Отправить статью по E-mail 
Разработка рецептуры, выбор и гармонизация питательной среды для определения активности аминогликозидных антибиотиков
- Авторы: Цветкова И.А.1, Черных Т.Ф.1, Жариков М.В.1
-
Учреждения:
- Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет Министерства здравоохранения Российской Федерации
- Выпуск: Том 6, № 3 (2024)
- Страницы: 10-16
- Раздел: Фармацевтические науки
- URL: https://journals.eco-vector.com/PharmForm/article/view/634932
- DOI: https://doi.org/10.17816/phf634932
- ID: 634932
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Работа посвящена исследованиям выбора пептона по оптимизации питательной среды для антимикробной активности методом диффузии в агар неомицина (фрамицетина), со схожей химической структурой. В работе обоснована важность разработки рецептуры, выбора оптимального состава, количественное соотношение ингредиентов, рН среды, соответствие предлагаемых питательных сред Государственной Фармакопее РФ и Европейской Фармакопее для стандартизации антибиотиков. Целью работы явилось изучение компонентов питательной среды в сравнении с фармакопейными стандартами, рекомендованными для определения эффективности антибиотиков. Показано, для проведения микробиологических испытаний при стандартизации лекарственных препаратов противомикробного действия питательная среда является основной, от их качества зависит правильность и точность интерпретации результатов исследований. В эксперименте были изучены четыре марки пептона сухого и бульона разных производителей по 2 вида – ООО НИЦФ и ФБУН ГНЦ ПМБ (г. Оболенск) при работе с тест- штаммом споровой культуры Bacillus subtilis ATCC 6633. Предложена оптимальная питательная среда, подобран состав и условия ее приготовления. Для определения антимикробной активности фрамицетина методом диффузии в агар предложена разработанная среда для определения эффективности неомицина при работе со спороносной формой тест-штамма Baccillus subtillis АТСС 6633.
Полный текст
ВВЕДЕНИЕ
Важной составляющей проведения микробиологических испытаний при стандартизации противомикробных агентов (антибиотики, антисептики, дезинфицирующие средства и др.) является выбор оптимальной питательной среды для получения достоверных результатов при стандартизации образца [1].
Питательные среды (ПС) – однокомпонентные или многокомпонентные субстраты, широко применяемые в различных отраслях науки и производства для культивирования и изучения микроорганизмов или культур клеток высших организмов. Их используют в санитарной и клинической микробиологии для диагностики заболеваний и изучения объектов окружающей среды, в пищевой и фармацевтической промышленности при производстве и контроле качества продукции, в криминалистике.
В последние годы в связи с расширением спектра производств сложных биологических лекарственных препаратов (БЛП), к которым относятся иммунобиологические, биотехнологические и генотерапевтические лекарственные препараты, значимость (ПС) существенно возросла [2].
В настоящее время в Российской Федерации в связи с определенными трудностями в приобретении аккредитованных лабораториях импортных вспомогательных веществ и материалов остро стоит вопрос подбора и использования оптимальных питательных сред [3, 4]. Предлагаемые варианты сред для проведения испытаний в Государственной Фармакопее РФ (ГФ РФ) представлены не для всех противомикробных средств, а только для ограниченного наименования антибиотиков. Следовательно, для микробиологов приходится проводить собственные экспериментальные исследования и доказывать их эффективность [5]. Так, например, в ГФ РФ предложен вариант рецептуры среды для неомицина, но отсутствует рецептура среды для определения назального спрея фрамицетина [6], который в последнее время очень широко применяется в медицине [7]. В Европейской Фармакопее (ЕФ) описан состав среды (среда Е) для определения антимикробной активности методом диффузии в агар Фрамицетина, которая не всегда доступна в России [8].
Цель исследования – разработка рецептуры, выбор и гармонизация питательной среды для определения активности антибиотика фрамицетина.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Определение антимикробной активности фрамицетина проводили методом диффузии в агар на плотной питательной среде. Исследования осуществляли путем сравнения размеров зон угнетения роста тест-штаммов микроорганизмов, образующихся при испытании растворов стандартного образца и испытуемого препарата фрамицетина.
Использованы пептоны для приготовления питательных сред: ООО НИЦФ (среда Е, № 1); пептон основной сухой ФБУН ГНЦ ПМБ Оболенск (среда Е, № 2); пептон бактериологический сухой ФБУН ГНЦ ПМБ Оболенск (среда Е, № 3) и среда № 4 для определения активности неомицина. Среды готовили согласно требованиям ГФ РФ.
Метод основан на логарифмической зависимости размеров зон угнетения роста тест-микроорганизмов от концентрации антибиотика, которая должны быть линейной [9].
Для определения эффективности антибиотиков используют стандартные образцы, активность которых, как правило, устанавливают в соответствии с международными биологическими стандартами [10]. Основные растворы стандартных и испытуемых образцов готовят в стерильных растворителях с концентрацией 1 мг/мл.
В ЕФ для определения антимикробной активности антибиотика используют среду следующего состава: 5,0 г пептона, 3,0 г мясного экстракта и 10 г агар-агара с рН среды до 7,8–8,0. Дополнительным компонентом является 53,8%-й раствор динатрия гидрофосфата.
Испытания всех вариантах сред при одинаковых условиях проводили в соответствии с методикой, предложенной ГФ РФ и ЕФ. В расплавленную среду Е (варианты 1, 2 и 3) вносили приготовленный и простерилизованный при 121 °C в течение 20 минут 53,8%-й раствор динатрия гидросфосфата из расчета 8 мл раствора на 160 мл среды. В среде № 3 раствор динатрия гидрофосфата отсутствовал.
При определении активности образца фрамицетина во все среды вносили взвесь споровой культуры Bacillus subtilis ATCC6633 в количестве 2 × 107 КОЕ/мл из расчета 1 мл на каждые 20 мл.
Инокулированную среду разливали по 20 мл в пластмассовые чашки Петри размером 20 × 90 мм, установленные на столиках со строго горизонтальной поверхностью. После полного застывания агара в чашках при помощи стерильного сверла с внутренним диаметром 6 мм наносили по 6 лунок. В лунки помещали равные объемы рабочих растворов стандартного и испытуемого образцов в концентрациях 10 МЕ/мл, 20 МЕ/мл и 40 МЕ/мл. По истечении времени инкубирования при температуре 36 ± 1 °C учитывали результаты, измеряя диаметры зон угнетения роста тест-микроорганизма при помощи соответствующих приборов с точностью до 0,1 мм в соответствии со статьей ОФС «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами».
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Выбор компонентов питательной среды, в особенности качество используемого пептона, является критически важным фактором для успешного проведения микробиологических исследований, таких как определение активности антибиотиков методом диффузии в агар [11].
В ходе исследования были приготовлены 4 варианта питательных сред, различающиеся по производителю используемого пептона (табл. 1). Результаты анализа активности неомицина на этих средах показали существенные различия.
Табл. 1. Составы питательных сред для определения методом диффузии в агар Table 1. Compositions of nutrient media for determination by diffusion into agar | ||||
Питательная среда, № | Компоненты питательной среды | рН среды | ||
1 | 2 | Агар-агар | ||
Среда Е, № 1 | Пептон для бактериологических питательных сред, ООО НИЦФ | Мясной экстракт, производитель «Sigma» кат. № В4888 | Агар-агар микробиологический, производитель «Laboratorios Conda», Испания | рН = 6,36 |
Среда Е, № 2 | Пептон основной сухой, ФБУН ГНЦ ПМБ (Оболенск) | Мясной экстракт, производитель «Sigma» кат. № В4888 | Агар-агар микробиологический, производитель «Laboratorios Conda», Испания | рН = 7,44 |
Среда Е, № 3 | Пептон бактериологический сухой, ФБУН ГНЦ ПМБ Оболенск | Мясной экстракт, производитель «Sigma» кат. № В4888 | Агар-агар микробиологический, производитель «Laboratorios Conda», Испания | pH = 6,45 |
Среда для неомицина, № 4 | ГМФ-бульон, ООО НИЦФ | Натрия фосфат двузамещенный | Агар-агар микробиологический, производитель «Laboratorios Conda», Испания | рН = 7,21 |
Как видно из табл. 1, среда 4 отличается по составу от предложенной в ЕФ среды Е. Следует отметить, что в состав среды № 4 (для определения активности неомицина) не входит такой компонент как мясной экстракт, поскольку на отечественном рынке он практически отсутствует.
Установлено, что при учете результатов диаметры зоны задержки роста на чашках с питательной средой, зоны имели разную конфигурацию и вид (рис. 1, 2). В чашках с посевами на среде № 4 (табл. 2) получали результаты активности фрамицетина 8185 ЕД. При просмотре зоны задержки роста (рис. 2) обнаружили более четкие контуры колонии, диаметр которой составил 17,21–20,33 мм. На среде № 2 рост тест-штамма микроорганизма Bacillus subtillis АТСС 6633 отсутствовал.
Рис. 1. Диаметр задержки зон фрамицетина (мм) на среде Е № 1. Примечание: О-10 – испытуемый образец фрамицетина, концентрация 10 ЕД/мл; О-20 – испытуемый образец фрамицетина, концентрация 20 ЕД/мл; К-10 – стандартный образец фрамицетина, концентрация 10 ЕД/мл; К-20 – стандартный образец фрамицетина, концентрация 20 ЕД/мл; К-40 – стандартный образец фрамицетина 10 ЕД/мл
Fig. 1. Diameter of the delay zones of framycetin (mm) on medium E No. 1. Note: O-10 – test sample of framycetin, concentration 10 U/ml; O-20 – test sample of framycetin, concentration 20 U/ml; K-10 – standard sample of framycetin, concentration 10 U/ml; K-20 – standard sample of framycetin, concentration 20 U/ml; K-40 – standard sample of framycetin 10 U/ml
Рис. 2. Диаметр задержки зон (мм) на среде № 3 фрамицетина. Примечание: О-10 – испытуемый образец фрамицетина, концентрация 10 ЕД/мл; О-20 – испытуемый образец фрамицетина, концентрация 20 ЕД/мл; К-10 – стандартный образец фрамицетина, концентрация 10 ЕД/мл; К-20 – стандартный образец фрамицетина, концентрация 20 ЕД/мл; К-40 – стандартный образец фрамицетина 10 ЕД/мл
Fig. 2. The diameter of the delay zones (mm) on the medium No. 3 of framycetin. Note: O-10 – test sample of framycetin, concentration 10 U/ml; O-20 – test sample of framycetin, concentration 20 U/ml; K-10 – standard sample of framycetin, concentration 10 U/ml; K-20 – standard sample of framycetin, concentration 20 U/ml; K-40 – standard sample of framycetin 10 U/ml
Табл. 2. Диаметры зон задержки роста фрамицетина на питательных средах Table 2. Diameters of framycetin growth retardation zones on nutrient media | ||||||||
№ эксперимента | Ожидаемая активность фрамицетина, ЕД (уровень, %) | Диаметр зон задержки роста, мм | Активность фрамицетина, ЕД | |||||
Контрольный раствор | Испытуемый раствор | |||||||
S1 | S2 | S3 | U1 | U2 | U3 | |||
1 | 8000 | 23,00 | 24,40 | 26,00 | 23,00 | 24,40 | 25,90 | 8084 |
23,00 | 24,50 | 25,90 | 23,10 | 24,50 | 25,90 | |||
23,10 | 24,80 | 26,10 | 23,20 | 24,70 | 26,00 | |||
23,00 | 24,50 | 26,00 | 23,10 | 24,50 | 26,00 | |||
23,00 | 24,50 | 25,90 | 23,00 | 24,40 | 26,10 | |||
23,10 | 24,60 | 26,00 | 23,10 | 24,70 | 26,20 | |||
3 | 8000 | 25,00 | 27,20 | 29,60 | 24,90 | 27,10 | 29,50 | 8122 |
25,10 | 27,40 | 30,20 | 25,20 | 27,40 | 30,10 | |||
25,10 | 27,60 | 31,00 | 25,30 | 27,50 | 31,00 | |||
24,90 | 27,40 | 29,40 | 25,10 | 27,30 | 29,80 | |||
25,10 | 27,30 | 30,80 | 25,10 | 27,30 | 31,00 | |||
25,20 | 27,40 | 29,90 | 25,40 | 27,60 | 30,00 | |||
4 | 8000 | 17,20 | 18,70 | 20,20 | 17,30 | 18,90 | 20,30 | 8185 |
17,20 | 18,70 | 20,20 | 17,20 | 18,80 | 20,30 | |||
17,30 | 18,90 | 20,20 | 17,40 | 18,80 | 20,40 | |||
17,10 | 18,60 | 20,30 | 17,20 | 18,70 | 20,40 | |||
17,20 | 18.70 | 20,20 | 17,20 | 18,60 | 20,40 | |||
17,30 | 18,80 | 20,30 | 17,30 | 18,80 | 20,20 | |||
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, проведенные исследования антимикробной активности с тест-штаммом микроорганизма Bacillus subtillis АТСС 6633 показали, что унифицированная питательная среда № 4 для определения антимикробной активности неомицина методом диффузии в агар может быть использована для определения антимикробной активности назального спрея «Фрамицетин».
Об авторах
Ирина Андреевна Цветкова
Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет Министерства здравоохранения Российской Федерации
Автор, ответственный за переписку.
Email: irina.cvetkova@pharminnotech.com
микробиолог Испытательной лаборатории (Центр контроля качества лекарственных средств)
Россия, Санкт-ПетербургТатьяна Федоровна Черных
Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет Министерства здравоохранения Российской Федерации
Email: ode9gova.t@yandex.ru
д-р фармацевт. наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии
Россия, Санкт-ПетербургМихаил Владимирович Жариков
Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет Министерства здравоохранения Российской Федерации
Email: mikhail05051985@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0720-501X
SPIN-код: 7818-7228
Scopus Author ID: 59257094000
ResearcherId: AAS-9156-2021
ст. лаб. кафедры промышленной экологии
Россия, Санкт-ПетербургСписок литературы
- Суханова С. М. Стандартизация требований к питательным средам, используемым для оценки качества лекарственных средств (обзор). Разработка и регистрация лекарственных средств. 2023;12(1):123–130. doi: 10.33380/2305-2066-2023-12-1-123-130
- Суханова С. М. Питательные среды в фармакопейном анализе: применение, действующие требования, вопросы стандартизации / С. М. Суханова, Н. Е. Захарова // Биопрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. – 2019. – Т. 19, № 3. – С. 136–144. – doi: 10.30895/2221-996X-2019-19-3-136-144.
- Домнина Ю. М. Оценка микробиологической чистоты назального спрея, содержащего налтрексона гидрохлорид / Ю. М. Домнина, В. В. Суслов, Н. Э. Грамматикова, С. С. Кедик // Разработка и регистрация лекарственных средств. – 2020. – Т. 9, № 4. – С. 116–120. – doi: 10.33380/2305-2066-2020-9-4-116-120.
- Кулешова С. И. Стабильность готовых и приготовленных в лаборатории питательных сред / С. И. Кулешова, С. А. Процак, С. А. Лисунова, Г. Ю. Романюк // Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. Регуляторные исследования и экспертиза лекарственных средств. – 2021. – Т. 11, № 2. – С. 130–134. – doi: 10.30895/1991-2919-2021-11-2-130-134.
- Олефир Ю. В. Экспериментальная оценка методов определения антимикробной активности препаратов хлорофиллипта / Ю. В. Олефир, А. И. Лутцева, О. В. Гунар [и др.] // Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. Регуляторные исследования и экспертиза лекарственных средств. – 2015. – № 4. – С. 47–50.
- Патент № 2720691 C1 Российская Федерация, МПК C12Q 1/02, G01N21/17, C12R1/445. Жидкая питательная среда для культивирования микроорганизмов при определении гентамицина и стрептомицина в лекарственных средствах и способ их определения турбидиметрическим методом: № 2019124515: заявл. 02.08.2019: опубл. 12.05.2020 / Е. Н. Семенова, Е. И. Саканян, С. И. Кулешова, Т. И. Краснопевцева; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ НЦЭСМП Минздрава России).
- Еремин С. А. Особенности применения топических препаратов фрамицетина сульфата в лечении риносинусита / С. А. Еремин, И. М. Дьяков, С. С. Павлова // Медицинский совет. – 2021. – № 18. – С. 158–164. – doi: 10.21518/2079-701X-2021-18-158-164.
- European Pharmacopoeia. 10th Edition. Council of Europe, 2020.
- ОФС.1.2.4.0002.18 «Микробиологическая чистота» / Государственная Фармакопея РФ ГФ XIV. T. 2, М., 2018 г. C. 1128.
- ОФС.1.2.4.0010.15 Взамен ст. ГФ XI, вып. 2 Взамен ст. ГФ XII, ч. 1, «Определение антимикробной активности антибиотиков методом диффузии в агар».
- Кулешова С. И. Определение активности антибиотиков методом диффузии в агар / С. И. Кулешова // Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. Регуляторные исследования и экспертиза лекарственных средств. – 2015. – № 3. – С. 13–17.
Дополнительные файлы
