The changes of protein kinases activities in the brain structures after ghrelin antagonists administration in previously stressed  Danio rerio

Alexandra A. Blazhenko; Блаженко Александра Александровна; Boris A. Reikhardt; Рейхардт Борис Андреевич; Platon P. Khokhlov; Хохлов Платон Платонович; Eugenii R. Bychkov; Бычков Евгений Рудольфович; Andrei A. Lebedev; Лебедев Андрей Андреевич; Petr D. Shabanov; Шабанов Петр Дмитриевич

doi:10.17816/RCF202211-217

The changes of protein kinases activities in the brain structures after ghrelin antagonists administration in previously stressed Danio rerio

Authors: Blazhenko A.A.¹, Reikhardt B.A.¹, Khokhlov P.P.¹, Bychkov E.R.¹, Lebedev A.A.¹, Shabanov P.D.¹
Affiliations:
1. Institute of Experimental Medicine
Issue: Vol 20, No 2 (2022)
Pages: 211-217
Section: Original articles
URL: https://journals.eco-vector.com/RCF/article/view/110402
DOI: https://doi.org/10.17816/RCF202211-217
ID: 110402

Cite item

Full Text

Open Access
Restricted Access

Access granted
Restricted Access

Subscription or Fee Access

Abstract
Full Text
About the authors
References
Statistics

Abstract

BACKGROUND: Nowadays there are a lot of data to suggest about an important role of ghrelin signaling system in stress response and reinforcement mechanisms. There is a common opinion that a protein kinase system plays a role of a second intracellular messenger for ghrelin system.

AIM: So, the aim of our study was to measure the total protein kinase activity in brain structures of Danio rerio. The all procedures have been approved according to the Local Ethical Committee of Institute of Experimental Medicine.

MATERIALS AND METHODS: In our study it has been used 50 specimen Danio rerio 6–8 months of age. There also has been used a predator (Hypsophrys nicaraguensis). During experiment a fish has been firstly placed into a tank of water with a dissolved pharmacological substance for 5 min, then has been transferred into a tank with predator also for 5 min. Two ghrelin antagonists have been used in our experiment in 0.333 mg/l dosage [D-Lys3]-GHRP-6 and Agrelax, a recombinant peptide analogue of ghrelin with molecular weight 3.5 kD, which has been invented in our Institute. The brain has been divided into three anatomical parts: telencephalon, midbrain and cerebellum. After that the material for kinase activity assay was made (ADP sensor Universal Kinase Activity Assay kit, BioVision).We also have used GraphPad Prism 6 for statistical estimation. Kolmogorov–Smirnov test Mann–Whitney U-test have been used as statistical tests.

RESULTS: In control group, the kinase activity has been determined in all tested brain structures. After predator exposure, the kinase activity has significantly changed. After [D-Lys3]-GHRP-6 administration there has not been determined any protein kinase activity in all brain structures. In the cerebellum the kinase activity has been the highest after Agrelax administration. Protein kinase system demonstrates significant stress response.

CONCLUSIONS. Pharmacological action on ghrelin receptors leads to changes in kinase system in Danio rerio’s brain structures.

Keywords

ghrelin, protein kinase, stress, Danio rerio, zebrafish

Full Text

АКТУАЛЬНОСТЬ

Состояния тревожности и депрессии тесно взаимосвязаны с нарушениями в регуляции гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси. Многие из последних работ, посвященных изучению стресса, показывают, что нейропетид грелин может являться одним из ключевых элементов в регуляции гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы, отвечающей за каскад реакций, поддерживающих гормональный гомеостаз при ответе на стрессовое воздействие. Любые отклонения в работе грелиновой системы могут по цепной реакции нарушить работу «оси», что приведет к стресс-ассоциированным нарушениям поведения [1]. В экспериментах на крысах авторы использовали антисенс-олигонуклеотид грелина, чтобы доказать, что при внутрижелудочковом введении они вызывают анксиолитический эффект у крыс, которых предварительно подвергали стрессу, предполагая, что уровень грелина до воздействия был понижен [2]. Когда нейропептид грелин был введен крысам непосредственно в желудочки мозга, спустя 10 мин поведение животных в «приподнятом лабиринте» стало беспокойным [3]. Грелин, введенный в гиппокамп или амигдалу, вызывал тревожно-подобное поведение крыс при тестировании их в приподнятом крестообразном лабиринте и тесте открытого поля через 5 мин после введения [4].

Ранее мы установили, что содержание нейропептида грелина увеличивается в головном мозге (переднем и среднем отделах) Danio rerio после экспозиции с хищником. Danio rerio в настоящее время — одна из многообещающих моделей для изучения стресс-ассоциированных расстройств, так как имеет гомологичные ключевые генетические, физиологические и поведенческие характеристики регуляции стрессовых реакций, включая устройство гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой (межпочечной для Danio rerio) системы. Межпочечные клетки у Danio rerio представляют собой эквивалент коры надпочечника человека. Эти клетки выстилают крупные сосуды (задние кардинальные вены) впереди головной части почки. Клетки в свою очередь синтезируют кортикостероиды, главным образом кортизол. Danio rerio демонстрирует полноценный стрессовый ответ, включая биологическую обратную связь с гипоталамо-гипофизарной системой после выделения достаточного количества глюкокортикоидов [5].

Генетическая и пептидная структура грелина была определена у телеостовых рыб, в том числе и у Danio rerio [6]. Н-терминальные ядра с ацилмодифицированными сайтами строго консервативные у всех позвоночных. У Danio rerio так же, как и у позвоночных, мРНК грелина экспрессируется в основном в желудке, поджелудочной железе, структурах головного мозга. Грелин у модельного организма zebrafish служит регулятором выработки гормонов гипофизом, насыщения пищей, работы кишечника, что соответствует аналогичным функциям у человека [7].

Вторичный мессенджер нейропетида грелина — киназная система, активность которой должна изменяться при разной концентрации нейропептида. АМФ-активируемая протеинкиназа, состоящая из трех субъединиц (a, b, c), ключевая во внутриклеточной сигнальной системе. Чтобы активировать эту систему, грелин связывается со своим рецептором (GHSR) и инициирует приток Ca²⁺. Рецептор грелина (GHSR) как G-связанный рецептор, взаимодействует с Gq-компонентом, активируя при этом фосфолипазу С и инозитол-1,4,5-трифосфат. В эксперименте на крысах при внутрибрюшинном и внутрижелудочковом введении грелина АМФ-активируемая киназная активность в гипоталамусе повышалась [8]. AMФ-активируемая протеинкиназа является филогенетически консервативной у Danio rerio и способствует клеточной адаптации при стрессовых воздействиях [9].

Цель нашего исследования — определение общей активности киназ в различных отделах головного мозга Danio rerio после стрессорного воздействия в тесте с хищником.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В нашем эксперименте было использовано 176 рыб Danio rerio возрастом 6–8 мес. фирмы «Аква Петер» и выращенных в ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» (ИЭМ) — Danio rerio, дикий тип (wild type), а также хищник (Hypsophrys nicaraguensis) фирмы «Аква Петер». Для тестирования использовали интактных животных после двухнедельного периода адаптации к помещению и аквариумам водоизмещением 40 л по 20–30 рыб в каждом. Температуру воды 23–25 °C поддерживали постоянно. Животных содержали в стандартных условиях светового режима (8:00–20:00) при температуре помещения 22 ± 2 °C, кормили дважды в день стандартным кормом «Tetramin tropical flakes». Все манипуляции с животными одобрены локальным этическим комитетом ФГБНУ «ИЭМ» (протокол № 12 от 26.09.2019).

Для оценки теста стресса с хищником применяли стандартный просмотровый аквариум, используемый для изучения тревожно-фобических реакций у zebrafish, водоизмещением 1,5 л, трапециевидной формы, высотой 15 см и шириной 7 см. Длина аквариума в основании составляла 22 см, в верхней части — 28 см. Животное помещали сначала в мерный стакан водоизмещением 200 мл с растворенным фармакологическим веществом (или водой) на 5 мин, затем перемещали в резервуар с хищником на 5 мин. В качестве тестируемых веществ использовали два антагониста грелина. Первое соединение представляет собой рекомбинантный пептидный аналог грелина (агрелакс) с молекулярной массой 3,5 кДа, который был разработан в ФГБНУ «ИЭМ». Вторым соединением был антагонист грелина — [D-Lys3]-GHRP-6, — хорошо известный и описанный в литературе. Оба препарата тестировали в равных дозировках 0,333 мг/л инкубационным методом.

Мозг Danio rerio был разделен на три анатомические части: передний мозг, средний мозг и задний мозг (мозжечок), как показано на рис. 1 [10, 11].

Рис 1. Схема разделения мозга Danio rerio для получения материала для исследований. МП — мозжечковая пластинка (cerebellar plate); ДКМ — дорсальный конечный мозг (dorsal telencephalon/pallium); Э — эпифиз (epiphysis); ТВ — таламическое возвышение (eminentia thalami); Гип — гипоталамус (hypothalamus); ПМ — продолговатый мозг (medulla oblongata); ОЛ — обонятельная луковица (olfactory bulb); ПД — переднее двухолмие (optic tectum); ПО — преоптическая область (preoptic area); ПЧК — передняя часть крыши (pretectum); ДЧЗБ — дорсальная часть заднего бугорка (posterior tuberculum dorsal part); ПТал — предталамус (prethalamus); ВЧЗБ — вентральная часть заднего бугорка (posterior tuberculum ventral part); Пок — покрышка (tegmentum); Тал — таламус (thalamus); ВКМ — вентральный конечный мозг (ventral telencephalon/subpallium); МК — мозжечковый клапан (valvula cerebelli)

После этого готовили материал для анализа общей активности киназ (при тестировании использовали универсальный набор для анализа активности киназ ADP, BioVision). Статистические данные были получены посредством программы GraphPadPrism 6. Поскольку преобладающее большинство рассматриваемых и сравниваемых параметров в группах или в группе не соответствовали нормальному распределению, статистическую обработку результатов проводили с использованием методов непараметрической статистики. Для оценки межгрупповых различий значений признаков применяли ранговый U-критерий Манна – Уитни, при сравнении частотных величин — χ-квадрат Пирсона и/или для проверки первого метода — точный метод Фишера. Данные представлены в виде среднего арифметического ± среднеквадратичное отклонение.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В контрольной группе активность протеинкиназ определяли во всех исследованных структурах мозга. Наиболее высокую активность регистрировали в среднем мозге, что может быть обосновано анатомически, поскольку это самый крупный отдел из выделенных трех. Наименьшая киназная активность по сравнению с двумя другими отделами была в переднем мозге. Значения активности киназ: передний мозг — 0,03795 ± 0,03785 AU, средний мозг — 0,2160 ± 0,1567 AU, задний мозг (мозжечок) — 0,1129 ± 0,07462 AU (рис. 2).

Рис 2. Общая протеинкиназная активность в разных структурах головного мозга Danio rerio до и после экспозиции с хищником и введении антагониста грелина: a — контроль (интактные); b — экспозиция с хищником; c — введение антагониста грелина (агрелакс)

В эксперименте с хищником активность киназ значительно менялась. Наиболее высокий был зарегистрирован в переднем мозге по сравнению с контрольной группой. Показатель среднего мозга, наоборот, снизился по сравнению с контрольной группой. Активность киназ в мозжечке упала до минималного значения после экспозиции с хищником: передний мозг — 0,2440 ± 0,2439 AU, средний мозг — 0,06465 ± 0,04732 AU, задний мозг (мозжечок) — 0,008641 ± 0,008541 AU, p < 0,05.

После введения низкомолекулярного антагониста грелина [D-Lys3]-GHRP-6 не было выявлено какой-либо активности протеинкиназ ни в одной из исследованных структур мозга.

Напротив, после введения высокомолекулярного антагониста грелина агрелакса активность протеинкиназ определялась, но была ниже в сравнении с контрольным образцом (рис. 2, b). Тот же показатель был получен и для среднего мозга, однако в этом случае он был значительно ниже контрольного (средний мозг — 0,006427 ± 0,006002 AU).

В наших предыдущих исследованиях было продемонстрировано количественное изменение грелина в головном мозге Danio rerio после стрессорного воздействия хищником [11]. Поскольку протеинкиназы по сути являются вторичным мессенджером внутри клетки, они активно реагируют на связывание нейропептида с рецептором грелина (GHSR). Как ключевой фермент в этой внутриклеточной сигнальной системе рассматривают АМФ-активируемую протеинкиназу, состоящую из трех субъединиц (a, b, c). Связываясь со своим рецептором, грелин запускает приток ионов Ca²⁺ в клетку [12]. Однако реакция протеинкиназной системы клетки — это не единственный биохимический ответ на активацию связанных с G-белком рецепторов грелина. Взаимодействуя с Gq-компонентом рецепторного комплекса, расположенного на внутренней поверхности клеточной мембраны, грелин также активирует фосфолипазу С и инозитол-1,4,5-трифосфатный цикл. Это доказывается экспериментами, выполненными на крысах, которым системно (внутрибрюшинно) и в желудочки мозга вводили грелин, АМФ-активируемая киназная активность при этом повышалась и в ряде мозговых структур, в частности, в гипоталамусе [9]. Авторы сделали вывод о филогенетической консервативности AMФ-активируемой протеинкиназы, что в полной мере относится и к Danio rerio. Функциональное значение этой консервативности, по мнению авторов, состоит в обеспечении клеточной адаптации при стрессорных воздействиях на организм.

Сама система грелина активно реагирует на стрессогенные воздействия. Так, в переднем мозге интактных рыб Danio rerio количественные показатели грелина чрезвычайно низки: его содержание было меньше, чем возможности определения тестирующей системы, то есть менее 4 пг/мг белка. Однако при стрессорном воздействии (экспозиция с хищником) количество грелина возрастало в 200–250 раз, аналогично основному глюкокортикоидному гормону кортизолу [11]. Следовательно, структуры переднего мозга наиболее активно участвуют в реакции мозга на стрессорное воздействие. В то же время в среднем и заднем мозге исходно (в контроле) регистрировали достаточно высокое содержание грелина, которое подавлялось при экспозиции рыб с хищником. Интересно отметить, что антагонист грелина агрелакс значимо подавлял реакцию на стрессогенное воздействие, резко снижая уровень грелина в переднем и среднем мозге, даже существенно ниже, чем исходно в контрольной группе (у интактных рыб). Интересно отметить, что подавленная стрессом экспрессия грелина в заднем мозге при экспозиции с хищником при этом растормаживалась.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, исследования показали, что протеинкиназная система головного мозга Danio rerio активно реагирует на стрессорное воздействие, то есть оказывается одним из значимых показателей стрессогенной реакции. Фармакологическое воздействие антагонистами грелина изменяет активность внутриклеточной киназной системы в структурах мозга Danio rerio. Если ее основным ответом на стрессогенное воздействие станет повышение общей активности киназ преимущественно в переднем мозге, то антагонисты грелина полностью блокируют этот ответ. Это позволяет предположить наличие прямой взаимосвязи между повышением активности внутриклеточных киназ и количественного повышения концентрации грелина в головном мозге на примере модельного организма Danio rerio, подвергнутого стрессорному воздействию.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Вклад каждого автора: А.А. Блаженко, П.П. Хохлов, Е.Р. Бычков, А.А. Лебедев — сбор и анализ данных, подготовка и написание статьи; Б.А. Рейхардт, П.Д. Шабанов — разработка общей концепции и рецензирование статьи.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

ADDITIONAL INFORMATION

Author contribution. Thereby, all authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work. Contribution of each author: A.A. Blazhenko, P.P. Khokhlov, E.R. Bychkov, A.A. Lebedev — collection and pilot data analyses, manuscript drafting and writing; B.A. Reichardt, P.D. Shabanov — general concept discussion and paper reconceptualization.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

About the authors