The study of indicators of authenticity and goodness of flowers of narrow-leaved lavender (Lavandula angustifolia L.)

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Лаванда узколистная (Lavandula angustifolia Mill.) представляет собой широко культивируемый вечнозеленый полукустарник из семейства яснотковые (Lamiaceae Martinov). L. angustifolia, прежде всего, известна в качестве лекарственного и ароматического растения, которое находит применение в пищевой и парфюмерно-косметической промышленности [1]. В традиционной медицине L. angustifolia имеет множество применений, в частности, для лечения ревматизма, мигрени и сердечно-сосудистых заболеваний [2]. В дополнение к традиционному применению, L. angustifolia обладает противогрибковыми и антибактериальными [3], цитотоксическими [4], антисептическми, противовоспалительными и обезболивающими свойствами [5]. Сырье L. angustifolia, а также продукты на ее основе (например, эфирное масло) входят в состав Европейской и Британской фармакопеи.

К основным компонентам L. angustifolia относятся фенольные соединения и терпеноиды, которые обеспечивают основные фармакологические свойства данного растения [3]. Фенольные соединения представлены флавоноидами (производные апигенина, лютеолина и кверцетина), фенольными кислотами (розмариновая кислота, производные феруловой и кофейной кислоты) и кумаринами (кумарин и герниарин) [6–7]. Терпеноиды являются основой эфирного масла L. angustifolia, к основным компонентам которого относятся линалоол и линалил-ацетат [8].

В данном исследовании были изучены количественное содержание флавоноидов и ВЭЖХ профиль вторичных метаболитов в цветках L. angustifolia наряду с микроскопическим анализом основных диагностических признаков данного вида сырья для расширения номенклатуры фармакопейного растительного сырья РФ.

Цель исследования – изучение показателей подлинности и доброкачественности сырья цветков лаванды узколистной (Lavandula angustifolia L.). Ключевые показатели подлинности были установлены с помощью анализа морфологических и анатомо-диагностические признаков цветков. В качестве основы для определения показателей доброкачественности сырья предложены вещества полифенольной природы. Данная работа включает в себя описание методов и новых подходов к количественному определению содержания суммы флавоноидов, качественному анализу ВЭЖХ профиля полифенольных вторичных метаболитов и изучению основных макроскопических и анатомо-диагностических признаков цветков данного растения. Полученные данные служат основой для разработки рекомендаций по стандартизации нового вида лекарственного растительного сырья – цветков лаванды узколистной для Государственной Фармакопеи Российской Федерации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сырье L. angustifolia было собрано на базе практики Ташкентского Фармацевтического Института, Бостанлыкский район Ташкентской области, Узбекистан.

Для качественного и количественного анализа полифенольных вторичных метаболитов L. angustifolia использовали ВЭЖХ-анализ и дифференциальную УФ-спектрофотометрию, соответственно. Перед анализом надземную часть L. angustifolia сушили на воздухе при температуре 45 °C до постоянной массы.

Количественное определение флавоноидов в пересчете на рутин

1,0 г измельченного сырья помещали в круглодонную колбу емкостью 250 мл, после чего добавляли 100 мл 80%-го этилового спирта. Колбу соединяли с обратным холодильником и нагревали на кипящей водяной бане в течение 90 минут при периодическом помешивании. Колбу дополнительно охлаждали в течение 20 минут до комнатной температуры и экстракт фильтровали через бумажный фильтр. 1,0 мл полученного экстракта перенесли в мерную колбу вместимостью 25 мл. В колбу добавляли 4,0 мл 2%-го раствора хлорида алюминия в 95%-м этиловом спирте, после чего раствор подкисляли 1 каплей разбавленной уксусной кислоты и доводили 80%-м этиловым спиртом до 25 мл (раствор А). Через 35 мин измеряли оптическую плотность раствора А и далее сравнивали ее с оптической плотностью эталонного раствора рутина на спектрофотометре при длине волны λ = 409 нм в кварцевой кювете с длиной оптического пути 10 мм [9]. Эксперимент проводился в трех повторностях, а данные выражались как среднее значение трех образцов со стандартной ошибкой, p < 0,05 считалось статистически значимым.

Приготовление эталонного раствора рутина

0,013 г стандартной навески рутина, предварительно высушенной до постоянной массы при температуре 100–105 °C, переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл вместе с небольшим объемом 80%-го этилового спирта и нагревали на горячей водяной бане до полного растворения, после чего объем раствора доводили до 25 мл 80%-м этиловым спиртом. 1,0 мл полученного раствора переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл, после чего добавляли 2,0 мл 2%-го раствора хлорида алюминия в 95% этиловом спирте и дополнительно подкисляли 1 каплей разбавленной уксусной кислоты и доводили 80% этиловым спиртом до 25 мл. Через 35 мин оптическую плотность полученного раствора сравнения измеряли на спектрофотометре при длине волны λ = 409 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм.

Приготовление 2% раствора хлорида алюминия

2,0 г хлорида алюминия растворяли в 95%-м этиловом спирте и доводили объем до 100 мл в мерной колбе.

ВЭЖХ анализ цветков лаванды узколистной

Для анализа компонентного состава L. angustifolium методом ВЭЖХ использовали экстракт, полученный 96%-м этиловым спиртом путем мацерации в течение 24 ч при соотношении сырье – экстрагент 1,0 г на 20 мл. ВЭЖХ анализ проводился на жидкостном хроматографе Shimadzu Prominence LC-20AD (Япония), оснащенный автосамплером Shimadzu Prominence SIL-20A (Япония), колонкой Supelcosil LC-18 25 см × 4,6 мм, 5 мкм (США), термостатом CTO-20AC (Япония) и диодно-матричным детектором Shimadzu SPD-M20A (Япония).

Подвижная фаза состояла из элюента А – сверхчистой воды с добавкой 0,1%-й трифторуксусной кислоты (ТФУ) (по объему) (PanReac AppliChem, Германия) и элюента Б – ацетонитрила HPLC Far UV/Gradient Grade (J. T. Baker, США) с добавкой 0,1%-й ТФК.

Режим элюирования: 0,01–5,0 мин 5% Б (изократический режим), 5,0–45,75 мин 5–100% Б (линейный градиент), 45,75–50,0 мин 100% Б (изократический режим), 50,0–60,0 мин 100–5% Б (линейный градиент), 60,0–65,0 мин 5% Б (изократический режим, приведение колонки в равновесие). Анализируемую пробу вводили в объеме 10 мкл, температура колонки во время анализа составляла 40 °C, используемая скорость потока составляла 1,0 мл/мин. Регистрация УФ-спектра осуществлялась в диапазоне от 190 до 800 нм, хроматограммы регистрировались при следующих аналитических длинах волн – 235, 254, 280 и 340 нм. Пиковую идентификацию проводили сверяясь с внутренней библиотекой вторичных метаболитов.

Микроскопический анализ цветков L. angustifolia

Микропрепараты получали по методике, представленной в ОФС.1.5.3.0003.15 «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов». Препараты рассматривали при увеличении 80×, 200× и 800× на микроскопе цифровом LevenhukD740T тринокулярном. Микрофотографии препаратов были получены с помощью цифровой камеры Levenhuk 800MPLUS (максимальное разрешение 3264 × 2448 пикс., число мегапикселей – 8) и программного обеспечения LevengukLite (версия: ×64, 4.11.18709.20210403).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Фитохимический анализ цветков L. angustifolia

Флавоноиды представляют собой одну из основных группу вторичных метаболитов растений, играющих существенную роль в метаболизме растений и являющихся активными компонентами многих лекарственных препаратов природного происхождения [10]. Суммарное содержание флавоноидов в образце L. angustifolia было измерено с помощью дифференциальной УФ-спектрофотометрии и составило 0.1533 ± 0.00533% в пересчете на сухую массу. Полученные данные коррелируют с данными из литературы, в соответствии с которыми содержание суммы флавоноидов в цветках L. angustifolia составило 0,2%, наряду с 0,2% в почках и 0,4% в листьях [11].

В результате ВЭЖХ анализа 96%-го этанольного экстракта цветков L. angustifolia получена хроматограмма, содержащая семь основных пиков 1–7 (рис. 1). Известно, что L. angustifolia является источником розмариновой кислоты [12], но в сравнении со стандартом образцом было выяснено, что содержание розмариновой кислоты в исследуемых цветках незначительное (рис. 1). Анализ УФ-спектров поглощения основных компонентов 1–7 цветков L. angustifolia указывает на то, что данные пики соответствуют соединениям, относящимся к классам флавоноидов (пики 1, 3, 5), гидроксибензойных кислот (пики 2 и 7), гидроксикоричных кислот (пики 4 и 6) (рис. 2).

 

Рис. 1. Увеличенная ключевая область ВЭЖХ хроматограммы цветков L. angustifolia

Fig. 1. Enlarged key region of HPLC chromatogram of L. angustifolia flowers

 

Рис. 2. УФ-спектры поглощения основных компонентов 1–7 цветков L. angustifolia

Fig. 2. UV-spectra of the main compounds 1–7 of L. angustifolia flowers

 

Макро- и микроскопический анализ цветков L. angustifolia

Лекарственное растительное сырье L. angustifolia представлено отельными цветками, а также частями соцветий (колосовидных тирсов). Цветоножка короткая. Чашечка цветков сростнолистная, трубчатой формы, пятизубчатая, голубовато-серого цвета, длиной до 5 мм. Хорошо заметны 10–13 жилок, которые идут параллельно друг другу по длине трубки чашечки. Зубцы чашечки неравные, опушенные. Венчик двугубый с раздвоенной верхней губой и трехлопастной нижней губой, розовато-бурого цвета, длиной до 10 мм. Запах сильный, ароматный. Вкус водного извлечения сильно горький, специфический. Было проведено микроскопическое исследование лаванды узколистной цветков с целью установления анатомо-диагностических признаков.

Эпидермис наружной поверхности чашечки с редкими устьицами, многочисленными простыми многоклеточными ветвящимися с бородавчатой кутикулой волосками (кроющими волосками), головчатыми волосками, состоящими из одно-многоклеточной ножки и одноклеточной шаровидной головки, и крупными железками, у которых можно видеть 8 радиально расположенных выделительных клеток (рис. 3, а–в) [13]. С внутренней стороны чашечки клетки эпидермиса имеют сильноизвилистые очертания и содержат призматические кристаллы оксалата кальция, присутствуют мелкие головчатые волоски (по жилкам) (рис. 3, д, е). По линии вдоль оснований зубцов чашечки расположены длинные (лентовидные) простые одноклеточные волоски или V-образные двухклеточные волоски с гладкой или бородавчатой кутикулой (рис. 3, г, ж).

 

Рис. 3. Препарат чашечки с поверхности (наружная сторона) (800×): а – кроющий волосок; б – головчатые волоски; в – эфирномасличная железка; г – простые V-образные двухклеточные волоски с бородавчатой кутикулой; д – клетки эпидермиса с извилистыми стенками; е – призматические кристаллы кальция оксалата; ж – простые лентообразные волоски с гладкой кутикулой

Fig. 3. Preparation of the calyx from the surface (outer side) (800×): а – covering hair; б – capitate hairs; в – essential oil gland; г – simple V-shaped two-celled hairs with a warty cuticle; д – epidermal cells with tortuous walls; е – prismatic crystals of calcium oxalate; ж – simple ribbon-shaped hairs with a smooth cuticle

 

Клетки эпидермиса венчика с наружной стороны прямостенные прямоугольной формы, на лопастях видны многочисленные кроющие волоски и редкие эфирномасличные железки (рис. 4, а–в). Встречаются погруженные устьица аномоцитного типа (рис. 4, г). С внутренней стороны лопасти венчика представлены сосочковидными выростами, имеются немногочисленные головчатые волоски, состоящие из одно-многоклеточной ножки и одноклеточной шаровидной головки, и многочисленные головчатые волоски, состоящие из двухклеточной ножки (одна клетка длинная крупнобугорчатая с поверхности, вторая – короткая, гладкая, соединяется с головкой) и крупной одноклеточной шаровидной головки с темно-желтым содержимым (рис. 4, е, д) [14]. Также представлены немногочисленные, но очень длинные простые многоклеточные волоски с крупнобугорчатой поверхностью (рис. 4, ж). В нижней части трубки венчика и с наружной и внутренней стороны эпидермис представлен клетками прямоугольной формы с утолщенными клеточными стенками, трихомы и железки отсутствуют (рис. 4, з).

 

Рис. 4. А – препарат венчика с поверхности (наружная сторона) (800×): а – кроющие волоски; б – эфирномасличная железка; в – клетки эпидермиса; г – устьице; В – препарат венчика с поверхности (внутренняя сторона) (800×): д – сосочковидные выросты эпидермиса; е – головчатый волосок; ж – простой многоклеточный волосок с крупнобугорчатой поверхностью; з – клетки эпидермиса с утолщенными стенками

Fig. 4. A – preparation of the corolla from the surface (outer side) (800×): a – covering hairs; б – essential oil gland; в – epidermal cells; г – stomata; B – preparation of the corolla from the surface (inner side) (800×): д – papillary outgrowths of the epidermis; e – capitate hair; ж – simple multicellular hair with a coarsely tuberculated surface; з – epidermal cells with thickened walls

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Установлены ключевые показатели подлинности и доброкачественности сырья цветков L. angustifolia. В качестве показателей подлинности изучены основные макро- и микроскопические признаки растения. Для проведения микроскопического анализа сырья рекомендовано приготовление препаратов чашечки и венчика с поверхности.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин (0,1533 ± 0,00533%) и ВЭЖХ профиль вторичных метаболитов цветков L. angustifolia рекомендованы в качестве основных показателей доброкачественности сырья цветков L. angustifolia.

На основе подученных данных цветки L. angustifolia представляют собой интерес для дальнейших фитохимических и фармакологических исследований, для установления состава, структуры и биологической активности основных вторичных метаболитов полифенольной природы. Установленные показатели подлинности и доброкачественности сырья могут послужить основой для дальнейшей разработки проекта фармакопейной статьи на цветки L. angustifolia.

About the authors

Andrey K. Whaley

Saint Petersburg State Chemical and Pharmaceutical University

Email: andrey.ueyli@pharminnotech.com

PhD in Pharmacy, Acting Head of the Department of Pharmacognosy

Russian Federation, Saint Petersburg

Anastasia O. Whaley

Saint Petersburg State Chemical and Pharmaceutical University

Email: asty.ponkratova@spcpu.ru

PhD in Pharmacy, Junior Researcher at the Department of Pharmacognosy

Russian Federation, Saint Petersburg

Elena V. Zhokhova

Saint Petersburg State Chemical and Pharmaceutical University

Email: elena.zhohova@pharminnotech.com

PhD in Pharmacist, Associate Professor of the Department of Pharmacognosy

Russian Federation, Saint Petersburg

Ivan S. Suloev

Saint Petersburg State Chemical and Pharmaceutical University

Email: Suloev.Ivan@pharminnotech.com

PhD. Pharmacist, Associate Professor of the Department of Pharmacognosy

Russian Federation, Saint Petersburg

Istora O. Abdumazhidova

Tashkent Pharmaceutical Institute

Email: abdumazidovaistora@gmail.com

Assistant Professor at the Department of Pharmacognosy

Uzbekistan, Tashkent

Nodira T. Farmanova

Tashkent Pharmaceutical Institute

Author for correspondence.
Email: farmanovan70@mail.ru

Doctor Chemical Sciences, Associate Professor, Head of the Department of Pharmacognosy

Uzbekistan, Tashkent

Gennady P. Yakovlev

Saint Petersburg State Chemical and Pharmaceutical University

Email: gennady.yakovlev@pharminnotech.com

D.Sc. in Biology, Professor Department of Pharmacognosy

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files