Cognitive tests in zebrafish (Danio rerio): T- and Y-mazes

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Когнитивные функции являются основой сложных форм поведения человека и животных и чрезвычайно важны для адаптации организма к окружающей среде. В экспериментальной нейробиологии и когнитивной биологии различные Т- и Y-образные лабиринты традиционно используются для оценки пространственного обучения и памяти как грызунов, так и рыб. В частности, оба теста — эффективные методы оценки аффективного фенотипа зебраданио. Стандартные протоколы и наиболее актуальные аспекты применения данных тестов будут рассмотрены ниже.

Т-ОБРАЗНЫЙ ЛАБИРИНТ

Т-образный лабиринт (T-maze) широко используют для оценки пространственного обучения и памяти грызунов [1] и рыб [2] (см. рисунок и таблицу). Он также применяется для оценки влияния фармакологических препаратов на поведение животных [3]. Методика исследования включает в себя два этапа: обучение и тестирование. Перед проведением обучения зебраданио подвергаются предварительной экспозиции в лабиринте в течение нескольких дней (3–5) для снижения эффекта новизны. На этапе обучения для формирования более стойких рефлексов используется как положительное (например, пищевое) подкрепление, так и негативное (например, электрический ток) [4]. Один из недостатков данного теста — длительность его обучения, которое может занимать 8–10 дней.

 

Рисунок. Общая схема эксперимента в Т-образном лабиринте

 

Таблица. Основные параметры, регистрируемые у зебраданио в тесте Т-образного лабиринта
Параметр	Описание
Замирание (фризинг)	Отсутствие заметного движения рыбы, кроме глаз и жаберных крышек, более чем на 2 с. При автоматизированном подсчете фризингом считается движение со скоростью менее 0,1 см/с. Увеличение данного параметра свидетельствует о повышении уровня тревожности, седации
Общая локомоторная активность	Общая пройденная дистанция (см или м). Увеличение данного параметра свидетельствует о повышении исследовательской активности зебраданио
Число заходов в правильный рукав	Число, продолжительность нахождения в правильном рукаве, а также латентный период первого захода в правильный рукав. Увеличение числа и продолжительности выходов рассматривается как положительный эффект от обучения. Укорочение латентного периода первого захода в правильный рукав также свидетельствует о формировании устойчивого рефлекса
Число заходов в неправильный рукав	Число, продолжительность нахождения в неправильном рукаве. Увеличение длительности нахождения свидетельствует о негативном влиянии на память и отсутствии сформированного рефлекса

 

Существует несколько модификаций данного теста, как методологических, так и технических. Классическая установка представляет собой Т-образный лабиринт, имеющий один длинный стартовый рукав (например, 300 мм × 80 мм × 60 мм) и два коротких рукава (например, 80 мм × 65 мм × 60 мм), располагающихся перпендикулярно. Один из коротких рукавов маркируется как «целевой рукав», второй соответственно относится к категории «неправильный рукав». В целевом рукаве находится положительный стимул в виде еды или сородичей, при заходе в неправильный рукав зебраданио получает разряд током (1–2 В, 0,3–0,5 мА). На концах коротких рукавов могут располагаться расширения, представляющие собой прямоугольную камеру. Стартовый длинный рукав делится на 2 зоны, разделенные непрозрачной перегородкой: стартовую и новый рукав. Перед началом тестирования животное помещают в стартовую зону на 30 с, затем убирают перегородку, позволяя животному свободно исследовать оба рукава Т-образного лабиринта.

Ежедневно животных подвергают трем обучающим сессиям, в течение которых при нахождении рыбы в неправильном рукаве она получает удар электрическим током (не более 3 ударов током за сессию). Модификации в методике могут выражаться в наличии положительного и отрицательного стимулов постоянно в одних и тех же рукавах, либо каждую обучающую сессию целевой и неправильный рукава маркируются рандомно. Сочетания положительного и отрицательного стимула могут варьироваться в зависимости от целей эксперимента и использоваться совместно либо по отдельности. В случае использования только положительного или только отрицательного стимула время обучения увеличивается в 2–3 раза.

При манипуляции с животными во время обучения и тестирования необходимо соблюдать аккуратность и осторожность. При помещении животного в установку запрещается касаться сачком воды в установке. Перед тестированием необходимо максимально быстро поймать рыбу в сачок, не гоняя ее по домашнему аквариуму или по аквариуму для экспозиции, поскольку это приведет к увеличению тревожности зебраданио и исказит результаты обучения и тестирования. Запрещается допускать падение рыбы с высоты в воду. По окончании эксперимента животных необходимо аккуратно поймать сачком и переместить в домашний аквариум или в аквариум для дальнейших манипуляций. Необходимо избегать резких звуков и движений во время габитуации и обучения, поскольку это может привести к искажению результатов. В случае падения рыбы на пол, ее необходимо аккуратно переместить в домашний аквариум и протестировать позже. Негативный стимул необходимо подавать только после явного пересечения границы неправильного рукава.

Общая схема тестирования

Этап 1 — габитуация к условиям лабиринта. На данном этапе животным в течение 3–5 дней позволяют свободно исследовать установку в группе. С каждым последующим днем габитуации количество животных в группе уменьшается в 2 раза. В конце первого этапа зебраданио индивидуально экспозируется в установке. Время экспозиции варьируется от нескольких часов (2–4 ч) в первые дни до 5–15 мин в последующие сессии. Успешным окончанием этапа габитуации считается свободное перемещение зебраданио по всему лабиринту и сведение к минимуму поведения фризинга.

Этап 2 — обучение. На этапе обучения животные индивидуально экспозируются в тестовой установке, с заданными целевыми рукавами. Целевой рукав может маркироваться цветом (например, красной, зеленой или желтой карточкой), рисунком (полосы, круги). В качестве положительного подкрепления в целевом рукаве может находится пища, либо группа сородичей. Негативным стимулом в неправильном (нецелевом рукаве) может быть удар током, либо экспозиция хищника. Во время обучающей сессии в течение 5 мин исследователь наблюдает за поведением зебраданио и подает либо положительный, либо отрицательный стимул при заходе в правильный (целевой) / неправильный рукав. Зебраданио может подвергаться не более чем трем обучающим сессиям в течение дня. После окончания обучения животных помещают в домашний аквариум. Успешным считается обучение, при котором рыба ни разу не заплывает в неправильный рукав в течение 5-минутной тренировочной сессии.

Этап 3 — тестирование. На последнем этапе оценивается количество и продолжительность заходов в правильный и неправильный рукава, а также латентный период первого захода в неправильный рукав, число и продолжительность актов фризинга. Поведение зебраданио фиксируется на видеокамеру в течение 5 мин. Съемка экспериментальной установки ведется сверху. Во время тестирования необходимо соблюдать тишину в экспериментальной комнате, находиться в помещении во время съемки не рекомендуется. Температура и химические показатели воды в установке должны быть аналогичными параметрам в домашнем аквариуме (25–26 °C). Освещение в комнате тестирования должно быть около 60–80 лк. После тестирования животных переносят в другой аквариум для дальнейших манипуляций либо в домашний аквариум. Рекомендуемый размер выборки — не менее 15 особей в каждой когорте.

Y-ОБРАЗНЫЙ ЛАБИРИНТ

Y-образный лабиринт (Y-maze) — еще один широко применяемый метод оценки пространственной памяти и обучения как у грызунов, так и у зебраданио. Ранее было разработано множество тестов для оценки способности зебраданио к адаптивному обучению, таких как тест «активное избегание», Т-образный, крестообразный лабиринты и др. К основным недостаткам данных методов можно отнести временные затраты на обучение животных в этих тестах, а также подстраивание протоколов для каждого отдельного функционального анализа адаптивного поведения под определенные задачи, что является трудоемким процессом. В связи с этим возникла необходимость разработки быстрого и точного теста для оценки адаптивного поведения, то есть Y-образного лабиринта.

В основе данного теста лежит принцип спонтанного выбора (spontaneous alternation). Поведение спонтанного выбора описывает тенденцию животных менять направление своего поворота в серии последовательных поворотов [5]. Каждый выбор статистически зависит от предыдущего, что свидетельствует о его мнестическом происхождении. В отличие от других типов мнестических задач, тестирование в Y-образном лабиринте не требует предварительного обучения или подкрепления, поскольку оценивается свободный выбор животного.

Происхождение поведения спонтанного выбора остается в значительной степени неизвестным. Было предложено множество теорий, пытающихся объяснить это чередование. Среди них отмечается любопытство или добыча пищи как фактор потребности в исследовании пространства, чтобы найти пищу или убежище [6]. В случае отсутствия подкрепления само по себе реактивное торможение ведет к отвращению ранее сделанного выбора [7]. Наконец, был предложен декремент действия, предполагающий, что насыщение стимулов и реактивное торможение благотворно влияют на память, поскольку задерживают закрепление привычки к обучению [8].

Классическая тестовая установка состоит из трех одинаковых рукавов, расположенных под углом 120° относительно друг друга (высота 10 см, длина 15 см, ширина 7 см; длина 5 см, ширина 2 см), полностью заполненных водой [9]. Размеры установки так же могут меняться. Температура и химический состав воды в лабиринте должны быть аналогичными аквариуму домашнего содержания. Процедура тестирования включает в себя три этапа:

Этап 1. Габитуация. Для снижения эффекта новизны каждую рыбу помещают в лабиринт, закрытый прозрачной крышкой для предотвращения выпрыгивания из установки, на 10 мин.

Этап 2. Тестирование. На данном этапе отмечается стартовый рукав, в котором находится рыба на начало эксперимента. Важно: для каждого животного стартовый рукав выбирается произвольно. Далее подсчитывается количество и последовательность поворотов в течение не менее 1 ч или до 100 входов в рукав. Если рыба выполнила 100 полных входов в рукава до окончания назначенного времени, тест заканчивают раньше. По окончании тестирования рыбу аккуратно вылавливают сачком и помещают в другой аквариум для дальнейших манипуляций либо в домашний аквариум.

Этап 3. Анализ данных. Анализ данных и построение тетраграмм производится по принципу анализа левых (Л) и правых (П) поворотов при выходе из рукава. Тетраграммы (ПППП или ЛЛЛЛ) представляют собой чистые повторения поворотов в одну сторону, а тетраграммы (ПЛПЛ и ЛПЛП) — чистые чередования. Стратегия полностью случайного поиска состояла бы в том, чтобы выбрать каждую потенциальную тетраграмму одинаково. Однако последовательности ответов могут включать в себя повторения чередований. Для проверки нулевой гипотезы о равной вероятности попадания в любую из целевых рук используется биномиальный тест и обобщенные линейные модели для чередующихся и повторяющихся частотных данных.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Вклад каждого автора: Д.С. Галстян, Т.О. Колесникова, Ю.М. Косицын, К.Н. Забегалов, М.А. Губайдуллина, Г.О. Маслов — анализ данных и написание статьи; К.А. Демин, А.В. Калуев — разработка общей концепции и рецензирование статьи.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Работа выполнена при поддержке Санкт-Петербургского государственного университета (госзадание, проект № 73026081).

ADDITIONAL INFORMATION

Author contribution. Thereby, all authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work. Contribution of each author: D.S. Galstyan, T.O. Kolesnikova, Yu.M. Kositsyn, K.N. Zabegalov, M.A. Gubaidullina, G.O. Maslov — manuscript drafting, pilot data analyses and writing; K.A. Demin, A.V. Kalueff — general concept discussion and paper reconceptualization.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Funding source. The work was carried out with the support of St. Petersburg State University (State assignment, project No. 73026081).

About the authors

David S. Galstyan

Saint Petersburg State University; A.M. Granov Russian Research Center for Radiology and Surgical Technologies; Almazov National Medical Research Centre

Email: david_sam@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6213-5117

Research Associate

Russian Federation, Saint Petersburg; Saint Petersburg; Saint Petersburg

Tatyana O. Kolesnikova

Sirius University of Science and Technology

Email: philimontani@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5561-8583
SPIN-code: 8558-7887

Research Associate

Russian Federation, Sochi

Yurii M. Kositsyn

Saint Petersburg State University

Email: ikosicin53@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4266-808X

Research Associate

Russian Federation, Saint Petersburg

Konstantin N. Zabegalov

Sirius University of Science and Technology

Email: hatokiri@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9748-0324
SPIN-code: 5993-6315

Research Associate

Russian Federation, Sochi

Mariya A. Gubaidullina

Sirius University of Science and Technology

Email: mariangub@gmail.com

Research Associate

Russian Federation, Sochi

Gleb O. Maslov

Sirius University of Science and Technology; Ural Federal University

Email: maslovog6@gmail.com

Research Associate

Russian Federation, Sochi; Yekaterinburg

Konstantin A. Demin

Saint Petersburg State University; Sirius University of Science and Technology; Almazov National Medical Research Centre

Email: deminkasci@gmail.com
SPIN-code: 3830-1853

Cand. Sci. (Biol.), Senior Research Associate

Russian Federation, Saint Petersburg; Sochi; Saint Petersburg

Allan V. Kalueff

Saint Petersburg State University; A.M. Granov Russian Research Center for Radiology and Surgical Technologies; Sirius University of Science and Technology; Almazov National Medical Research Centre; Ural Federal University; Novosibirsk State University; Research Institute of Neuroscience and Medicine; Moscow Institute of Physics and Technology

Author for correspondence.
Email: avkalueff@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-7525-1950
SPIN-code: 4134-0515

Dr. Sci. (Biol.), Professor

Russian Federation, Saint Petersburg; Saint Petersburg; Sochi; Saint Petersburg; Yekaterinburg; Novosibirsk; Novosibirsk; Moscow

References