспективных мишеней для целенаправленного конструирования гриппозных вакцин широкого спектра действия.

Материалы и методы. Пептиды, соответствующие линейным В-клеточным эпитопам нейраминидазы, были химически синтезированы de novo. Пептиды конъюгировали с гемоцианином лимфы улитки. Иммунизировали мышей линии CBA, подвергали их челлендж-инфекции вирусами A/PR/8/34 (H1N1) и A/Philippines/2/1982 (H3N2) в дозе 3 LD₅₀. Выживаемость животных определяли в течение 14 дней после заражения. Иммуногенность пептидов оценивали в стандартном иммуноферментном анализе с использованием в качестве антигена рекомбинантных белков нейраминидазы вирусов А/California/07/2009 (H1N1) и А/Hong Kong/4801/2014 (H3N2).

Результаты. Иммунизация нейраминидазы пептидами MNPNQKIITIGS и ILRTQESEC, но не DNWKGSNRP защищала мышей от летальности, вызванной вирусом H1N1 и/или H3N2. При этом защитный потенциал пептидов коррелировал с уровнями антинейраминидазных антител после иммунизации.

Заключение. Наличие кросс-протективного потенциала у двух консервативных линейных В-клеточных эпитопов нейраминидазы вируса гриппа А (MNPNQKIITIGS и ILRTQESEC) позволяет рекомендовать их в качестве мишени для разработки противогриппозной вакцины широкого спектра действия.

Обоснование. Несмотря на глобальное распространение новой коронавирусной инфекции (COVID-19), вызванной вирусом SARS-CoV-2, механизмы патогенеза тяжелых инфекций остаются недостаточно изученными. Не выяснена также роль коморбидности с другими сезонными вирусными инфекциями, включая грипп, в патогенезе тяжелого течения COVID-19.

Материалы и методы. В настоящем исследовании использованы сыворотки крови, оставшиеся после текущих лабораторных исследований пациентов с разной степенью тяжести COVID-19. Изучено 28 парных проб, полученных при поступлении пациентов в стационар и через 5–7 дней пребывания в стационаре. Парные сыворотки пациентов с COVID-19 были протестированы на антитела к вирусам гриппа А и В. Наличие антител IgG, специфичных к спайковому (S) белку SARS-CoV-2, изучали с помощью иммуноферментного анализа. Оценивали также сывороточную концентрацию С-реактивного белка и нейтрофильно-лимфоцитарное отношение в день госпитализации.

Результаты. По крайней мере 4-кратное увеличение уровня сывороточных антител IgG к S-белку SARS-CoV-2 обнаружено как у пациентов с подтвержденной полимеразной цепной реакцией COVID-19, так и без подтверждения. Из 18 пациентов со средней и тяжелой формами COVID-19 в шести случаях выявлено как минимум 4-кратное повышение уровня антител к гриппу A/H1N1, в одном — к гриппу A/H3N2 и в двух — к вирусу гриппа В. Лабораторные показатели в этих двух группах характеризовались значительным увеличением сывороточной концентрации С-реактивного белка и нейтрофильно-лимфоцитарного отношения по сравнению с группой пациентов с умеренной степенью тяжести COVID-19.

Заключение. С помощью серологической диагностики можно дополнительно выявлять случаи коронавирусной инфекции, когда вирус не обнаружен методом полимеразной цепной реакции. При среднетяжелых и тяжелых случаях COVID-19 обнаружены случаи коинфицирования с вирусами гриппа А и В. Результаты подтверждают необходимость противогриппозной иммунизации в период пандемии COVID-19. Скрининг на вирус гриппа может значительно улучшить тактику лечения пациента, поскольку существуют рекомендованные противовирусные препараты (ингибиторы нейраминидазы).