Biotesting methods for the detection of drugs in the aquatic environment

Full Text

СОКРАЩЕНИЯ:

ПДК — предельно допустимая концентрация.

ВВЕДЕНИЕ

Фармацевтические препараты как новые загрязняющие вещества привлекли пристальное внимание ученых во всем мире за последние два десятилетия. Они широко используются как в медицине, так и в ветеринарии и были выявлены в исследованиях различных водных сред, таких как сточные воды, поверхностные и подземные воды, а в последнее время также и в питьевой воде [1]. Такое активное использование лекарственных средств способствует их постоянному и несанкционированному попаданию в окружающую среду. Особенно много фармацевтических соединений обнаруживается в сточных водах, что в последнее время вызывает всеобщее беспокойство из-за их способности влиять на качество водоемов, экосистем и здоровье человека [2, 3]. Наибольшую опасность оказывают фармацевтические отходы, в составе которых есть антибиотики, препараты с гормональными, психотропными и наркотическими действиями и другие физиологически активные вещества [4–6].

В группу антибиотиков входят β-лактамы, макролиды, фторхинолоны, тетрациклины и сульфаниламиды, а также многие другие классы, в состав которых входит амоксициклин. Амоксицилин является одним из наиболее часто используемых лекарств, которое способно убивать или подавлять рост бактерий для борьбы с бактериальными инфекциями. В последнее время, в связи с глобальным ростом численности населения и повышением спроса на животный белок, потребление антибиотиков растет и достигло огромных объемов. Так, например, Китай, который является крупнейшим производителем, экспортером и потребителем антибиотиков во всем мире, потребляет огромное количество антибиотиков. В 2013 году общее потребление 36 отдельных антибиотиков в Китае составило 92 700 тонн, а количество антибиотиков, выделенных людьми и животными, по оценкам, составило 54 000 тонн, причем 53 800 тонн попало в окружающую среду [7]. В России на фоне пандемии COVID-19 использование антибиотиков человеком существенно выросло [8].

Как известно, антибиотики не могут быть полностью метаболизированы человеком и животными, а также полностью удалены на очистных сооружениях [9, 10], в результате чего они попадают в окружающую среду, в частности в водную среду, как в неизменном состоянии, так и в качестве их метаболитов.

Антибиотики в сточных водах водоканалов находятся в относительно высоких концентрациях, от нескольких сотен нг/л до нескольких десятков мкг/л. Так, например, концентрации амоксицилина в притоках и стоках находятся в диапазоне 200–6,516 нг/л, что указывает на то, что он является серьезным загрязнителем окружающей среды. Среди водных видов, подверженных воздействию, выявленных к настоящему времени относятся: нецелевые бактерии (Anabaena и Vibrio fischeri), водоросли (Isochrysis galbana и Pseudokirchneriella subcapitata), ракообразные (Daphnia magna), рыбы (Oryzias melastigma и Danio rerio) [11]. Таким образом, токсичность антибиотиков варьируется в зависимости от тестовых организмов и типов антибиотиков. Однако виды с низким трофическим уровнем, например, цианобактерии и водоросли, демонстрируют более высокую чувствительность к антибиотикам, чем организмы с более высоким трофическим уровнем, например, ракообразные и рыбы.

В группу стероидов входят искусственные эстрогены (17α-этинилэстрадиол), натуральные эстрогены (эстрон, 17β-эстрадиол, эстриол) и фитоэстрогены (изофлавоноиды, лигнаны) [12]. Гормональные препараты, а именно 17β-эстрадиол используют для эстрогенной терапии в климактерическом периоде и при хирургической менопаузе, в том числе после овариэктомии, лучевой кастрации и т.п. Выделяются данные гормоны в виде конъюгатов или в свободной форме, в связи с чем конъюгированные стероидные эстрогены могут легко биотрансформироваться в свободные формы. Основной путь выведения конъюгатов – через глюкурониды или сульфаты с мочой. В конечном итоге они секретируются в окружающую среду [6].

В результате постоянное попадание загрязненных эстрогенами сточных вод в водоемы даже в низких концентрациях (от нг/л до мкг/л) [7] может привести к неблагоприятным последствиям для водной жизни. По результатам многочисленных исследований установлено, что наиболее часто в водных объектах встречаются эстрогены, часть которых может производиться непосредственно гидробиотой. Так, например, в исследованиях Sanderson показано, что концентрация в воде эстрогенов в диапазоне 1–10 нг/л приводит до 100% феминизации и гермафродитизму у рыб мужского пола, что существенно снижает популяцию [13].

Данные фармполлютанты по трофическим цепям, а также при употреблении загрязнённой воды могут, попадая в организм человека, оказывать негативное воздействие на его здоровье [10]. Однако механизмы влияния на человека подобных соединений, поступающих из окружающей среды, малоизучены.

Учитывая обнаружение лекарственных средств и их метаболитов в различных водных системах и известные нежелательные последствия для здоровья и экологии, в 2021 году Роспотребнадзор сообщил, что в России вводятся обязательные нормативы по содержанию в питьевой воде гормонов и ряда антибиотиков. Для антибиотика амоксициллин предельно допустимая концентрация (ПДК) в воде составила 0,000078 мг/л, а для гормональных препаратов (17-альфа-этинилэстрадиол) – 0,000000035 мг/л [14].

Для их удаления из водной среды было предложено множество методов, таких как электрохимическое окисление, адсорбция, фотокатализ, мембранная filtration и химическое окисление с расширенными возможностями и многие другие методы. Тем не менее, эти методы имеют ряд недостатков, таких как высокая стоимость, сложность эксплуатации и воздействие на окружающую среду [15].

Однако установить методики для индивидуальных органических соединений, поступающих на сооружения биологической очистки городских станций аэрации, достаточно затрудненно, и в таких ситуациях необходимо проведение дополнительных экспериментальных исследований с целью установления их токсичности и предупреждения торможения процессов биологической очистки.

Одним из принятых экспериментальных методов контроля токсичности является метод биотестирования. Данный метод основан на оценке степени опасности исследуемого объекта по реакции живых организмов: гибель тест-объектов (выживаемость), снижение или стимуляция интенсивности размножения, уменьшение подвижности, подавление биохимических процессов, изменение характера поведения, изменение пигментации. Информация, полученная при использовании методов биотестирования, отражает комплексное токсическое воздействие всех содержащихся в изучаемой среде токсикантов [16, 17]. Известно, что организмы обладают разной чувствительностью к токсикантам [18]. В связи с этим достоверность результатов биотестирования изучаемого объекта зависит от примененных тест-организма и тест-функций [19, 20].

Изучалась возможность использования метода биотестирования с применением в качестве тест-организмов черенков и проростков высших растений для косвенной оценки устойчивости антибиотиков окситетрациклина, тилозина и цефтриаксона в водной среде [21]. Для экотоксикологической оценки содержания в воде тетрациклина и цефалексина использовались в качестве тест-организмов рачки дафнии и растения Lehidium sativum [22].

Таким образом, весьма актуальным является разработка новых методов оценки содержания антибиотиков и гормонов в водопроводной воде.

Целью нашего исследования было проведение оценки токсичности водопроводной воды (г. Санкт-Петербург) при наличии в ней антибиотика и гормона методами биотестирования для создания наиболее чувствительного набора биотестов, с помощью которых можно адекватно и в короткие сроки оценить качество питьевой воды (модельные растворы с концентрацией антибиотика и гормона близкой к ПДК).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовался амоксициллин-антибиотик группы полусинтетических пенициллинов широкого спектра действия, который представляет собой 4-гидроксильный аналог ампициллина, а также 17β-эстрадиол, который является эстрогенным стероидным гормоном. С этими препаратами были приготовлены водные растворы на основе водопроводной воды.

В качестве тест-культур были использованы следующие гидробионты: дафнии, инфузории и зеленые протококковые водоросли хлорелла.

Рачки дафнии считаются одними из наиболее чувствительных тест-организмов к токсическому воздействию загрязняющих веществ. Они имеют относительно короткий жизненный цикл, процедура биотестирования с их использованием не требует специального дорогостоящего оборудования и может производиться в обычном лабораторном помещении. Критерием острой токсичности на дафниях являлась гибель более 50% особей в тестируемых пробах за 48 часов по сравнению с контролем (А, %) [23].

Установлено, что по своей чувствительности к воздействию токсичных веществ инфузории близки к чувствительности тканей человека и животных, поэтому их широко используют при биотестировании. Метод определения токсичности водной среды основан на способности инфузорий реагировать на присутствие в водной среде веществ, представляющих опасность для их жизнедеятельности, и направленно перемещаться по градиенту концентраций (в направлении изменения концентраций) этих веществ (хемотаксическая реакция), избегая их вредного воздействия [24]. Критерием токсичности на инфузориях служит индекс токсичности (Т) – безразмерная величина, принимающая значения от 0 до 1 в соответствии со степенью токсичности анализируемой пробы. По величине индекса анализируемые пробы классифицируются по степени их токсичности на 3 группы: допустимая степень токсичности (0,00<Т≤0,40); умеренная степень токсичности (0,40<Т≤0,70); высокая степень токсичности (Т>0,70).

Из водорослей в качестве тест-культуры, наиболее часто применяется зеленая одноклеточная водоросль Хлорелла (Chlorella vulgaris Beijer), которая распространена практически повсеместно, что делает ее доступным биологическим объектом [25]. Водоросли широко используются в качестве тест-организмов [26]. Определение острой токсичности проб по изменению оптической плотности тест-культуры зеленой протококковой водоросли хлорелла (Chlorella vulgaris Beijer) основано на регистрации различий в оптической плотности тест-культуры водоросли хлорелла, выращенной на среде, не содержащей токсических веществ (контроль), и в тестируемых водных вытяжках (опыт), в которых эти вещества могут присутствовать [27]. Измерение оптической плотности суспензии водоросли позволяет оперативно контролировать изменение численности клеток в контрольном и опытном вариантах токсикологического эксперимента, проводимого в специализированном многокюветном культиваторе КВМ-05. Критерием токсичности воды является снижение на 20% и более (подавление роста) или увеличение на 30% и более (стимуляция роста) величины оптической плотности культуры водоросли, выращиваемой в течение 22 часов световой экспозии на тестируемой воде по сравнению с ее ростом на контрольной среде, приготовленной на дистиллированной воде. Пробы были проанализированы в ряде разбавлений, кратных десяти.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы STATISTICA, а полученные данные выражали в виде средних значений со стандартной ошибкой. В ходе проведения анализа использовали непараметрические методы статистики. Критическое значение уровня статистической значимости принимали равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Комплексное изучение лекарственных средств (амоксициллина и 17β-эстрадиола) позволило установить чувствительность разных методов биотестирования. В таблице 1 представлены результаты исследования выживаемости дафний в средах с различными концентрациями антибиотика и гормона.

 

Табл. 1. Результаты биотестирования на тест-объекте Daphnia magna Straus раствора амоксициллина в диапазоне доз от 0,000078 мг/л до 0,000000078 мг/л и 17β-эстрадиола в диапазоне доз от 0,00001мг/л до 0,00000001 мг/л Table 1. The results of biotesting on the Daphnia magna Straus test object of amoxicillin solution in the dose range from 0.000078 mg/l to 0.000000078 mg/l and 17β-estradiol in the dose range from 0.00001 mg/l to 0.00000001 mg/l
Концентрация, мг/л	Кратность разбавления	Гибель тест-объекта,%	Токсичность
Контроль
–	–	0,0	отсутствует
Амоксициллин
0,000078	1 (без разбавления)	93,0*	высокая
0,0000078	1:10	0,3	отсутствует
0,00000078	1:100	0,3	отсутствует
0,000000078	1:1000	0,3	отсутствует
17β-эстрадиол
0,00001	1 (без разбавления)	0,0	отсутствует
0,000001	1:10	0,0	отсутствует
0,0000001	1:100	0,0	отсутствует
Примечание: *– отличия от контрольных значений статистически значимы, при p<0,05 Note: the differences from the control values are statistically significant, at p<0.05

 

Из данных таблицы видно, что амоксициллин вызвал гибель 93% дафний (p<0,05) в растворе с концентрацией 0,000078 мг/л, что соответствовало ПДК. В растворах с концентрациями ниже установленной ПДК, гибель дафний составила менее 1%. При исследовании 17β-эстрадиола в изучаемых растворах, так же, как и в контроле, гибели дафний не наблюдали.

Таким образом, в результате изучения токсичности с использованием представителей пресноводного зоопланктона ветвистоусых рачков дафний было выявлено, что данный тест-объект является чувствительным только в отношении антибиотиков. Поскольку даже в ПДК была обнаружена высокая токсичность дафний. В то же время гормоны не оказывают влияния на выживаемость дафний. Однако их активность в подобных растворах увеличивается. В связи с этим тест-объект не должен быть единственным.

В качестве второго теста-объекта был выбран тест с использованием представителя простейших – ресничных инфузорий. Результаты исследований представлены на рисунке 1. Анализ полученных данных по определению общей токсичности показал, что амоксициллин в концентрации 0,000078 мг/л по степени токсичности относиться к 3 группе (высокая), индекс которой составил 0,75. Плотность инфузорий в исследуемом растворе статистически значимо снизилась на 75,4% по отношению к контролю. С разбавлением концентрации в 10 раз токсичность изучаемого раствора снижается до 2 группы (индекс токсичности 0,52), а плотность тест-объекта уменьшилась в 2 раза (68,8±9,4 при значениях в контроле 143,1±11,7). При 100-м разбавлении (0,00000078 мг/л) отмечали допустимую степень токсичности (1 группа), индекс которой составил 0,14.

 

Рис. 1. Результаты изменения плотности инфузорий Paramecium caudatum в растворах амоксициллина в диапазоне доз от 0,000078 мг/л до 0,000000078 мг/л и 17β-эстрадиола в диапазоне доз от 0,00001мг/л до 0,00000001 мг/л. Примечание: *значимые отличия от фоновых значений, при p<0,05

 

Воздействие 17β-эстрадиола на хематоксическую реакцию инфузорий было более токсичнее, по сравнению с действием антибиотика. Так, действие гормона в диапазоне концентраций от 0,00001 мг/л до 0,0000001 мг/л характеризуется высокой токсичностью (3 группа) с индексом 0,71–0,78. Отмечали 3–4 кратное снижение плотности тест-объекта (в концентрации 0,00001 мг/л число инфузорий составило 34,3±1,3 против контрольных значений 143,1±11,7 (p<0,05)).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о чувствительности инфузорий к антибиотикам и гормонам даже в низких концентрациях, сопоставимых с установленными ПДК.

В следующей серии экспериментов проводили оценку токсического воздействия на водорослях хлорелла. Было выявлено, что рост хлореллы стимулировался низкими концентрациями амоксициллина (0,000078 мг/л) и 17β-эстрадиола (0,00001 мг/л) на 56% и 66% соответственно (p<0,05), оказывая тем самым токсическое действие (рис. 2).

 

Рис. 2. Процентное изменение оптической плотности тест-объекта Chlorella vulgaris Beijer в растворах амоксициллина в диапазоне доз от 0,000078 мг/л до 0,000000078 мг/л (сверху) и 17β-эстрадиола в диапазоне доз от 0,00001мг/л до 0,00000001 мг/л (снизу) по отношению к контролю. Примечание: *значимые отличия от фоновых значений, при p<0,05

 

Этот эффект снижался при уменьшении концентрации исследуемых растворов. Однако 17β-эстрадиол в концентрации 0,000001мг/л (разбавление 1:10) все еще оказывал токсическое действие. Рост хлореллы при этом увеличился на 40% по отношению к контрольным значения. Данные результаты свидетельствуют о том, что гормоны обладают более высоким токсическим действием на зеленые водоросли, чем антибиотики. Однако амоксициллин является не менее токсичным фармполлютантам на эти таксоны, что подтверждается высоким процентом роста водорослей под их воздействием. Концентрации ниже ПДК амоксициллина (0,0000078 мг/л (кратность разбавления 1:10)) не оказывали токсического действия, что, вероятно, связано со свойствами антибиотика, таких как электрофильность, стабильность и гидрофобность.

ВЫВОДЫ

Выявлено, что используемые в биотестировании тест-организмы по своей чувствительности к раствору амоксициллину составляли следующий ряд в порядке убывания: инфузории>дафнии=хлорелла, а по чувствительности к раствору 17β-эстрадиолу – инфузории>хлорелла (табл. 2).

 

Табл. 2. Сводная таблица результатов элюатного биотестирования лекарственных средств Table 2. Summary table of the results of eluate biotesting of medicinal products
Лекарственное средство (разведение)	Daphnia magna Straus	Paramecium caudatum	Chlorella vulgaris Beijer
	Степень токсичности	Группа токсичности	Оценка токсичности
Р-р амоксициллина 0,000078 мг/л (б/р)	Острое токсическое действие	III, высокая степень токсичности	Токсическое действие на тест-объект
Р-р амоксициллина 0,0000078 мг/л (1:10)	Отсутствует	II, умеренная степень токсичности	Отсутствует
Р-р амоксициллина 0,00000078 мг/л (1:100)	Отсутствует	I, допустимая степень токсичности	Отсутствует
Р-р амоксициллина 0,000000078 мг/л (1:1000)	Отсутствует	I, допустимая степень токсичности	Отсутствует
Р-р 17β-эстрадиол 0,00001 мг/л (б/р)	Отсутствует	III, высокая степень токсичности	Токсическое действие на тест-объект
Р-р 17β-эстрадиол 0,000001 мг/л (1:10)	Отсутствует	III, высокая степень токсичности	Токсическое действие на тест-объект
Р-р 17β-эстрадиол 0,0000001 мг/л (1:100)	Отсутствует	III, высокая степень токсичности	Отсутствует
Р-р 17β-эстрадиол 0,00000001 мг/л (1:1000)	–	II, умеренная степень токсичности	Отсутствует

 

Из представленной таблицы мы видим, что антибиотик в установленной Роспотребнадзором ПДК (0,000078 мг/л) оказывает высокую степень токсичности на все изучаемые тест-культуры. Концентрации ниже ПДК не оказывают токсического действия на такие тест-культуры, как дафнии и хлорелла. Однако инфузории со снижением концентрации амоксициллина имела дозозависимое снижение токсичности, которая в тысячекратном разбавлении снизилась до допустимой.

При изучении токсичности воды, с содержанием гормона 17β-эстрадиола, самой чувствительной тест-культурой также оказались инфузории (Paramecium caudatum). Токсическое действие на тест-объект хлорелла (Chlorella vulgaris Beijer) исчезало при концентрации раствора 17β-эстрадиол при стократном разбавлении исследуемого раствора (0,0000001 мг/л). Дафнии (Daphnia magna Straus) вовсе оказались не чувствительны к данному классу лекарственных средств.

Таким образом, наиболее чувствительной тест-культурой к антибиотикам (раствор амоксициллина) и гормонам (17β-эстрадиол) являются инфузории (Paramecium caudatum). В связи с чем, предложенные методы биотестирования для обнаружения лекарственных средств в водной среде являются перспективным направлением в оценке токсичности фармполлютантов в сточных водах.

About the authors

Anastasiya A. Kryazhevskikh

State Scientific Research Testing Institute of Military Medicine of the Ministry of Defense of the Russian Federation;Saint Petersburg State Chemical and Pharmaceutical University

Author for correspondence.
Email: gniiivm_15@mil.ru

Research Assistantat the Research Department, Master Student

Russian Federation, Saint Petersburg

Victoria I. Bardina

St. Petersburg Research Center for Environmental Safety (SRCES)

Email: vicula128@mail.ru

Researcher

Russian Federation, Санкт-Петербург

Nataliya A. Sklyarova

Saint Petersburg State Chemical Pharmaceutical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: natalia.sklyarova@pharminnotech.com
SPIN-code: 9473-6506

Ph.D. in Engineering Sciences, Associate Professor at the Industrial Ecology Department

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files