Разработка рецептуры, выбор и гармонизация питательной среды для определения активности аминогликозидных антибиотиков

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Работа посвящена исследованиям выбора пептона по оптимизации питательной среды для антимикробной активности методом диффузии в агар неомицина (фрамицетина), со схожей химической структурой. В работе обоснована важность разработки рецептуры, выбора оптимального состава, количественное соотношение ингредиентов, рН среды, соответствие предлагаемых питательных сред Государственной Фармакопее РФ и Европейской Фармакопее для стандартизации антибиотиков. Целью работы явилось изучение компонентов питательной среды в сравнении с фармакопейными стандартами, рекомендованными для определения эффективности антибиотиков. Показано, для проведения микробиологических испытаний при стандартизации лекарственных препаратов противомикробного действия питательная среда является основной, от их качества зависит правильность и точность интерпретации результатов исследований. В эксперименте были изучены четыре марки пептона сухого и бульона разных производителей по 2 вида – ООО НИЦФ и ФБУН ГНЦ ПМБ (г. Оболенск) при работе с тест- штаммом споровой культуры Bacillus subtilis ATCC 6633. Предложена оптимальная питательная среда, подобран состав и условия ее приготовления. Для определения антимикробной активности фрамицетина методом диффузии в агар предложена разработанная среда для определения эффективности неомицина при работе со спороносной формой тест-штамма Baccillus subtillis АТСС 6633.

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Важной составляющей проведения микробиологических испытаний при стандартизации противомикробных агентов (антибиотики, антисептики, дезинфицирующие средства и др.) является выбор оптимальной питательной среды для получения достоверных результатов при стандартизации образца [1].

Питательные среды (ПС) – однокомпонентные или многокомпонентные субстраты, широко применяемые в различных отраслях науки и производства для культивирования и изучения микроорганизмов или культур клеток высших организмов. Их используют в санитарной и клинической микробиологии для диагностики заболеваний и изучения объектов окружающей среды, в пищевой и фармацевтической промышленности при производстве и контроле качества продукции, в криминалистике.

В последние годы в связи с расширением спектра производств сложных биологических лекарственных препаратов (БЛП), к которым относятся иммунобиологические, биотехнологические и генотерапевтические лекарственные препараты, значимость (ПС) существенно возросла [2].

В настоящее время в Российской Федерации в связи с определенными трудностями в приобретении аккредитованных лабораториях импортных вспомогательных веществ и материалов остро стоит вопрос подбора и использования оптимальных питательных сред [3, 4]. Предлагаемые варианты сред для проведения испытаний в Государственной Фармакопее РФ (ГФ РФ) представлены не для всех противомикробных средств, а только для ограниченного наименования антибиотиков. Следовательно, для микробиологов приходится проводить собственные экспериментальные исследования и доказывать их эффективность [5]. Так, например, в ГФ РФ предложен вариант рецептуры среды для неомицина, но отсутствует рецептура среды для определения назального спрея фрамицетина [6], который в последнее время очень широко применяется в медицине [7]. В Европейской Фармакопее (ЕФ) описан состав среды (среда Е) для определения антимикробной активности методом диффузии в агар Фрамицетина, которая не всегда доступна в России [8].

Цель исследования – разработка рецептуры, выбор и гармонизация питательной среды для определения активности антибиотика фрамицетина.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Определение антимикробной активности фрамицетина проводили методом диффузии в агар на плотной питательной среде. Исследования осуществляли путем сравнения размеров зон угнетения роста тест-штаммов микроорганизмов, образующихся при испытании растворов стандартного образца и испытуемого препарата фрамицетина.

Использованы пептоны для приготовления питательных сред: ООО НИЦФ (среда Е, № 1); пептон основной сухой ФБУН ГНЦ ПМБ Оболенск (среда Е, № 2); пептон бактериологический сухой ФБУН ГНЦ ПМБ Оболенск (среда Е, № 3) и среда № 4 для определения активности неомицина. Среды готовили согласно требованиям ГФ РФ.

Метод основан на логарифмической зависимости размеров зон угнетения роста тест-микроорганизмов от концентрации антибиотика, которая должны быть линейной [9].

Для определения эффективности антибиотиков используют стандартные образцы, активность которых, как правило, устанавливают в соответствии с международными биологическими стандартами [10]. Основные растворы стандартных и испытуемых образцов готовят в стерильных растворителях с концентрацией 1 мг/мл.

В ЕФ для определения антимикробной активности антибиотика используют среду следующего состава: 5,0 г пептона, 3,0 г мясного экстракта и 10 г агар-агара с рН среды до 7,8–8,0. Дополнительным компонентом является 53,8%-й раствор динатрия гидрофосфата.

Испытания всех вариантах сред при одинаковых условиях проводили в соответствии с методикой, предложенной ГФ РФ и ЕФ. В расплавленную среду Е (варианты 1, 2 и 3) вносили приготовленный и простерилизованный при 121 °C в течение 20 минут 53,8%-й раствор динатрия гидросфосфата из расчета 8 мл раствора на 160 мл среды. В среде № 3 раствор динатрия гидрофосфата отсутствовал.

При определении активности образца фрамицетина во все среды вносили взвесь споровой культуры Bacillus subtilis ATCC6633 в количестве 2 × 107 КОЕ/мл из расчета 1 мл на каждые 20 мл.

Инокулированную среду разливали по 20 мл в пластмассовые чашки Петри размером 20 × 90 мм, установленные на столиках со строго горизонтальной поверхностью. После полного застывания агара в чашках при помощи стерильного сверла с внутренним диаметром 6 мм наносили по 6 лунок. В лунки помещали равные объемы рабочих растворов стандартного и испытуемого образцов в концентрациях 10 МЕ/мл, 20 МЕ/мл и 40 МЕ/мл. По истечении времени инкубирования при температуре 36 ± 1 °C учитывали результаты, измеряя диаметры зон угнетения роста тест-микроорганизма при помощи соответствующих приборов с точностью до 0,1 мм в соответствии со статьей ОФС «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выбор компонентов питательной среды, в особенности качество используемого пептона, является критически важным фактором для успешного проведения микробиологических исследований, таких как определение активности антибиотиков методом диффузии в агар [11].

В ходе исследования были приготовлены 4 варианта питательных сред, различающиеся по производителю используемого пептона (табл. 1). Результаты анализа активности неомицина на этих средах показали существенные различия.

 

Табл. 1.

Составы питательных сред для определения методом диффузии в агар

Table 1.

Compositions of nutrient media for determination by diffusion into agar

Питательная среда, №

Компоненты питательной среды

рН среды

1

2

Агар-агар

Среда Е, № 1

Пептон для бактериологических питательных сред, ООО НИЦФ

Мясной экстракт, производитель «Sigma» кат. № В4888

Агар-агар микробиологический, производитель «Laboratorios Conda», Испания

рН = 6,36

Среда Е,

№ 2

Пептон основной сухой, ФБУН ГНЦ ПМБ (Оболенск)

Мясной экстракт, производитель «Sigma» кат. № В4888

Агар-агар микробиологический, производитель «Laboratorios Conda», Испания

рН = 7,44

Среда Е, № 3

Пептон бактериологический сухой, ФБУН ГНЦ ПМБ Оболенск

Мясной экстракт, производитель «Sigma» кат. № В4888

Агар-агар микробиологический, производитель «Laboratorios Conda», Испания

pH = 6,45

Среда для неомицина, № 4

ГМФ-бульон, ООО НИЦФ

Натрия фосфат двузамещенный

Агар-агар микробиологический, производитель «Laboratorios Conda», Испания

рН = 7,21

 

Как видно из табл. 1, среда 4 отличается по составу от предложенной в ЕФ среды Е. Следует отметить, что в состав среды № 4 (для определения активности неомицина) не входит такой компонент как мясной экстракт, поскольку на отечественном рынке он практически отсутствует.

Установлено, что при учете результатов диаметры зоны задержки роста на чашках с питательной средой, зоны имели разную конфигурацию и вид (рис. 1, 2). В чашках с посевами на среде № 4 (табл. 2) получали результаты активности фрамицетина 8185 ЕД. При просмотре зоны задержки роста (рис. 2) обнаружили более четкие контуры колонии, диаметр которой составил 17,21–20,33 мм. На среде № 2 рост тест-штамма микроорганизма Bacillus subtillis АТСС 6633 отсутствовал.

 

Рис. 1. Диаметр задержки зон фрамицетина (мм) на среде Е № 1. Примечание: О-10 – испытуемый образец фрамицетина, концентрация 10 ЕД/мл; О-20 – испытуемый образец фрамицетина, концентрация 20 ЕД/мл; К-10 – стандартный образец фрамицетина, концентрация 10 ЕД/мл; К-20 – стандартный образец фрамицетина, концентрация 20 ЕД/мл; К-40 – стандартный образец фрамицетина 10 ЕД/мл

Fig. 1. Diameter of the delay zones of framycetin (mm) on medium E No. 1. Note: O-10 – test sample of framycetin, concentration 10 U/ml; O-20 – test sample of framycetin, concentration 20 U/ml; K-10 – standard sample of framycetin, concentration 10 U/ml; K-20 – standard sample of framycetin, concentration 20 U/ml; K-40 – standard sample of framycetin 10 U/ml

 

Рис. 2. Диаметр задержки зон (мм) на среде № 3 фрамицетина. Примечание: О-10 – испытуемый образец фрамицетина, концентрация 10 ЕД/мл; О-20 – испытуемый образец фрамицетина, концентрация 20 ЕД/мл; К-10 – стандартный образец фрамицетина, концентрация 10 ЕД/мл; К-20 – стандартный образец фрамицетина, концентрация 20 ЕД/мл; К-40 – стандартный образец фрамицетина 10 ЕД/мл

Fig. 2. The diameter of the delay zones (mm) on the medium No. 3 of framycetin. Note: O-10 – test sample of framycetin, concentration 10 U/ml; O-20 – test sample of framycetin, concentration 20 U/ml; K-10 – standard sample of framycetin, concentration 10 U/ml; K-20 – standard sample of framycetin, concentration 20 U/ml; K-40 – standard sample of framycetin 10 U/ml

 

Табл. 2.

Диаметры зон задержки роста фрамицетина на питательных средах

Table 2.

Diameters of framycetin growth retardation zones on nutrient media

№ эксперимента

Ожидаемая активность фрамицетина, ЕД (уровень, %)

Диаметр зон задержки роста, мм

Активность фрамицетина, ЕД

Контрольный раствор

Испытуемый раствор

S1

S2

S3

U1

U2

U3

1

8000

23,00

24,40

26,00

23,00

24,40

25,90

8084

23,00

24,50

25,90

23,10

24,50

25,90

23,10

24,80

26,10

23,20

24,70

26,00

23,00

24,50

26,00

23,10

24,50

26,00

23,00

24,50

25,90

23,00

24,40

26,10

23,10

24,60

26,00

23,10

24,70

26,20

3

8000

25,00

27,20

29,60

24,90

27,10

29,50

8122

25,10

27,40

30,20

25,20

27,40

30,10

25,10

27,60

31,00

25,30

27,50

31,00

24,90

27,40

29,40

25,10

27,30

29,80

25,10

27,30

30,80

25,10

27,30

31,00

25,20

27,40

29,90

25,40

27,60

30,00

4

8000

17,20

18,70

20,20

17,30

18,90

20,30

8185

17,20

18,70

20,20

17,20

18,80

20,30

17,30

18,90

20,20

17,40

18,80

20,40

17,10

18,60

20,30

17,20

18,70

20,40

17,20

18.70

20,20

17,20

18,60

20,40

17,30

18,80

20,30

17,30

18,80

20,20

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, проведенные исследования антимикробной активности с тест-штаммом микроорганизма Bacillus subtillis АТСС 6633 показали, что унифицированная питательная среда № 4 для определения антимикробной активности неомицина методом диффузии в агар может быть использована для определения антимикробной активности назального спрея «Фрамицетин».

×

Об авторах

Ирина Андреевна Цветкова

Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автор, ответственный за переписку.
Email: irina.cvetkova@pharminnotech.com

микробиолог Испытательной лаборатории (Центр контроля качества лекарственных средств)

Россия, Санкт-Петербург

Татьяна Федоровна Черных

Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: ode9gova.t@yandex.ru

д-р фармацевт. наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии

Россия, Санкт-Петербург

Михаил Владимирович Жариков

Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: mikhail05051985@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0720-501X
SPIN-код: 7818-7228
Scopus Author ID: 59257094000
ResearcherId: AAS-9156-2021

ст. лаб. кафедры промышленной экологии

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

  1. Суханова С. М. Стандартизация требований к питательным средам, используемым для оценки качества лекарственных средств (обзор). Разработка и регистрация лекарственных средств. 2023;12(1):123–130. doi: 10.33380/2305-2066-2023-12-1-123-130
  2. Суханова С. М. Питательные среды в фармакопейном анализе: применение, действующие требования, вопросы стандартизации / С. М. Суханова, Н. Е. Захарова // Биопрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. – 2019. – Т. 19, № 3. – С. 136–144. – doi: 10.30895/2221-996X-2019-19-3-136-144.
  3. Домнина Ю. М. Оценка микробиологической чистоты назального спрея, содержащего налтрексона гидрохлорид / Ю. М. Домнина, В. В. Суслов, Н. Э. Грамматикова, С. С. Кедик // Разработка и регистрация лекарственных средств. – 2020. – Т. 9, № 4. – С. 116–120. – doi: 10.33380/2305-2066-2020-9-4-116-120.
  4. Кулешова С. И. Стабильность готовых и приготовленных в лаборатории питательных сред / С. И. Кулешова, С. А. Процак, С. А. Лисунова, Г. Ю. Романюк // Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. Регуляторные исследования и экспертиза лекарственных средств. – 2021. – Т. 11, № 2. – С. 130–134. – doi: 10.30895/1991-2919-2021-11-2-130-134.
  5. Олефир Ю. В. Экспериментальная оценка методов определения антимикробной активности препаратов хлорофиллипта / Ю. В. Олефир, А. И. Лутцева, О. В. Гунар [и др.] // Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. Регуляторные исследования и экспертиза лекарственных средств. – 2015. – № 4. – С. 47–50.
  6. Патент № 2720691 C1 Российская Федерация, МПК C12Q 1/02, G01N21/17, C12R1/445. Жидкая питательная среда для культивирования микроорганизмов при определении гентамицина и стрептомицина в лекарственных средствах и способ их определения турбидиметрическим методом: № 2019124515: заявл. 02.08.2019: опубл. 12.05.2020 / Е. Н. Семенова, Е. И. Саканян, С. И. Кулешова, Т. И. Краснопевцева; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ НЦЭСМП Минздрава России).
  7. Еремин С. А. Особенности применения топических препаратов фрамицетина сульфата в лечении риносинусита / С. А. Еремин, И. М. Дьяков, С. С. Павлова // Медицинский совет. – 2021. – № 18. – С. 158–164. – doi: 10.21518/2079-701X-2021-18-158-164.
  8. European Pharmacopoeia. 10th Edition. Council of Europe, 2020.
  9. ОФС.1.2.4.0002.18 «Микробиологическая чистота» / Государственная Фармакопея РФ ГФ XIV. T. 2, М., 2018 г. C. 1128.
  10. ОФС.1.2.4.0010.15 Взамен ст. ГФ XI, вып. 2 Взамен ст. ГФ XII, ч. 1, «Определение антимикробной активности антибиотиков методом диффузии в агар».
  11. Кулешова С. И. Определение активности антибиотиков методом диффузии в агар / С. И. Кулешова // Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. Регуляторные исследования и экспертиза лекарственных средств. – 2015. – № 3. – С. 13–17.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
2. Рис. 1. Диаметр задержки зон фрамицетина (мм) на среде Е № 1. Примечание: О-10 – испытуемый образец фрамицетина, концентрация 10 ЕД/мл; О-20 – испытуемый образец фрамицетина, концентрация 20 ЕД/мл; К-10 – стандартный образец фрамицетина, концентрация 10 ЕД/мл; К-20 – стандартный образец фрамицетина, концентрация 20 ЕД/мл; К-40 – стандартный образец фрамицетина 10 ЕД/мл

Скачать (86KB)
3. Рис. 2. Диаметр задержки зон (мм) на среде № 3 фрамицетина. Примечание: О-10 – испытуемый образец фрамицетина, концентрация 10 ЕД/мл; О-20 – испытуемый образец фрамицетина, концентрация 20 ЕД/мл; К-10 – стандартный образец фрамицетина, концентрация 10 ЕД/мл; К-20 – стандартный образец фрамицетина, концентрация 20 ЕД/мл; К-40 – стандартный образец фрамицетина 10 ЕД/мл

Скачать (78KB)

© Эко-Вектор, 2024

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 76969 от 11.10.2019.