Разработка состава и технологии эмульсий на основе мицелл олеатов железа
- Авторы: Трофимов М.А.1, Гончаренко А.А.2, Плиско Г.А.3, Семивеличенко Е.Д.3, Муслимов А.Р.2, Ивкина А.С.3
-
Учреждения:
- Санкт-Петербургский национальный исследовательский Академический университет имени Ж. И. Алферова Российской академии наук
- Компания с ограниченной ответственностью "QR.bio"
- Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет
- Выпуск: Том 3, № 4 (2021)
- Страницы: 28-34
- Раздел: Медико-биологические науки
- URL: https://journals.eco-vector.com/PharmForm/article/view/106232
- DOI: https://doi.org/10.17816/phf106232
- ID: 106232
Цитировать
Полный текст
Аннотация
В данной статье рассматривается проблема лекарственных средств для терапии железодефицитной анемии. Железодефицитная анемия – клинико-гематологический синдром, в основе которого лежит нарушение синтеза гемоглобина, возникающее вследствие железодефицита. Клинически ЖДА проявляется симптомами анемии и сидеропении. Целью настоящего исследования являлась разработка новых лекарственных средства в форме микроэмульсии для терапии ЖДА на основе липофильных соединений железа с олеиновой кислотой. Аналоги создаваемых соединений представлены на фармацевтическом рынке, будучи зарегистрированными исключительно в качестве биологически активных пищевых добавок (Lipofer, Сидерал Форте). В ходе исследования олеат железа (III) с концентрацией по иону железа 25 мг/г был получен путем смешивания 1,1 г (0,03 моль) нитрата железа с 6,0 г (0,21 моль) олеиновой кислоты. После этого смесь нагревалась до 90 ℃ в течение 24 часов при постоянном перемешивании. К 3 г полученного ранее раствора олеата железа (III) было добавлено 0,56 г аскорбил пальмитата в эквимолярном соотношении к иону железа. Смесь перемешивалась 24 часа при температуре 90 ℃. Полученная эмульсия олеата железа (II) показала наличие двухвалентных ионов в концентрации 4,77 мг/г.
Полный текст
СОКРАЩЕНИЯ:
ЖДА – железодефицитная анемия;
ОФС – общая фармакопейная статья;
ПАВ – поверхностные активные вещества.
ВВЕДЕНИЕ
Железодефицитная анемия – клинико-гематологический синдром, в основе которого лежит нарушение синтеза гемоглобина, возникающее вследствие железодефицита. Клинически ЖДА проявляется симптомами анемии и сидеропении [1].
Общая слабость, повышенная утомляемость, сниженная работоспособность, нарушение концентрации внимания, одышка при физической нагрузке, головокружение, обморочные состояния, дистрофические и атрофические изменения кожи и слизистых, снижение интенсивности общих репаративных процессов, а также ряд других, неспецифических проявлений, – все это существенно снижает качество жизни у пациентов страдающих от ЖДА, которая в том числе может являться проявлением хронических заболеваний или существенно усугублять течение последних [2]. По лабораторным показателям описываемое патологическое состояние характеризуется снижением уровня гемоглобина и цветового показателя крови, гипохромией, микроцитозом, анизоцитозом, пойкилоцитозом, не измененным, обычно, содержанием ретикулоцитов, умеренным ускорением скорости оседания эритроцитов, а также дефицитом железа в сыворотке крови [3].
Вследствие множества причин, вызывающих ЖДА, она широко распространена. Латентный дефицит железа выявляется у 12–15% обследованных, а всего от железодефицита страдает 5–10% населения. Наиболее часто ЖДА наблюдается среди детей дошкольного возраста (45%). У подростков ЖДА встречается в 25% случаев, у женщин репродуктивного возраста – в 50%. Часто бывает она и у пожилых людей [4]. Количество людей, умирающих от железодефицита, ежегодно составляет 841 тысячу [5]. Этот недуг занимает девятое место среди факторов риска в общем ряду заболеваний [6].
Современные протоколы лечения и профилактики ЖДА базируются на длительном использовании препаратов неорганических солей железа (сульфата железа (II), хлорида железа) и органических комплексов на основе гидроксида железа (гидроксид полимальтозат железа (III)), принимаемых внутрь или парентерально в зависимости от клинической ситуации. Препаратами выбора являются неорганические соли, однако они могут вызывать ряд побочных эффектов: диспептические расстройства, потемнение эмали зубов, воспалительные процессы вследствие повышения концентрации сывороточного железа [7]. На фоне продолжительной терапии некоторые пациенты проявляют низкую комплаентность к лечению.
Как следствие, разработка препаратов железа, не обладающих побочными эффектами и характеризующихся большей биодоступностью, является актуальной задачей. Активно применяются новые железосодержащие лекарственные препараты на основе нерастворимых в воде соединений железа, заключенных в мицеллы декстранов (мальтозы, изомальтозы, сахарозы и др.) [8]. Комплекс гидроксида полимальтозата железа (III) превосходит классические препараты прошлого поколения [9] по профилю безопасности, но есть сообщения о случаях их неэффективности в терапии ЖДА, что может быть связано с неоптимальными характеристиками абсорбции препарата и необходимостью обеспечивать высокую частоту приема [10].
В последние годы наблюдается курс на разработку и применение липидных транспортных систем для лекарственных средств. Липидные частицы не имеют вкуса, не токсичны, не вызывают аллергических реакций, имеют высокое сродство к мембранам клеток, что позволяет доставлять лекарство внутрь клетки [11]. В мире зарегистрировано несколько десятков препаратов на основе липидов, многие из которых находятся на последних стадиях клинических исследований.
На смену технологическим процессам с применением микрочастиц (жировые эмульсии) приходят технологии, позволяющие получать частицы нанометрового диапазона (липосомы, мицеллы, микро- и наноэмульсии). Подобные носители могут существенно облегчать всасывание и прохождение лекарственных средств через биологические мембраны, улучшать профиль тканевого и клеточного распределения. Нанобиотехнологический подход существенно повышает безопасность лекарственных средств, снижает их токсичность и риск развития побочных эффектов [12].
Настоящее исследование посвящено разработке новых лекарственных средств в форме микроэмульсии для терапии ЖДА на основе липофильных соединений железа с олеиновой кислотой. Аналоги создаваемых соединений представлены на фармацевтическом рынке, будучи зарегистрированными исключительно в качестве биологически активных пищевых добавок (Lipofer, Сидерал Форте).
Препараты железа на основе липидных частиц могут оказаться крайне эффективными, поскольку не имеют описанных выше проблем и отличаются от используемого классическими препаратами механизма проникновения в клетку (рис. 1). Они способны обеспечить защиту иона железа от окисления в водных средах пищеварительного тракта [13, 14]. Кроме того, основные и вспомогательные вещества, входящие в состав разрабатываемого препарата (жирные ненасыщенные кислоты), смогут дополнительно способствовать увеличению захвата энтероцитами доставляемого железа [15, 16].
Рис. 1. Известные механизмы транспорта железа, а также предположительный механизм для исследуемого соединения мицелл на основе олеата железа на схематичной иллюстрации энтероцита. DcytB – дуоденальный цитохром B или цитохром B редуктаза 1; FP – ферропортин; FeOl – олеат железа; HCP1 – транспортный белок гема; FLVCR – экспортер гема; steap3 – металлоредуктаза; NHE3 – натриево-водородный антипортер / Fig. 1. Traditional mechanisms of iron transport, as well as the proposed mechanism for the investigated compound of micelles based on iron oleate in a schematic illustration of an enterocyte. DcytB – duodenal cytochrome B or cytochrome B reductase 1; FP – ferroportin; FeOl – iron oleate; HCP1 – heme transport protein; FLVCR – heme exporter; steap3 – metalloreductase; NHE3 – sodium-hydrogen antiporter
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В процессе исследования использовались следующие реактивы: нитрат железа (III) 9-водный (98%, «Невареактив», Россия), олеиновая кислота (Ч, «Вектон», Россия), аскорбил пальмитат (99,18%, «Naturfree», Россия), бутанол-1 (ЧДА, «Ленреактив», Россия), аскорбиновая кислота (ЧДА, «Ленреактив», Россия), 1,10-фенантролина моногидрат (ХЧ, «Вектон», Россия), полисорбат-20 (Технический, PANZERI, Италия).
Для получения олеата железа (III) была использована описанная ранее методика с незначительными модификациями [17]. Олеат железа (III) с концентрацией по иону железа 25 мг/г был получен путем смешивания 1,1 г (0,03 моль) нитрата железа с 6,0 г (0,21 моль) олеиновой кислоты. После этого смесь нагревалась до 90 ℃ в течение 24 часов при постоянном перемешивании (схема 1). Контроль полноты протекания реакции осуществлялся по полному исчезновению твердого осадка и отсутствию выделений кислых газов (NO2).
Схема 1. Реакция получения олеата железа (III) / Scheme 1. Reaction for obtaining iron (III) oleate.
К 3 г полученного ранее раствора олеата железа (III) было добавлено 0,56 г аскорбил пальмитата в эквимолярном соотношении к иону железа. Смесь перемешивалась 24 часа при температуре 90 ℃. Итоговая теоретическая концентрация ионов железа (II) и (III) в смеси составила 21,1 мг/г.
Для определения концентрации ионов железа в полученных соединениях было проведено спектрофотометрическое исследование с использованием раствора 1,10-фенантролина моногидрата. Олеаты железа (II) и (III) были растворены в бутаноле-1 в концентрации 40 мкг/мл. В качестве базы сравнения был использован раствор олеиновой кислоты в бутаноле-1 в концентрации 40 мкг/мл.
Для проведения количественной оценки были использованы растворы 1,10-фенантролина моногидрата в бутаноле-1 с концентрацией 3,5 мг/мл и аскорбиновой кислоты (восстановитель) с концентрацией 3 мг/мл с учетом 10-кратного избытка по отношению к ионам железа в итоговом растворе. Исходные растворы олеатов были разбавлены до предполагаемой концентрации ионов железа в 1 мг/мл (растворы образцов). В качестве образца сравнения был использован раствор нитрата железа (III) в бутаноле с аналогичной концентрации ионов железа. Перед регистрацией спектров растворы были дополнительно разбавлены бутанолом-1, затем к ним были добавлены раствор фенантролина и восстановителя. Точные составы анализируемых растворов отображены в таблице 1.
Табл. 1. Составы анализируемых растворов / Table 1. Composition of the analyzed solutions
Название образца | Объем раствора образца, мкл | Объем бутанола-1, мкл | Объем раствора восстановителя, мкл | Объем раствора фенантролина |
Олеат железа (III) | 10 | 890 | - | 100 |
Олеат железа (II) | 10 | 890 | - | 100 |
Олеат железа (III) восст. | 10 | 790 | 100 | 100 |
Олеат железа (II) восст. | 10 | 790 | 100 | 100 |
Нитрат железа (III) восст. | 10 | 790 | 100 | 100 |
Для получения эмульсии 400 мг олеата железа (III) или 200 мг олеата железа (II) были доведены до 1 мл водным раствором полисорбата 20 (0,035 М) с последующей ультразвуковой обработкой в ультразвуковой ванне ODA-LQ40 (ОДА сервис, Россия) в течение пяти минут при температуре 25 ℃ (частота: 40 кГц, мощность: 120 Вт).
Регистрация спектров была проведена в диапазоне длин волн 200-600 нм с шагом в 1 нм в 10-миллиметровых кварцевых кюветах с использованием спектрофотометра NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, США).
Оценка размеров частиц для определения устойчивости эмульсии была проведена методом динамического светорассеяния на приборе Zetasizer nano ZS (Malvern Panalytical, Великобритания) с использованием He-Ne лазера мощностью 4 мВт на длине волны 633 нм. Анализ был выполнен при угле измерения в 173° и постоянной температуре 25 °C.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Получение олеата железа (III) и (II). Полученные соединения обладали близким к черному цветом, олеат железа (III) имел темно-бурый оттенок, а олеат железа (II) – темно-зеленый. Растворы обладали высокой вязкостью и малой текучестью, поэтому концентрации ионов железа были выражены в миллиграммах на грамм олеиновой кислоты.
Текущее исследование связано с разработкой активных фармацевтических субстанций, по этой причине необходимо было разработать метод определения точной концентрации ионов железа в полученных соединениях. Проблема заключалась в том, что олеаты железа и используемый в реакции аскорбил пальмитат – гидрофобные соединения, плохо растворимые в воде и этаноле. Стандартные методы испытаний, описанные в ОФС 1.2.2.2.0011.15 «Железо» [18], оказались неприменимыми для задач исследования. Решением проблемы оказалось использование бутанола-1 в качестве растворителя олеатов железа, аскорбиновой кислоты и фенантролина.
Кривая поглощения комплекса фенантролина с ионом железа (II), полученная спектрофотометрически, имеет характер, схожий со спектром данного комплекса в водно-этанольном растворе [19]. Очевидное отличие – батохромный сдвиг спектра с максимумом поглощения на 543 нм.
Определение концентрации осуществлялось путем сравнения максимумов поглощения анализируемых растворов со стандартным раствором нитрата железа известной концентрации. Данные были получены путем расчета с использованием формулы:
где
C (FeOlx) – концентрация олеата железа;
C (FeNO3) – концентрация нитрата железа;
A (FeNO3) – показатель поглощения нитрата железа;
A (FeOlx) – показатель поглощения олеата железа;
A (FeOl3 невосст) – показатель поглощения невосстановленного олеата железа (III);
k – коэффициент разведения растворов.
В качестве базовой линии для растворов олеата железа после проведения реакции восстановления был выбран раствор невосстановленного олеата железа (III).
Как и ожидалось, в случае олеата железа (III) реакция с фенантролином не дала аналитического отклика. Олеат железа (II), напротив, показал наличие двухвалентных ионов в концентрации 4,77 мг/г. Общая концентрация ионов железа в анализируемых олеатах обоих типов была одинаковой. Пересчет на изначальный раствор в олеиновой кислоте показал, что концентрация оказалась близка к предполагаемым значениям и составила 21,37 мг/г для олеата железа (III) и 26,055 мг/г для олеата железа (II). Результаты спектрофотометрического анализа концентраций представлены на рисунке 2.
Рис. 2. Результаты спектроскопии поглощения комплексов железа с фенантролином / Fig. 2. Results of absorption spectroscopy of iron complexes with phenanthroline
Оценка полученных эмульсий. Оценка размера мицелл полученных эмульсий методом динамического светорассеяния приведена на рисунке 3. Следует отметить, что олеат железа (II) в концентрации 400 мг/мл образовал неустойчивую эмульсию, коагулирующую в течение нескольких минут. Данное явление может быть объяснено присутствием в составе смеси аскорбил пальмитата, негативно влияющего на мицеллообразующую способность использованного поверхностно-активного вещества. Снижение концентрации до 200 мг/мл и увеличение концентрации ПАВ в два раза позволило добиться получения стабильной эмульсии, пригодной для использования в дальнейших экспериментах.
Рис. 3. Распределение гидродинамических размеров мицелл, определенное методом динамического светорассеяния / Fig. 3. Hydrodynamic size distribution of micelles determined by dynamic light scattering
Полученные эмульсии характеризуются средними размерами 658,2 нм и 1654 нм и индексами полидисперсности 0,509 и 0,669 для эмульсии олеата железа (III) и (II) соответственно.
ВЫВОДЫ
Проведенное исследование показало возможность получения эмульсий на основе соединений олеата железа (II) и (III), обладающих потенциалом к применению в качестве лекарственных средств для терапии ЖДА. В работе представлены решения для количественной оценки концентраций действующих веществ разрабатываемых препаратов. Продемонстрирована принципиальная возможность проведения восстановления иона железа в олеиновой кислоте in situ с использованием липофильного восстановителя – аскорбил пальмитата.
Запланированы in vitro исследования разработанных эмульсий на основе соединений олеата железа (II) и (III), а также изучение их терапевтической эффективности и профиля безопасности на модели алиментарной ЖДА. Кроме того, планируется оценка возможности масштабирования технологии разработанных препаратов.
Об авторах
Михаил Андреевич Трофимов
Санкт-Петербургский национальный исследовательский Академический университет имени Ж. И. Алферова Российской академии наук
Email: mihail.trofimov@pharminnotech.com
аспирант кафедры физики конденсированного состояния
Россия, Санкт-ПетербургАлександр Александрович Гончаренко
Компания с ограниченной ответственностью "QR.bio"
Email: alexs.goncharenko@yandex.ru
главный операционный директор
Россия, Санкт-Петербург
Григорий Алексеевич Плиско
Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет
Email: grigoriy.plisko@pharminnotech.com
научный сотрудник центра экспериментальной фармакологии
Россия, Санкт-ПетербургЕвгений Дмитриевич Семивеличенко
Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет
Автор, ответственный за переписку.
Email: evgeniy.semivelichenko@pharminnotech.com
научный сотрудник центра экспериментальной фармакологии
Россия, Санкт-ПетербургАльберт Радикович Муслимов
Компания с ограниченной ответственностью "QR.bio"
Email: albert.r.muslimov@gmail.com
генеральный директор
Россия, Санкт-ПетербургАрина Сергеевна Ивкина
Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет
Email: arina.ivkina@pharminnotech.com
старший научный сотрудник центра экспериментальной фармакологии
Россия, Санкт-ПетербургСписок литературы
- Cappellini M. D., Musallam K. M., Taher A. T. Iron deficiency anaemia revisited // J. Intern. Med. 2020. Vol. 287, no. 2. P. 153–170.
- Soppi E. T. Iron deficiency without anemia – a clinical challenge // Clin. Case Rep. 2018. Vol. 6, no. 6. P. 1082–1086.
- Goddard A. F., et al. Guidelines for the management of iron deficiency anaemia // Gut. 2011. Vol. 60, no. 10. P. 1309–1316.
- Mayo Clinic family health book. Fifth edition / eds. Litin S. C., Nanda S., Mayo Clinic. Rochester, MN: Mayo Clinic; 2018. 1391 p.
- Балашова Е. Л. Современные подходы к диагностике железодефицитной анемии у детей / Е. Л. Балашова, Л. И. Мазур // Российский вестник перинатологии и педиатрии. 2015. – Т. 60. – № 4. – С. 31–36.
- Ромашевская И. П. Современные подходы к диагностике и терапии железодефицитных анемий / И. П. Ромашевская, В. В. Кошкевич. – Гомель: РНПЦРМиЭЧ, 2018. – 16 с.
- Tolkien Z., et al. Ferrous Sulfate Supplementation Causes Significant Gastrointestinal Side-Effects in Adults: A Systematic Review and Meta-Analysis // PLOS ONE. 2015. Vol. 10, no. 2. P. e0117383. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0117383
- Biggar P., Hahn K.-M. Importance of the different i.v. iron generations for everyday medical practice // MMW Fortschr. Med. 2013. Vol. 155. Suppl 1. P. 18–24.
- Geisser P. Safety and Efficacy of Iron (III)-hydroxide Polymaltose Complex // Arzneimittelforschung. 2011. Vol. 57, no. 6. P. 439–452.
- Santiago P. Ferrous versus Ferric Oral Iron Formulations for the Treatment of Iron Deficiency: A Clinical Overview // Sci. World J. 2012. Vol. 2012. P. 1–5.
- Sharma A., Madhunapantula S. V., Robertson G. P. Toxicological considerations when creating nanoparticle-based drugs and drug delivery systems // Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 2012. Vol. 8, no. 1. P. 47–69.
- Paliwal R., et al. Solid lipid nanoparticles: a review on recent perspectives and patents // Expert Opin. Ther. Pat. 2020. Vol. 30, no. 3. P. 179–194.
- Miller C. J., Rose A. L., Waite T. D. Importance of Iron Complexation for Fenton-Mediated Hydroxyl Radical Production at Circumneutral pH // Front. Mar. Sci. 2016. Vol. 3. https://doi.org/10.3389/fmars.2016.00134
- Kell D. B. Towards a unifying, systems biology understanding of large-scale cellular death and destruction caused by poorly liganded iron: Parkinson’s, Huntington’s, Alzheimer’s, prions, bactericides, chemical toxicology and others as examples // Arch. Toxicol. 2010. Vol. 84, no. 11. P. 825–889.
- Droke E. A., Briske-Anderson M., Lukaski H. C. Fatty Acids Alter Monolayer Integrity, Paracellular Transport, and Iron Uptake and Transport in Caco-2 Cells // Biol. Trace Elem. Res. 2003. Vol. 95, no. 3. P. 219–232.
- Nagy K., Tiuca I.-D. Importance of Fatty Acids in Physiopathology of Human Body / In: Fatty Acids, ed. Catala A. // London: IntechOpen; 2017. 248 p.
- Kim D. K., Lee J. W. Synthesis of Non-hydrate Iron Oleate for Eco-friendly Production of Monodispersed Iron Oxide Nanoparticles // J. Korean Ceram. Soc. 2018. Vol. 55, no. 6. P. 625–634.
- ОФС.1.2.2.2.0011.15 Железо // Государственная Фармакопея Российской Федерации. – XIV издание. – Т. I. – C. 975.
- Mudasira, Yoshiokab N., Inoueb H. DNA Binding of Iron (II)-Phenanthroline Complexes: Effect of Methyl Substitution on Thermodynamic Parameters // Z. Für Naturforschung B. 2008. Vol. 63, no. 1. P. 37–46.
Дополнительные файлы
![](/img/style/loading.gif)