Email this article 
The development of a formulation, the selection and harmonization of the nutrient medium for determining the activity of aminoglycoside antibiotics
- Authors: Tsvetkova I.A.1, Chernykh T.F.1, Zharikov M.V.1
-
Affiliations:
- Saint Petersburg State Chemical and Pharmaceutical University
- Issue: Vol 6, No 3 (2024)
- Pages: 10-16
- Section: Pharmaceutical Sciences
- URL: https://journals.eco-vector.com/PharmForm/article/view/634932
- DOI: https://doi.org/10.17816/phf634932
- ID: 634932
Cite item
Full Text
Abstract
The work is devoted to research on the selection of peptone for the optimization of the nutrient medium for the antimicrobial activity by the agar diffusion method of neomycin (framycetin), which have a similar chemical structure. The paper substantiates the relevance and importance of developing a formulation, selecting the optimal composition (ingredients), the quantitative ratio of ingredients, the pH of the medium, compliance of the proposed nutrient media with the State Pharmacopoeia of the Russian Federation and the European Pharmacopoeia for the standardization of antibiotics. The aim of the work was to study the components of the nutrient medium in comparison with the pharmacopoeial standards recommended for determining the effectiveness of antibiotics. It is shown that for carrying out microbiological tests in the standardization of antimicrobial drugs, the nutrient medium is the main one, and the correctness and accuracy of the interpretation of the research results depend on their quality. The experiment studied four brands of dry peptone and broth from different manufacturers – LLC NITSF and FBUN GNTs PMB (Obolensk) when working with the test strain of the spore culture Bacillus subtilis ATCC 6633. An optimal nutrient medium is proposed, the composition and conditions of its preparation are selected. To determine the antimicrobial activity of framycetin by the agar diffusion method, a developed medium for determining the effectiveness of neomycin when working with the spore-forming form of the test strain Baccillus subtillis ATCC 6633 is proposed.
Full Text
ВВЕДЕНИЕ
Важной составляющей проведения микробиологических испытаний при стандартизации противомикробных агентов (антибиотики, антисептики, дезинфицирующие средства и др.) является выбор оптимальной питательной среды для получения достоверных результатов при стандартизации образца [1].
Питательные среды (ПС) – однокомпонентные или многокомпонентные субстраты, широко применяемые в различных отраслях науки и производства для культивирования и изучения микроорганизмов или культур клеток высших организмов. Их используют в санитарной и клинической микробиологии для диагностики заболеваний и изучения объектов окружающей среды, в пищевой и фармацевтической промышленности при производстве и контроле качества продукции, в криминалистике.
В последние годы в связи с расширением спектра производств сложных биологических лекарственных препаратов (БЛП), к которым относятся иммунобиологические, биотехнологические и генотерапевтические лекарственные препараты, значимость (ПС) существенно возросла [2].
В настоящее время в Российской Федерации в связи с определенными трудностями в приобретении аккредитованных лабораториях импортных вспомогательных веществ и материалов остро стоит вопрос подбора и использования оптимальных питательных сред [3, 4]. Предлагаемые варианты сред для проведения испытаний в Государственной Фармакопее РФ (ГФ РФ) представлены не для всех противомикробных средств, а только для ограниченного наименования антибиотиков. Следовательно, для микробиологов приходится проводить собственные экспериментальные исследования и доказывать их эффективность [5]. Так, например, в ГФ РФ предложен вариант рецептуры среды для неомицина, но отсутствует рецептура среды для определения назального спрея фрамицетина [6], который в последнее время очень широко применяется в медицине [7]. В Европейской Фармакопее (ЕФ) описан состав среды (среда Е) для определения антимикробной активности методом диффузии в агар Фрамицетина, которая не всегда доступна в России [8].
Цель исследования – разработка рецептуры, выбор и гармонизация питательной среды для определения активности антибиотика фрамицетина.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Определение антимикробной активности фрамицетина проводили методом диффузии в агар на плотной питательной среде. Исследования осуществляли путем сравнения размеров зон угнетения роста тест-штаммов микроорганизмов, образующихся при испытании растворов стандартного образца и испытуемого препарата фрамицетина.
Использованы пептоны для приготовления питательных сред: ООО НИЦФ (среда Е, № 1); пептон основной сухой ФБУН ГНЦ ПМБ Оболенск (среда Е, № 2); пептон бактериологический сухой ФБУН ГНЦ ПМБ Оболенск (среда Е, № 3) и среда № 4 для определения активности неомицина. Среды готовили согласно требованиям ГФ РФ.
Метод основан на логарифмической зависимости размеров зон угнетения роста тест-микроорганизмов от концентрации антибиотика, которая должны быть линейной [9].
Для определения эффективности антибиотиков используют стандартные образцы, активность которых, как правило, устанавливают в соответствии с международными биологическими стандартами [10]. Основные растворы стандартных и испытуемых образцов готовят в стерильных растворителях с концентрацией 1 мг/мл.
В ЕФ для определения антимикробной активности антибиотика используют среду следующего состава: 5,0 г пептона, 3,0 г мясного экстракта и 10 г агар-агара с рН среды до 7,8–8,0. Дополнительным компонентом является 53,8%-й раствор динатрия гидрофосфата.
Испытания всех вариантах сред при одинаковых условиях проводили в соответствии с методикой, предложенной ГФ РФ и ЕФ. В расплавленную среду Е (варианты 1, 2 и 3) вносили приготовленный и простерилизованный при 121 °C в течение 20 минут 53,8%-й раствор динатрия гидросфосфата из расчета 8 мл раствора на 160 мл среды. В среде № 3 раствор динатрия гидрофосфата отсутствовал.
При определении активности образца фрамицетина во все среды вносили взвесь споровой культуры Bacillus subtilis ATCC6633 в количестве 2 × 107 КОЕ/мл из расчета 1 мл на каждые 20 мл.
Инокулированную среду разливали по 20 мл в пластмассовые чашки Петри размером 20 × 90 мм, установленные на столиках со строго горизонтальной поверхностью. После полного застывания агара в чашках при помощи стерильного сверла с внутренним диаметром 6 мм наносили по 6 лунок. В лунки помещали равные объемы рабочих растворов стандартного и испытуемого образцов в концентрациях 10 МЕ/мл, 20 МЕ/мл и 40 МЕ/мл. По истечении времени инкубирования при температуре 36 ± 1 °C учитывали результаты, измеряя диаметры зон угнетения роста тест-микроорганизма при помощи соответствующих приборов с точностью до 0,1 мм в соответствии со статьей ОФС «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами».
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Выбор компонентов питательной среды, в особенности качество используемого пептона, является критически важным фактором для успешного проведения микробиологических исследований, таких как определение активности антибиотиков методом диффузии в агар [11].
В ходе исследования были приготовлены 4 варианта питательных сред, различающиеся по производителю используемого пептона (табл. 1). Результаты анализа активности неомицина на этих средах показали существенные различия.
Табл. 1. Составы питательных сред для определения методом диффузии в агар Table 1. Compositions of nutrient media for determination by diffusion into agar | ||||
Питательная среда, № | Компоненты питательной среды | рН среды | ||
1 | 2 | Агар-агар | ||
Среда Е, № 1 | Пептон для бактериологических питательных сред, ООО НИЦФ | Мясной экстракт, производитель «Sigma» кат. № В4888 | Агар-агар микробиологический, производитель «Laboratorios Conda», Испания | рН = 6,36 |
Среда Е, № 2 | Пептон основной сухой, ФБУН ГНЦ ПМБ (Оболенск) | Мясной экстракт, производитель «Sigma» кат. № В4888 | Агар-агар микробиологический, производитель «Laboratorios Conda», Испания | рН = 7,44 |
Среда Е, № 3 | Пептон бактериологический сухой, ФБУН ГНЦ ПМБ Оболенск | Мясной экстракт, производитель «Sigma» кат. № В4888 | Агар-агар микробиологический, производитель «Laboratorios Conda», Испания | pH = 6,45 |
Среда для неомицина, № 4 | ГМФ-бульон, ООО НИЦФ | Натрия фосфат двузамещенный | Агар-агар микробиологический, производитель «Laboratorios Conda», Испания | рН = 7,21 |
Как видно из табл. 1, среда 4 отличается по составу от предложенной в ЕФ среды Е. Следует отметить, что в состав среды № 4 (для определения активности неомицина) не входит такой компонент как мясной экстракт, поскольку на отечественном рынке он практически отсутствует.
Установлено, что при учете результатов диаметры зоны задержки роста на чашках с питательной средой, зоны имели разную конфигурацию и вид (рис. 1, 2). В чашках с посевами на среде № 4 (табл. 2) получали результаты активности фрамицетина 8185 ЕД. При просмотре зоны задержки роста (рис. 2) обнаружили более четкие контуры колонии, диаметр которой составил 17,21–20,33 мм. На среде № 2 рост тест-штамма микроорганизма Bacillus subtillis АТСС 6633 отсутствовал.
Рис. 1. Диаметр задержки зон фрамицетина (мм) на среде Е № 1. Примечание: О-10 – испытуемый образец фрамицетина, концентрация 10 ЕД/мл; О-20 – испытуемый образец фрамицетина, концентрация 20 ЕД/мл; К-10 – стандартный образец фрамицетина, концентрация 10 ЕД/мл; К-20 – стандартный образец фрамицетина, концентрация 20 ЕД/мл; К-40 – стандартный образец фрамицетина 10 ЕД/мл
Fig. 1. Diameter of the delay zones of framycetin (mm) on medium E No. 1. Note: O-10 – test sample of framycetin, concentration 10 U/ml; O-20 – test sample of framycetin, concentration 20 U/ml; K-10 – standard sample of framycetin, concentration 10 U/ml; K-20 – standard sample of framycetin, concentration 20 U/ml; K-40 – standard sample of framycetin 10 U/ml
Рис. 2. Диаметр задержки зон (мм) на среде № 3 фрамицетина. Примечание: О-10 – испытуемый образец фрамицетина, концентрация 10 ЕД/мл; О-20 – испытуемый образец фрамицетина, концентрация 20 ЕД/мл; К-10 – стандартный образец фрамицетина, концентрация 10 ЕД/мл; К-20 – стандартный образец фрамицетина, концентрация 20 ЕД/мл; К-40 – стандартный образец фрамицетина 10 ЕД/мл
Fig. 2. The diameter of the delay zones (mm) on the medium No. 3 of framycetin. Note: O-10 – test sample of framycetin, concentration 10 U/ml; O-20 – test sample of framycetin, concentration 20 U/ml; K-10 – standard sample of framycetin, concentration 10 U/ml; K-20 – standard sample of framycetin, concentration 20 U/ml; K-40 – standard sample of framycetin 10 U/ml
Табл. 2. Диаметры зон задержки роста фрамицетина на питательных средах Table 2. Diameters of framycetin growth retardation zones on nutrient media | ||||||||
№ эксперимента | Ожидаемая активность фрамицетина, ЕД (уровень, %) | Диаметр зон задержки роста, мм | Активность фрамицетина, ЕД | |||||
Контрольный раствор | Испытуемый раствор | |||||||
S1 | S2 | S3 | U1 | U2 | U3 | |||
1 | 8000 | 23,00 | 24,40 | 26,00 | 23,00 | 24,40 | 25,90 | 8084 |
23,00 | 24,50 | 25,90 | 23,10 | 24,50 | 25,90 | |||
23,10 | 24,80 | 26,10 | 23,20 | 24,70 | 26,00 | |||
23,00 | 24,50 | 26,00 | 23,10 | 24,50 | 26,00 | |||
23,00 | 24,50 | 25,90 | 23,00 | 24,40 | 26,10 | |||
23,10 | 24,60 | 26,00 | 23,10 | 24,70 | 26,20 | |||
3 | 8000 | 25,00 | 27,20 | 29,60 | 24,90 | 27,10 | 29,50 | 8122 |
25,10 | 27,40 | 30,20 | 25,20 | 27,40 | 30,10 | |||
25,10 | 27,60 | 31,00 | 25,30 | 27,50 | 31,00 | |||
24,90 | 27,40 | 29,40 | 25,10 | 27,30 | 29,80 | |||
25,10 | 27,30 | 30,80 | 25,10 | 27,30 | 31,00 | |||
25,20 | 27,40 | 29,90 | 25,40 | 27,60 | 30,00 | |||
4 | 8000 | 17,20 | 18,70 | 20,20 | 17,30 | 18,90 | 20,30 | 8185 |
17,20 | 18,70 | 20,20 | 17,20 | 18,80 | 20,30 | |||
17,30 | 18,90 | 20,20 | 17,40 | 18,80 | 20,40 | |||
17,10 | 18,60 | 20,30 | 17,20 | 18,70 | 20,40 | |||
17,20 | 18.70 | 20,20 | 17,20 | 18,60 | 20,40 | |||
17,30 | 18,80 | 20,30 | 17,30 | 18,80 | 20,20 | |||
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, проведенные исследования антимикробной активности с тест-штаммом микроорганизма Bacillus subtillis АТСС 6633 показали, что унифицированная питательная среда № 4 для определения антимикробной активности неомицина методом диффузии в агар может быть использована для определения антимикробной активности назального спрея «Фрамицетин».
About the authors
Irina A. Tsvetkova
Saint Petersburg State Chemical and Pharmaceutical University
Author for correspondence.
Email: irina.cvetkova@pharminnotech.com
biologist of the Testing Laboratory (Center for Quality Control of Medicines)
Russian Federation, Saint PetersburgTatiana F. Chernykh
Saint Petersburg State Chemical and Pharmaceutical University
Email: ode9gova.t@yandex.ru
D.Sc. in Pharmaceutical Sciences, Professor, Professor of the Department of Microbiology
Russian Federation, Saint PetersburgMikhail V. Zharikov
Saint Petersburg State Chemical and Pharmaceutical University
Email: mikhail05051985@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0720-501X
SPIN-code: 7818-7228
Scopus Author ID: 59257094000
ResearcherId: AAS-9156-2021
Senior laboratory Assistant at the Department of Industrial Ecology
Russian Federation, Saint PetersburgReferences
- Sukhanova S. M. Nutrient media in pharmacopoeial analysis: application, current requirements, standardization issues / S. M. Sukhanova, N. E. Zakharova // Biopreparations. Prevention, diagnostics, treatment. – 2019. – Vol. 19, No. 3. – Pp. 136–144. doi: 10.30895/2221-996X-2019-19-3-136-144. (In Russ.).
- Sukhanova S.M. Standardization of Requirements for Culture Media Used to Assess the Quality of Drugs (Review). Drug development & registration. 2023;12(1):123–130. doi: 10.33380/2305-2066-2023-12-1-123-130. (In Russ.).
- Evaluation of the microbiological purity of a nasal spray containing naltrexone hydrochloride / Yu. M. Domnina, V. V. Suslov, N. E. Grammatikova, S. S. Kedik // Development and registration of medicines. – 2020. – Vol. 9, No. 4. – P. 116–120. doi: 10.33380/2305-2066-2020-9-4-116-120. (In Russ.).
- Kuleshova S. I. Stability of ready-made and laboratory-prepared nutrient media / S. I. Kuleshova S. A. Protsak, S. A. Lisunova, G. Yu. Romanyuk // Bulletin of the Scientific Center for Expertise of Medical Products. Regulatory studies and expertise of medicines. – 2021. – Vol. 11, No. 2. – Pp. 130–134. doi: 10.30895/1991-2919-2021-11-2-130-134. (In Russ.).
- Olefir Yu. V. Experimental evaluation of methods for determining the antimicrobial activity of chlorophyllipt preparations / Yu. V. Olefir, A. I. Lutseva, O. V. Gunar [et al.] // Bulletin of the Scientific Center for Expertise of Medical Products. Regulatory studies and expertise of medicines. – 2015. – No. 4. – P. 47–50. (In Russ.).
- Patent No. 2720691 C1 Rossiiskaya Federatsiya, MPK C12Q 1/02, G01N21/17, C12R1/445. Zhidkaya pitatel’naya sreda dlya kul’tivirovaniya mikroorganizmov pri opredelenii gentamitsina i streptomitsina v lekarstvennykh sredstvakh i sposob ikh opredeleniya turbidimetricheskim metodom: № 2019124515: zayavl. 02.08.2019: opubl. 12.05.2020 / E. N. Semenova, E. I. Sakanyan, S. I. Kuleshova, T. I. Krasnopevtseva; zayavitel’ Federal’noe gosudarstvennoe byudzhetnoe uchrezhdenie “Nauchnyi tsentr ekspertizy sredstv meditsinskogo primeneniya” Ministerstva zdravookhraneniya Rossiiskoi Federatsii (FGBU NTsESMP Minzdrava Rossii). (In Russ.).
- Eremin S. A. Features of the use of topical preparations of framycetin sulfate in the treatment of rhinosinusitis / S. A. Eremin, I. M. Dyakov, S. S. Pavlova // Medical Council. – 2021. – No. 18. – P. 158–164. doi: 10.21518/2079-701X-2021-18-158-164. (In Russ.).
- European Pharmacopoeia. 10th Edition. Council of Europe, 2020.
- OFS.1.2.4.0002.18 “Mikrobiologicheskaya chistota” / Gosudarstvennaya Farmakopeya RF GF XIV. T. 2, M., 2018 g. C. 1128. (In Russ.).
- OFS.1.2.4.0010.15 Vzamen st. GF XI, vyp. 2 Vzamen st. GF XII, ch. 1, “Opredelenie antimikrobnoi aktivnosti antibiotikov metodom diffuzii v agar”. (In Russ.).
- Kuleshova S. I. Determination of antibiotic activity by diffusion in agar / S. I. Kuleshova // Bulletin of the Scientific Center for Expertise of Medical Products. Regulatory studies and expertise of medicines. – 2015. – No. 3. – P. 13–17. (In Russ.).
Supplementary files
