ИЗУЧЕНИЕ ПРОДУКЦИИ НЕТОКСИЧНОГО ВАРИАНТА ДИФТЕРИЙНОГО ТОКСИНА CRM197 В КЛЕТКАХ ESCHERICHIA COLI



Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация

Цели исследования: синтез гена, кодирующего нетоксичный вариант ди-терийного токсина CRM197, исследование его экспрессии в клетках Escherichia coli, получение штамма бактерий - продуцента рекомбинантного CRM197, разработка метода очистки данного белка из биомассы бактерий. Материалы и методы исследования. Ген белка CRM197 синтезировали химико--ерментативным методом. Конструирование и сборку экспрессионного вектора проводили стандартными методами генетической инженерии. Продукцию CRM197 клетками Escherichia coli изучали методами электро-ореза в полиакриламидном геле и иммуноблоттинга. Рекомбинантный CRM197 выделяли с помощью металлохелатной хроматогра--ии. Результаты. Применение экспрессионного вектора р^ПП позволило получить продукцию рекомбинантного белка при понижении температуры культивирования клеток с 37 до 16°С. Разработан метод очистки рекомбинантного CRM197, получен препарат белка с чистотой 97%, который имел молекул рную массу 60 кДа и связывался в иммуноблоте с поликлональными антителами к ди-терийному токсину. Заключение. Успешная продукция рекомбинантного белка CRM197 была достигнута с использованием вектора pColdll при пониженной температуре культивирования клеток. Очищенный белок обладает ну-клеазной активностью, что свидетельствует о его правильном -олдировании. Получение очищенного ре комбинантного CRM197 позволит использовать данный белок при конструировании конъюгатных вакцин.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

И В Духовлинов

ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» ФМБА России

Е Г Богомолова

ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» ФМБА России

О А Добровольская

ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» ФМБА России

С А Ищук

ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» ФМБА России

Е А Федорова

ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» ФМБА России

НА A Климов

ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» ФМБА России

А С Симбирцев

ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» ФМБА России

член-корреспондент РАН

Список литературы

  1. Lory S., Carroll S.F., Collier R.J. Ligand interactions of diphtheria toxin. II. Relationships between the NAD site and the P site // J. Biol. Chem. 1980. Vol. 255, No 24. P. 12016-12019.
  2. Uchida T, Pappenheimer A.M., Greany R. Diphtheria toxin and related proteins. I. Isolation and properties of mutant proteins serologically related to diphtheria toxin // J. Biol. Chem. 1973. Vol. 248, No 11. P. 3838-3844.
  3. Durando P, Faust S.N., Fletche M, Krizova P, Torres A., Welte T. Experience with pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine (conjugated to CRM197 carrier protein) in children and adults // Clin. Microbiol. Infect. 2013. Vol. 19 (suppl. 1). P. 1$9.
  4. Avci F.Y, Li X., Tsuji M, Kasper D.L. A mechanism for glycoconjugate vaccine activation of the adaptive immune system and its implications for vaccine design // Nat. Med. 2011. Vol. 17, No 12. P. 1602-1609.
  5. Burtnick M.N., Shaffer T.L., Ross B.N., Muruato L.A., Sbrana E, DeShazer D, Torres A.G., Brett P.J. Development of Subunit Vaccines that Provide High Level Protection and Sterilizing Immunity Against Acute Inhalational Melioidosis // Infect. Immun. 2017. Nov. 6. pii: IAI.00724-17. doi: 10.1128/ IAI.00724-17.
  6. Ilyina N, Kharit S., Namazova-Baranova L., Asatryan A., Benashvili M., Tkhostova E., Bhusal C., Arora A.K. Safety and immunogenicity of meningococcal ACWYCRM197-conjugate vaccine in children, adolescents and adults in Russia // Hum. Vaccin. Immunother. 2014. Vol. 10, No 8. P. 2471-2481.
  7. Allison E.B., Turner J.E., Gerson H.Y, So, D.J., Krasznai A.J., Hilaire S, Gerson D.F. Novel polysaccharide-protein conjugates provide an immunogenic 13-valent pneumococcal conjugate vaccine for S. pneumoniae // Synth. Syst. Biotechnol. 2017. Vol. 2, No 1. P. 49$58.
  8. Dateoka S., Ohnishi Y., Kakudo K. Effects of CRM197, a specific inhibitor of HB-EGF, in oral cancer // Med. Mol. Morphol. 2012. Vol. 45, No 2. P. 91-97.
  9. Dateoka S., Kakudo K. CRM197, a specific inhibitor of HB-EGF // Med. Mol. Morphol. 2013. Vol. 415, No 1. P. 83-87.
  10. Schenk G.J., Haasnoot P.C., Centlivre M., Legrand N., Rip J., de Boer A.G., Berkhout B. Efficient CRM197-mediated drug targeting to monocytes // J. Control. Release 2012. Vol. 158, No 1. P. 139-147.
  11. Rappuoli R. Isolation and characterization of Corynebacterium diphtheria nontandem double lysogens hyperproducing CRM197 // Appl. Environ. Microbiol. 1983. Vol. 46, No 3. P. 560-564.
  12. Zhou J., Petracca R. Secretory expression of recombinant diphtheria toxin mutants in B. Subtilis // J. Tongji Med. Univ. Tong Ji Yi Ke Xue Xue Bao. 1999. Vol. 19, No 4. P. 253-256.
  13. Retallack D.M., Jin H., Chew L. Reliable protein production in a Pseudomonas fluorescens expression system // Protein Expr. Purif. 2012. Vol. 81, No 2. P. 157-165.
  14. Majumder K. Ligation-free gene synthesis by PCR: synthesis and mutagenesis at multiple loci of a chimeric gene encoding OmpA signal peptide and hirudin // Gene. 1992. Vol. 110, No 1. P. 89-94.
  15. Studier FW. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli // Methods Mol Biol. 2014. Vol. 1091, No 1. P. 17-32.
  16. Laemmly U.K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4 // Nature. 1970. No 227. P. 680-685.
  17. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193, No 1. P. 265 -275.
  18. Phadtare S., Severinov K. RNA remodeling and gene regulation by cold shock proteins // RNA Biol. 2010. Vol. 7, No 6. P. 788-795.
  19. Takara Cold Shock Expression System pCold™ DNA. Product Manual. http://www.takara-bio.com.
  20. Chang M.P., Baldwin R.L., Bruce C., Wisnieski B.J. Second cytotoxic pathway of diphtheria toxin suggested by nuclease activity // Science. 1989. Vol. 246, No 4934. P. 1165-1168.
  21. Bruce C., Baldwin R.L., Lessnick S.L., Wisnieski B.J. Diphtheria toxin and its ADP-ribosyltransfer-ase-defective homologue CRM197 possess deoxyribonuclease activity // Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 1990. Vol. 87, No 8. P. 2995-2998.
  22. Jia B., Co J. High-throughput recombinant protein expression in Escherichia coli: current status and future perspectives // Open Biol.2016. Vol. 6, No 8. pii: 160196. doi: 10.1098/rsob.160196.
  23. Srnrensen H.P, Mortensen K.K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli // J. Biotechnol. 2005. Vol. 115, No 2. Р. 113-128.
  24. Peleg Y, Unger T. Application of high-throughput methodologies to the expression of recombinant proteins in E. coli // Methods Mol. Biol. 2008. Vol. 426. P. 197-208.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML

© Духовлинов И.В., Богомолова Е.Г., Добровольская О.А., Ищук С.А., Федорова Е.А., Климов Н.A., Симбирцев А.С., 2018

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 74760 от 29.12.2018 г.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах