Development of the emulsion composition and technology based on iron oleate micelles

全文:

СОКРАЩЕНИЯ:

ЖДА – железодефицитная анемия;

ОФС – общая фармакопейная статья;

ПАВ – поверхностные активные вещества.

ВВЕДЕНИЕ

Железодефицитная анемия – клинико-гематологический синдром, в основе которого лежит нарушение синтеза гемоглобина, возникающее вследствие железодефицита. Клинически ЖДА проявляется симптомами анемии и сидеропении [1].

Общая слабость, повышенная утомляемость, сниженная работоспособность, нарушение концентрации внимания, одышка при физической нагрузке, головокружение, обморочные состояния, дистрофические и атрофические изменения кожи и слизистых, снижение интенсивности общих репаративных процессов, а также ряд других, неспецифических проявлений, – все это существенно снижает качество жизни у пациентов страдающих от ЖДА, которая в том числе может являться проявлением хронических заболеваний или существенно усугублять течение последних [2]. По лабораторным показателям описываемое патологическое состояние характеризуется снижением уровня гемоглобина и цветового показателя крови, гипохромией, микроцитозом, анизоцитозом, пойкилоцитозом, не измененным, обычно, содержанием ретикулоцитов, умеренным ускорением скорости оседания эритроцитов, а также дефицитом железа в сыворотке крови [3].

Вследствие множества причин, вызывающих ЖДА, она широко распространена. Латентный дефицит железа выявляется у 12–15% обследованных, а всего от железодефицита страдает 5–10% населения. Наиболее часто ЖДА наблюдается среди детей дошкольного возраста (45%). У подростков ЖДА встречается в 25% случаев, у женщин репродуктивного возраста – в 50%. Часто бывает она и у пожилых людей [4]. Количество людей, умирающих от железодефицита, ежегодно составляет 841 тысячу [5]. Этот недуг занимает девятое место среди факторов риска в общем ряду заболеваний [6].

Современные протоколы лечения и профилактики ЖДА базируются на длительном использовании препаратов неорганических солей железа (сульфата железа (II), хлорида железа) и органических комплексов на основе гидроксида железа (гидроксид полимальтозат железа (III)), принимаемых внутрь или парентерально в зависимости от клинической ситуации. Препаратами выбора являются неорганические соли, однако они могут вызывать ряд побочных эффектов: диспептические расстройства, потемнение эмали зубов, воспалительные процессы вследствие повышения концентрации сывороточного железа [7]. На фоне продолжительной терапии некоторые пациенты проявляют низкую комплаентность к лечению.

Как следствие, разработка препаратов железа, не обладающих побочными эффектами и характеризующихся большей биодоступностью, является актуальной задачей. Активно применяются новые железосодержащие лекарственные препараты на основе нерастворимых в воде соединений железа, заключенных в мицеллы декстранов (мальтозы, изомальтозы, сахарозы и др.) [8]. Комплекс гидроксида полимальтозата железа (III) превосходит классические препараты прошлого поколения [9] по профилю безопасности, но есть сообщения о случаях их неэффективности в терапии ЖДА, что может быть связано с неоптимальными характеристиками абсорбции препарата и необходимостью обеспечивать высокую частоту приема [10].

В последние годы наблюдается курс на разработку и применение липидных транспортных систем для лекарственных средств. Липидные частицы не имеют вкуса, не токсичны, не вызывают аллергических реакций, имеют высокое сродство к мембранам клеток, что позволяет доставлять лекарство внутрь клетки [11]. В мире зарегистрировано несколько десятков препаратов на основе липидов, многие из которых находятся на последних стадиях клинических исследований.

На смену технологическим процессам с применением микрочастиц (жировые эмульсии) приходят технологии, позволяющие получать частицы нанометрового диапазона (липосомы, мицеллы, микро- и наноэмульсии). Подобные носители могут существенно облегчать всасывание и прохождение лекарственных средств через биологические мембраны, улучшать профиль тканевого и клеточного распределения. Нанобиотехнологический подход существенно повышает безопасность лекарственных средств, снижает их токсичность и риск развития побочных эффектов [12].

Настоящее исследование посвящено разработке новых лекарственных средств в форме микроэмульсии для терапии ЖДА на основе липофильных соединений железа с олеиновой кислотой. Аналоги создаваемых соединений представлены на фармацевтическом рынке, будучи зарегистрированными исключительно в качестве биологически активных пищевых добавок (Lipofer, Сидерал Форте).

Препараты железа на основе липидных частиц могут оказаться крайне эффективными, поскольку не имеют описанных выше проблем и отличаются от используемого классическими препаратами механизма проникновения в клетку (рис. 1). Они способны обеспечить защиту иона железа от окисления в водных средах пищеварительного тракта [13, 14]. Кроме того, основные и вспомогательные вещества, входящие в состав разрабатываемого препарата (жирные ненасыщенные кислоты), смогут дополнительно способствовать увеличению захвата энтероцитами доставляемого железа [15, 16].

 

Рис. 1. Известные механизмы транспорта железа, а также предположительный механизм для исследуемого соединения мицелл на основе олеата железа на схематичной иллюстрации энтероцита. DcytB – дуоденальный цитохром B или цитохром B редуктаза 1; FP – ферропортин; FeOl – олеат железа; HCP1 – транспортный белок гема; FLVCR – экспортер гема; steap3 – металлоредуктаза; NHE3 – натриево-водородный антипортер / Fig. 1. Traditional mechanisms of iron transport, as well as the proposed mechanism for the investigated compound of micelles based on iron oleate in a schematic illustration of an enterocyte. DcytB – duodenal cytochrome B or cytochrome B reductase 1; FP – ferroportin; FeOl – iron oleate; HCP1 – heme transport protein; FLVCR – heme exporter; steap3 – metalloreductase; NHE3 – sodium-hydrogen antiporter

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В процессе исследования использовались следующие реактивы: нитрат железа (III) 9-водный (98%, «Невареактив», Россия), олеиновая кислота (Ч, «Вектон», Россия), аскорбил пальмитат (99,18%, «Naturfree», Россия), бутанол-1 (ЧДА, «Ленреактив», Россия), аскорбиновая кислота (ЧДА, «Ленреактив», Россия), 1,10-фенантролина моногидрат (ХЧ, «Вектон», Россия), полисорбат-20 (Технический, PANZERI, Италия).

Для получения олеата железа (III) была использована описанная ранее методика с незначительными модификациями [17]. Олеат железа (III) с концентрацией по иону железа 25 мг/г был получен путем смешивания 1,1 г (0,03 моль) нитрата железа с 6,0 г (0,21 моль) олеиновой кислоты. После этого смесь нагревалась до 90 ℃ в течение 24 часов при постоянном перемешивании (схема 1). Контроль полноты протекания реакции осуществлялся по полному исчезновению твердого осадка и отсутствию выделений кислых газов (NO2).

 

$\mathrm{Fe}{\left({\mathrm{NO}}_3\right)}_3+{}_3\mathrm{C}_{17}{\mathrm{H}}_{33}\mathrm{COOH}\underset{-{\mathrm{NO}}_2; -{\mathrm{H}}_2\mathrm{O}}{\overset{{\mathrm{t}}^0={90}^0}{\to }}{\left({\mathrm{C}}_{17}{\mathrm{H}}_{33}\mathrm{COO}\right)}_3\mathrm{Fe}$

Схема 1. Реакция получения олеата железа (III) / Scheme 1. Reaction for obtaining iron (III) oleate.

 

К 3 г полученного ранее раствора олеата железа (III) было добавлено 0,56 г аскорбил пальмитата в эквимолярном соотношении к иону железа. Смесь перемешивалась 24 часа при температуре 90 ℃. Итоговая теоретическая концентрация ионов железа (II) и (III) в смеси составила 21,1 мг/г.

Для определения концентрации ионов железа в полученных соединениях было проведено спектрофотометрическое исследование с использованием раствора 1,10-фенантролина моногидрата. Олеаты железа (II) и (III) были растворены в бутаноле-1 в концентрации 40 мкг/мл. В качестве базы сравнения был использован раствор олеиновой кислоты в бутаноле-1 в концентрации 40 мкг/мл.

Для проведения количественной оценки были использованы растворы 1,10-фенантролина моногидрата в бутаноле-1 с концентрацией 3,5 мг/мл и аскорбиновой кислоты (восстановитель) с концентрацией 3 мг/мл с учетом 10-кратного избытка по отношению к ионам железа в итоговом растворе. Исходные растворы олеатов были разбавлены до предполагаемой концентрации ионов железа в 1 мг/мл (растворы образцов). В качестве образца сравнения был использован раствор нитрата железа (III) в бутаноле с аналогичной концентрации ионов железа. Перед регистрацией спектров растворы были дополнительно разбавлены бутанолом-1, затем к ним были добавлены раствор фенантролина и восстановителя. Точные составы анализируемых растворов отображены в таблице 1.

 

Табл. 1. Составы анализируемых растворов / Table 1. Composition of the analyzed solutions

Название образца	Объем раствора образца, мкл	Объем бутанола-1, мкл	Объем раствора восстановителя, мкл	Объем раствора фенантролина
Олеат железа (III)	10	890	-	100
Олеат железа (II)	10	890	-	100
Олеат железа (III) восст.	10	790	100	100
Олеат железа (II) восст.	10	790	100	100
Нитрат железа (III) восст.	10	790	100	100

 

Для получения эмульсии 400 мг олеата железа (III) или 200 мг олеата железа (II) были доведены до 1 мл водным раствором полисорбата 20 (0,035 М) с последующей ультразвуковой обработкой в ультразвуковой ванне ODA-LQ40 (ОДА сервис, Россия) в течение пяти минут при температуре 25 ℃ (частота: 40 кГц, мощность: 120 Вт).

Регистрация спектров была проведена в диапазоне длин волн 200-600 нм с шагом в 1 нм в 10-миллиметровых кварцевых кюветах с использованием спектрофотометра NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, США).

Оценка размеров частиц для определения устойчивости эмульсии была проведена методом динамического светорассеяния на приборе Zetasizer nano ZS (Malvern Panalytical, Великобритания) с использованием He-Ne лазера мощностью 4 мВт на длине волны 633 нм. Анализ был выполнен при угле измерения в 173° и постоянной температуре 25 °C.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение олеата железа (III) и (II). Полученные соединения обладали близким к черному цветом, олеат железа (III) имел темно-бурый оттенок, а олеат железа (II) – темно-зеленый. Растворы обладали высокой вязкостью и малой текучестью, поэтому концентрации ионов железа были выражены в миллиграммах на грамм олеиновой кислоты.

Текущее исследование связано с разработкой активных фармацевтических субстанций, по этой причине необходимо было разработать метод определения точной концентрации ионов железа в полученных соединениях. Проблема заключалась в том, что олеаты железа и используемый в реакции аскорбил пальмитат – гидрофобные соединения, плохо растворимые в воде и этаноле. Стандартные методы испытаний, описанные в ОФС 1.2.2.2.0011.15 «Железо» [18], оказались неприменимыми для задач исследования. Решением проблемы оказалось использование бутанола-1 в качестве растворителя олеатов железа, аскорбиновой кислоты и фенантролина.

Кривая поглощения комплекса фенантролина с ионом железа (II), полученная спектрофотометрически, имеет характер, схожий со спектром данного комплекса в водно-этанольном растворе [19]. Очевидное отличие – батохромный сдвиг спектра с максимумом поглощения на 543 нм.

Определение концентрации осуществлялось путем сравнения максимумов поглощения анализируемых растворов со стандартным раствором нитрата железа известной концентрации. Данные были получены путем расчета с использованием формулы:

$\mathrm{C}\left({\mathrm{FeOl}}_{\mathrm{x}}\right)=\frac{\mathrm{A}\left({\mathrm{FeNO}}_3\right)\times \mathrm{C}\left({\mathrm{FeNO}}_3\right)\times \mathrm{k}}{\mathrm{A}\left({\mathrm{FeOl}}_{\mathrm{x}}\right)-\mathrm{A}\left({\mathrm{FeOl}}_{3 \mathrm{невосст}}\right)},$

где

C (FeOlx) – концентрация олеата железа;

C (FeNO3) – концентрация нитрата железа;

A (FeNO3) – показатель поглощения нитрата железа;

A (FeOlx) – показатель поглощения олеата железа;

A (FeOl3 невосст) – показатель поглощения невосстановленного олеата железа (III);

k – коэффициент разведения растворов.

В качестве базовой линии для растворов олеата железа после проведения реакции восстановления был выбран раствор невосстановленного олеата железа (III).

Как и ожидалось, в случае олеата железа (III) реакция с фенантролином не дала аналитического отклика. Олеат железа (II), напротив, показал наличие двухвалентных ионов в концентрации 4,77 мг/г. Общая концентрация ионов железа в анализируемых олеатах обоих типов была одинаковой. Пересчет на изначальный раствор в олеиновой кислоте показал, что концентрация оказалась близка к предполагаемым значениям и составила 21,37 мг/г для олеата железа (III) и 26,055 мг/г для олеата железа (II). Результаты спектрофотометрического анализа концентраций представлены на рисунке 2.

 

Рис. 2. Результаты спектроскопии поглощения комплексов железа с фенантролином / Fig. 2. Results of absorption spectroscopy of iron complexes with phenanthroline

 

Оценка полученных эмульсий. Оценка размера мицелл полученных эмульсий методом динамического светорассеяния приведена на рисунке 3. Следует отметить, что олеат железа (II) в концентрации 400 мг/мл образовал неустойчивую эмульсию, коагулирующую в течение нескольких минут. Данное явление может быть объяснено присутствием в составе смеси аскорбил пальмитата, негативно влияющего на мицеллообразующую способность использованного поверхностно-активного вещества. Снижение концентрации до 200 мг/мл и увеличение концентрации ПАВ в два раза позволило добиться получения стабильной эмульсии, пригодной для использования в дальнейших экспериментах.

 

Рис. 3. Распределение гидродинамических размеров мицелл, определенное методом динамического светорассеяния / Fig. 3. Hydrodynamic size distribution of micelles determined by dynamic light scattering

 

Полученные эмульсии характеризуются средними размерами 658,2 нм и 1654 нм и индексами полидисперсности 0,509 и 0,669 для эмульсии олеата железа (III) и (II) соответственно.

ВЫВОДЫ

Проведенное исследование показало возможность получения эмульсий на основе соединений олеата железа (II) и (III), обладающих потенциалом к применению в качестве лекарственных средств для терапии ЖДА. В работе представлены решения для количественной оценки концентраций действующих веществ разрабатываемых препаратов. Продемонстрирована принципиальная возможность проведения восстановления иона железа в олеиновой кислоте in situ с использованием липофильного восстановителя – аскорбил пальмитата.

Запланированы in vitro исследования разработанных эмульсий на основе соединений олеата железа (II) и (III), а также изучение их терапевтической эффективности и профиля безопасности на модели алиментарной ЖДА. Кроме того, планируется оценка возможности масштабирования технологии разработанных препаратов.

作者简介

Mikhail Trofimov

Alferov Saint Petersburg National Research Academic University of the Russian Academy of Sciences

Email: mihail.trofimov@pharminnotech.com

Postgraduate at the Department of Condensed Matter Physics

俄罗斯联邦, Saint Petersburg

Alexander Goncharenko

“QR.bio”, LLC

Email: alexs.goncharenko@yandex.ru

Chief Operating Officer

俄罗斯联邦, Saint Petersburg

Grigory Plisko

Saint Petersburg State Chemical and Pharmaceutical University

Email: grigoriy.plisko@pharminnotech.com

Researcher at the Center for Experimental Pharmacology

俄罗斯联邦, Saint Petersburg

Evgeny Semivelichenko

Saint Petersburg State Chemical and Pharmaceutical University

编辑信件的主要联系方式.
Email: evgeniy.semivelichenko@pharminnotech.com

Researcher at the Center for Experimental Pharmacology

俄罗斯联邦, Saint Petersburg

Albert Muslimov

“QR.bio”, LLC

Email: albert.r.muslimov@gmail.com

General manager

俄罗斯联邦, Saint Petersburg

Arina Ivkina

Saint Petersburg State Chemical and Pharmaceutical University

Email: arina.ivkina@pharminnotech.com

Senior Researcher at the Center for Experimental Pharmacology

俄罗斯联邦, Saint Petersburg

参考

补充文件