Toxicology of carbon nanostructures. Part 2. Nanoscale materials based on graphene sheets

Full Text

В предыдущем обзоре были рассмотрены вопросы токсичности сферических наноструктур углерода размерностью 0 D — фуллеренов и наноонионов [1]. Их главное отличие от других наноструктур углерода заключается в том, что они представляют собой классические молекулы, состоящие только из атомов углерода. Остальные наноструктуры, а именно углеродные нанотрубки, углеродные нанохорны (размерностью 1D), графен и его производные (размерностью 2D), о которых пойдет речь в этом обзоре, содержат атомы углерода в sp²-гибридизации и их можно рассматривать как образованные графеновыми листами, то есть как производные графена. Исключения составляют наноалмазы (размерность 3D), образованные атомами в sp³-гибридизации. Все эти наноструктуры представляют собой материалы, состоящие из смеси однотипных молекул, отличающихся друг от друга набором и/или числом составляющих атомов, иначе говоря, являются физической смесью различных химических соединений [2]. Они могут содержать на краях структур другие атомы — кислорода, водорода, различных металлов, а также целые функциональные группы [3]. Крайние атомы наноалмазов могут быть атомами углерода в sp²-гибридизации, что в данном случае представляет собой загрязнение. Естественно, что эти примеси будут вносить свой вклад в биологические свойства, и, следовательно, токсичность образцов будет зависеть от метода их получения и степени очистки.

Нанотрубки

Углеродные нанотрубки (УНТ) представляют собой цилиндрические структуры, получаемые при свертывании плоской гексагональной сетки графена (рис. 1) [4].

 

Рис. 1. Однослойная углеродная нанотрубка [4]

 

Считается, что нанотрубки впервые наблюдались С. Иидзимой в 1991 г. [5, 6]. Но еще в 1974–1975 гг. M. Эндо с коллегами опубликовали ряд работ с описанием тонких трубок диаметром менее 100 Å, полученных конденсацией паров. Однако детального исследования структуры проведено не было [7]. Нанотрубки, образованные одним слоем графена, называются однослойными углеродными нанотрубками (ОСУНТ, рис. 1), их диаметр около 1 нм [6, 8]. Если слоев несколько, то это многослойные углеродные нанотрубки (МСУНТ). Расстояние между слоями в МСУНТ составляет около 0,34 нм [5]. Концы нанотрубок могут быть открыты или закрыты полусферами, составленными из пяти- и шестиугольников и напоминающими по строению полусферы молекулу фуллерена. В принципе есть некоторое сходство между нанотрубками и фуллеренами. Так, молекула фуллерена С₇₀ отличается от молекулы фуллерена С₆₀ «наличием» на экваторе молекулы пояса из 5 гексагонов. Длина нанотрубок может достигать нескольких микрометров [9].

Различия между ОСУНТ и МСУНТ заключаются в том, что последние представляют собой многослойную структуру, при их синтезе не нужны катализаторы, они могут быть получены в достаточно чистом виде. Их структуры содержат мало дефектов, и они аккумулируются в организме. В отличие от МСУНТ у ОСУНТ однослойная структура. При их синтезе нужны металлические катализаторы, очистка от которых представляет определенные трудности, эти структуры содержат много дефектов, особенно после функционализации, и они аккумулируются в организме значительно меньше, нежели их многослойные аналоги [10, 11]. Таким образом, МСУНТ доступны в больших количествах и относительно дешевы, ОСУНТ дороги и их трудно получать в больших количествах. К этому еще можно добавить, что ОСУНТ обладают теплопроводностью в интервале 6000 Вт/(м · K) и проявляют свойства полупроводников и металлов (автоэлектронная эмиссия), а у МСУНТ этот параметр лежит в области 3000 Вт/(м · K), и свойствами полупроводников они не обладают [10]. Уже такое сравнение свойств УНТ позволяет утверждать, что ОСУНТ и МСУНТ представляют собой различные материалы, и, следовательно, биологические данные, полученные для одного типа материала, нужно с осторожностью переносить на другой.

При изучении нанотрубок большое внимание уделяется пульмонарной токсичности. УНТ содержатся в выхлопных газах автомобилей, и, следовательно, человечество постоянно подвергается их воздействию [12]. Еще одна причина — нанотрубки представляют собой волокнистые материалы, а канцерогенность подобных материалов, например, асбеста, хорошо известна [13] ^*.

Возможность возникновения патологических состояний из-за повреждений тканей при контакте с различными веществами достаточно очевидна. Особенно неприятно в этом случае ингаляционное воздействие, так как повреждающее действие наночастиц на дыхательный аппарат может быть чисто механическим [15, 16]. Попадая в организм в виде аэрозолей, частицы распределяются в дыхательном тракте в зависимости от формы, размера и плотности. В частности, частицы размером меньше 300 нм накапливаются в альвеолярной части легких. Следовательно, при ингаляционном воздействии именно эти параметры (форма, размер и плотность), а не состав частиц, становятся определяющими в проявлении токсического действия [17]. В частности, в случае МСУНТ показано, что ингаляционная токсичность определяется размерами, отношение длины к толщине (aspect ratio), жесткостью, модификациями поверхности и способностью продуцировать активные формы кислорода [18].

Среди относительно недавних обзоров по токсичности УНТ можно упомянуть [19–22].

Действие УНТ in vivo на легкие исследовалось неоднократно [23–27]. Хотя в одной из этих работ не было обнаружено никаких токсических проявлений при введении в трахею морских свинок нанотрубок (25 мг) [25], в появившихся позднее более детальных исследованиях были уже предъявлены доказательства токсического действия нанотрубок на легкие. Однако использованные почти во всех этих работах экспериментальные процедуры не совсем адекватны реальным условиям, которые могут возникать, например, при производстве нанотрубок. В частности, маловероятно появление нанотрубок в воздухе в достаточных концентрациях [28]. Недостаточно охарактеризованы с точки зрения физико-химических параметров и использованные в этих работах образцы нанотрубок [29]. Тем не менее возможность кумулятивных эффектов не должна исключаться. Более подробно данные по действию нанотрубок на дыхательную систему рассмотрены в работе [30]. Как отмечается в этой работе, результаты по изучению токсичности УНТ зачастую не полны и противоречивы. В случае неочищенных нанотрубок токсические эффекты часто вызваны примесями металлов, используемых в качестве катализаторов при их производстве.

Напомним еще раз, что вопросы «ингаляционной токсичности» стоят остро в отношении к любым наноматериалам, а не только наноструктурам углерода [17, 24], так как она определяется, в первую очередь, размерами частиц и лишь затем химическими и биологическими свойствами материала. Об этом, в частности, свидетельствуют и данные работы [31], в которой показано, что токсическое действие МСУНТ (диаметр ~20 нм, отношение размеров 80–90), углеродных нанонитей (диаметр ~150 нм, отношение размеров 30–40) и наночастиц углерода (carbon black, отношение размеров 1) in vitro на культуре клеток зависит от размера наночастиц.

На альвеолярных макрофагах было показано in vitro, что ОСУНТ проявляют выраженную цитотоксичность. В ряду исследованных соединений цитотоксичность падала с уменьшением массы частицы: ОСУНТ > МСУНТ > > кварц > C₆₀. При этом МСУНТ и C₆₀ проявляли цитотоксичность только в высоких дозах (3,1 мкг/см²), тогда как в случае ОСУНТ эффект наблюдался уже при 0,38 мкг/см² [32]. При экспозиции эпидермальных кераноцитов человека с МСУНТ (0,1, 0,2 и 0,4 мг/мл) последние, по данным просвечивающей электронной микроскопии, накапливались в цитоплазматических вакуолях и вызывали выброс из кераноцитов противовоспалительного цитокина (интерлейкина 8) [33]. ОСУНТ дозозависимо ингибировали рост клетки почек эмбрионов человека (HEK293), причем выраженность эффекта зависела и от времени инкубирования [34].

Восемнадцатичасовая экспозиция эпидермальных кераноцитов человека с ОСУНТ приводит к окислительному стрессу, выражающемуся в появлении свободных радикалов, накоплении продуктов перекисного окисления и потери жизнеспособности клеток. При контакте ОСУНТ с клетками кожи в культуре также наблюдаются ультраструктурные и морфологические изменения. Эти данные свидетельствуют о возможности кожных поражений при работе с нанотрубками [35].

Потенциальные токсические эффекты нанотрубок, используемых в качестве противоопухолевых препаратов, описаны в работе [36].

В первой части обзора уже отмечалось, что было проведено сравнение действия многослойных углеродных наноонионов (MWCNO, многослойных гигантских фуллеренов диаметром ~30 нм) и МСУНТ (диаметром ~30 нм) на фибробласты кожи человека [37]. По данным этой работы получается, что МСУНТ более опасны, нежели MWCNO такого же размера.

По данным некоторых работ, сами УНТ в действительности не токсичны, а наблюдаемые токсические проявления вызваны примесями. Заметные количества ОСУНТ могут также поглощаться клетками макрофагов без проявления каких-либо токсических эффектов [38]. Высокоочищенные ОСУНТ, по данным работы [39], при относительно короткой экспозиции не проявляют токсического действия на культуру кардиомиоцитов, что также свидетельствуют об их биосовместимости, а появление через 3 сут «токсических» эффектов, по мнению авторов, связано скорее с физическим, а не химическим взаимодействием нанотрубок с клеточными стенками.

Функционализированные нанотрубки, проникая через клеточные мембраны и накапливаясь в цитозоле или даже в ядре, не проявляют цитотоксичности в концентрациях до 10 мкМ [40]. На развитие фибробластов и остеобластов не влияет наличие в среде МСУНТ [41]. Предварительное нагревание, приводящее к снижению числа дефектов на поверхности МСУНТ, как ни странно, усиливает их цитотоксичность [42].

Подводя итог, следует отметить, что исследования по токсичности УНТ указывают, в принципе, на относительно невысокую токсичность высокоочищенных образцов. Что касается зависимости структура – активность, то работ, в которых систематически изучалось бы влияние на токсичность размеров и иных физических параметров углеродных нанотрубок, практически нет. Правда, следует отметить, что это касается не только УНТ, но, в частности, и наноалмазов.

Нанохорны

Замена в графеновом слое гексагона на пентагон приводит к искривлению его поверхности. При замене одного гексагона на один пентагон образуется коническая структура, называемой наноконом (угол 120°). Дальнейшая замена гексагонов, конденсированных с этим пентагоном, на пентагоны приводит к дальнешему искривлению поверхности. При максимально возможном числе конденсированных пентагонов, равном пяти, образуется структура с углом около 20°. Такая структура, «острие» которой образовано пятью пентагонами, называется нанохорном (УНХ, углеродные нанохорны, CNH, рис. 2) [43]. Подробнее о строении нанохорнов см. [44].

 

Рис. 2. Однослойный углеродный нанохорн

 

Синтез нанохорнов не требует применения металлов-катализаторов, что сразу же снимает вопрос о токсичности, вызванной примесями [45]. И действительно, токсикологические тесты с использованием нанохорнов в некоторых исследованиях не показали каких-либо выраженных эффектов: нанохорны в тестах in vitro и in vivo не обладают раздражающим действием и не вызывают сенсибилизацию кожи.

Внутривенное введение УНХ в течение 26 нед. не привело ни к каким выраженным токсическим эффектам. Это подтверждалось нормальным внешним видом животных, нормальным увеличением веса и отсутствием аномалий в тканях при гистологических наблюдениях [46].

Сравнение токсичности различных окисленных наноструктур, а именно окисленных углеродных наноонионов (oxi-CNOs), окисленных углеродных нанохорнов (oxi-CNHs) и оксида графена (GO) было проведено на рыбках Danio rerio [47]. Наиболее токсичным оказался GO, а oxi-CNHs несколько более токсичен, нежели oxi-CNOs. Это, вероятно, связано с тем, что небольшая токсичность в клетках при использовании CNH вызвана его способностью вырабатывать активные формы кислорода (АФК) [48].

В работе [49] исследовалась экологическая роль порошка УНХ на двух видах: полихетах Hediste diversicolor и мидиях Mytilus galloprovincialis. Результаты показали, что УНХ влияет на окислительную и лизосомальную системы гепатопанкреаса и приводит к лизосомным изменениям гемоцитов в мышцах. Это значит, что в будущем будет, вероятно, необходимо изучение длительного воздействием УНХ на морские виды.

В двух работах изучалась зависимость биологических свойств УНХ от размеров частиц (больших и малых): биораспределение и накопление на мышах [50] и цитотоксичности [51]. В первой работе с использованием агрегатов УНХ 100 нм (большие) и 30–50 нм (малые) было показано, что небольшие УНХ медленнее накапливаются в печени и селезенке, не накапливаются в коже, легких и почках, и при этом отсутствует очевидная гематологическая или иммунологическая токсичность. Во второй работе определяли цитотоксичность частиц УНХ на эпителиальных клетках дыхательной системы человека (использовали две фракции размера первичных частиц: 60–80 и 60–200 нм). Следует отметить, что, как правило, образцы УНХ отличаются от образцов наноалмазов, УНТ и графена более узким интервалом размеров агрегатов [52].

Не токсичны также и комплексы УНХ. На модели фибробластов эмбрионов мышей in vitro было показано отсутствие цитотоксичности системы УНХ – липосома [53]. Нетоксичным оказался также и комплекс УНХ с бычьим сывороточным альбумином, который способен эффективно превращать световую энергию в термическую [54].

По данным H. Isobe и соавт. [55], функционализированные производные (f CNH) также не проявляют токсических эффектов. Они быстро интернализуются клетками фибробластов и при этом, в отличие от таких неорганических наночастиц, как кварц и TiO₂, не влияют на жизнеспособность клеток. Водная гомогенная дисперсия функционализированных нанохорнов, полученная без использования сурфактантов, не вызывает гибель первичных фагоцитирующих клеток, что указывает на то, что даже после проникновения в клетки они не оказывают летального действия (как минимум в течение трех суток) [56].

Известные данные позволяют также высказать предположение об отсутствии у нанохорнов канцерогенных свойств. При пероральном введении (вплоть до дозы 2000 мг/кг) острой токсичности так же установить не удалось. Отсутствие острых эффектов было показано при ингаляционном введении [57]. Несмотря на то что УНХ проникают внутрь клеток [58], канцерогенной активности при этом не наблюдалось [57].

Однако в литературе можно найти данные, свидетельствующие о токсичности УНХ как in vitro на разных клеточных линиях [58, 59], так и in vivo при респираторной, оральной и кожной или глазной сенсибилизации [57, 60]. Предполагается, что токсичность УНХ связана с дестабилизацией мембран и генерацией АФК [61].

УНХ вызывают in vitro гибель клеток линии HepG2 (Human hepatoma cell lines), что связано с ингибированием пролиферации клеток, вызванной апоптозом [62]. При этом их токсичность, определенная на нормальных клетках печени L02 (Human normal liver cell lines), была ниже. Авторы считают, что это может быть связано с различиями в поверхности этих типов клеток и может, в принципе, иметь значение при разработке различных систем доставки лекарственных веществ [63].

Следует особо подчеркнуть, что нанохорны могут образовывать в воде дисперсии и эмульсии, что снижает вероятность образования пыли и аэрозолей, а также уменьшается потребность в токсичных органических растворителях при работе с ними. Сферические георгино-подобные структуры нанохорнов [44] создают менее стабильные аэрозоли, чем другие наноуглероды. А отсюда следует, что нанохорны в работе будут в целом безопаснее, чем другие наноматериалы [57, 64].

Графен

Наноматериалы на основе графена (GP) представляют собой целое семейство: сам однослойный графен (GP), многослойный графен (GP), оксид графена (GO), восстановленный оксид графена (rGO), нанолистики графена, графеновые ленты и графеновые квантовые точки (GQD) [65, 66]. На рис. 3 приведены три основных представителя этого семейства.

 

Рис. 3. Графен, оксид графена и восстановленный оксид графена [67]

 

Обзоры по токсичности графеновых наноструктур см. [68–74]. Особо выделяется обзор [75], в котором основное внимание сосредоточено на токсическом воздействии графеновых наноматериалов на лабораторных млекопитающих in vivo, так как именно это дает действительно реальную картину токсичности любого материала. Его ценность заключается также и в детальном анализе данных по токсичности разных типов графена и его аналогов с учетом конкретных данных по основным параметрам образцов использованных наноструктур.

На биологические эффекты графеновых наноматериалов (GNM) сильно влияют их физико-химические свойства: морфология, химия поверхности и чистота. Форма и размер могут влиять на поглощение клетками, функциональные группы могут изменять их взаимодействие с белками, биомолекулами и микроэлементами. Степень дисперсности суспензии также влияет на токсичность, а покрытие поверхности биосовместимыми фрагментами (образование «биокороны») может ее снижать [71].

Если углеродные наноматериалы (УНМ) представлены волокнами с высоким «aspect ratio», то есть тонкими и длинными, то они могут вызывать легочные реакции, сходные с реакцией на асбест [76, 77]. Длинные волокна медленнее выводятся, на них хуже действуют макрофаги, что приводит к нарушению фагоцитоза. Эта концепция принята в качестве ключевого механизма токсичности длинных волокон [78, 79].

Однако эти выводы не относятся к плоским структурам. После внутриплевральной инъекции GP (многослойный графен, d = 25 мкм) в плевральных макрофагах также наблюдались четкие признаки расстроенного фагоцитоза. Но это явление исчезало через 7 дней, и поэтому было высказано предположение, что GP разлагается на мелкие фрагменты, которые могут быть утилизированы макрофагами. Было также высказано предположение о биодеградации пегилированных (полиэтиленгликоль, ПЭГ – GP) и карбоксилированных (СООН – GP) производных графена [80].

Предполагается также, что не имеющие волокнистой формы наноструктуры GP с точки зрения безопасности лучше, нежели дисперсии углеродных нанотрубок [70].

На токсичность GP также влияют размеры частиц — большие частицы GO вызывали более сильное воспаление, нежели маленькие [81]. После многократных внутривенных инъекций большие частицы оксида графена (L-GO) проявляли более сильное токсическое действие, чем малые (S-GO), причем после многократных инъекций S-GO наблюдалась воспалительная инфильтрация печени [82]. Эти результаты согласуются с исследованиями по биораспределению. Так, установлено, что печень является основным органом, ответственным за накопление маленьких частиц GO, тогда как большие частицы накапливаются в легких [82, 83]. Зависит от размера и экскреция GO — частицы небольших размеров выводятся через почки [84]. При этом покрытие ПЭГ частиц GO ослабляет вызываемые ими повреждения тканей (печени, легких и почек, а также хронический фиброз печени и легких) [85].

Большинство GNM заряжено, и поэтому в физиологических условиях они способны к агрегации. Функционализация частиц улучшает растворимость и биосовместимость, снижая одновременно и токсичность [86].

Имеющиеся на сегодня данные свидетельствуют, что и неизмененные и функционализированные GNM обладают потенциальной токсичностью и генотоксичностью. Тем не менее данные все еще очень ограниченны, тем более, что в отличие от других наноструктур углерода существует и используется множество различных типов GNM и их модификаций. Так, при сравнении образцов GO разного размера было показано, что частицы большего размера дают и более сильный ответ [87]. Отмечается также, что реакционная способность поверхности и размер частиц играют важную роль в индукции легочного фиброза. Сообщалось также о более сильных воспалительных ответах в легких мышей после однократной глоточной аспирации более крупного GO (750–1300 нм) по сравнению с более мелким GO (50–350 нм) [81].

При обсуждении работ по ингаляционному воздействию GP и GO обычно указываются концентрации частиц во вдыхаемом воздухе [88, 89], их размеры (толщина, площадь и т. п.) [90], а также содержание углерода (от 84 до 77 %) [88, 89]. Тем не менее, например, в работе [91] приведены данные лишь по одному образцу GO, поэтому имеющиеся данные трудно сравнивать между собой. Однако использование разными авторами отличающихся образцов позволяет сделать общий вывод, что ингаляции GP и GO приводят к относительно слабой и обратимой легочной токсичности и воспалению.

Сравнение данных по легочной токсичности графена и оксида графена, вводимых мышам и крысам путем однократной интратрахеальной инстилляции, аспирации из глотки и внутриплевральной инъекции, показало, что агрегированный GP сохранялся в легких и вызывал перибронхиальное воспаление и легкий фиброз, а диспергированный GP не вызывал фиброз легких. Тем не менее GO индуцировал сильные повреждения легких, включая повышение уровня провоспалительных цитокинов и апоптотических клеток в жидкость бронхоальвеолярного лаважа, а также нарушение альвеолярно-капиллярного барьера [92]. Авторы отмечают, что ковалентное окисление GP является основным фактором его легочной токсичности, и предполагают, что дисперсия неизмененного GP определяет безопасность обращения и потенциального биомедицинского применения двумерных углеродных наноматериалов. Важную роль в индукции легочного фиброза играют площадь поверхности и размер частиц [подробности см. 75].

Высказывается также предположение, что острые повреждения легких GP и его производными связаны с окислительным стрессом [79, 93–95]. В целом GP проявляет меньшую легочную токсичность, чем GO. Однако GO считается более биосовместимым, чем GP, из-за его большей растворимости и диспергируемости, в результате чего он менее токсичен для клеток [69]. Воздействие GNM на дыхательные пути не вызывало явной системной токсичности, даже несмотря на то, что после интратрахеальной инстилляции меченые частицы GP и GO были обнаружены в основных органах [94, 95]. Отсюда следует, что частицы GP и GO могут переходить из легких в системную циркуляцию, пересекая альвеолярно-капиллярный барьер, и что GP и GO менее токсичны, чем ОСУНТ.

В обзоре M. Ema и соавт. [75] приведены данные 22 работ по внутрибрюшинному введению. Из всего массива данных следует отметить то, что после однократного внутрибрюшинного введения очищенного от побочных продуктов и контаминантов GO никаких воспалительных реакций или образования гранулем в диафрагмах у мышей не наблюдалось [96]. А многократные внутрибрюшинные инъекции ПЭГ-GO в дозе 20 мг/кг приводили к гибели 3 из 12 мышей, вероятно, из-за агрегации ПЭГ-GO и образования тромба [97]. Таким образом, можно сделать вывод, что при внутривенном введении GP и GO в высоких дозах вызывали летальные исходы из-за скопления в легких и их механического повреждения, что подтверждает способность GNM преодолевать альвеолярно-капиллярный барьер. В более низких дозах GP вызывал иммунные ответы, а GO — острые воспалительные реакции в легких и субхронический фиброз печени и легких, а поверхностные модификации ослабляли токсичность GO.

Но ограниченность данных связана еще и с существованием множества различных типов GNM и их потенциальных модификаций [75]. Отметим, что окислительный стресс и воспаление могут быть связаны с их токсичностью. В проявлении токсичности и биораспределении GNM важная роль принадлежит реакционной способности поверхности, размеру и степени дисперсности.

Предполагается, что основной механизм токсичности наноматериалов — это генерация АФК, приводящая к окислительному стрессу и стимулирующая воспалительные реакции [98, 99]. В присутствии GP в клетках потенцируется выработка АФК [92, 100].

Однако, поскольку GO не изменял уровни GSH или MDA в печени, селезенке или легких при внутривенном введении, окислительный стресс, вероятно, не служит основным механизмом проявления токсичности GNM [101]. В качестве механизма проявления токсичности было предложено прямое взаимодействие между клеточной мембраной и GO, поскольку его цитотоксичность заметно снижалась при инкубации с сывороткой, что, возможно, связано с высокой способностью белков адсорбировать GO [102]. GP может вызвать также прямое физическое повреждение, приводящее к дестабилизации мембраны и потере целостности клеток [71]. Размеры GP могут влиять на взаимодействие с различными рецепторами, ответственными за энергозависимые механизмы проникновения в клетки [66]. Заметно гидрофобная поверхность некоторых GNM может привести к их взаимодействию с мембранными липидами, то есть прямому физическому воздействию, приводящему к гибели клетки (прямая токсичность), или же «косвенной токсичности», вызванной абсорбцией биологических молекул [65, 66]. Однако для окончательного установления механизма проявления токсичности GNM необходимы дальнейшие исследования. Следовательно, варианты воздействия GNM на клетки разнообразны и требуют дальнейшего изучения.

Таким образом, в настоящее время какая-либо специфическая токсичность для GNM не установлена. Это не очень удивительно, так как существует множество форм GP с уникальными физическими свойствами и, следовательно, вызываемые ими токсические эффекты должны различаться [103]. Для изучения особых свойств GNM необходима разработка новых методов исследования, хотя для выявления вредного воздействия наноматериалов могут применяться и существующие протоколы испытаний на токсичность [104]. Токсикологические исследования GNM должны проводиться с особым вниманием к физико-химическим свойствам исследуемых образцов. Очень важны сведения о такой характеристике GNM, как толщина (число слоев), поскольку именно она является ключевой переменной, влияющей на поглощение клетками: число слоев влияет на осаждение и площадь поверхности, а химический состав поверхности — на абсорбцию и диспергируемость [65]. Однако, к сожалению, далеко не во всех исследованиях эти данные представлены.

И что крайне немаловажно, практически нет исследований хронической токсичности. А они необходимы. Без этих знаний даже не стоит думать о путях практического применения GNM. Эти исследования должны проводиться in vivo с использованием различных хорошо охарактеризованных образцов GNM, с использованием стандартных протоколов изучения хронической токсичности [105].

Наноалмазы

Среди других наноструктур углерода наноалмазы (ND) занимают особое место. Во-первых, в ND атомы углерода находятся в sp³-гибридизации, а во-вторых, существует несколько методов получения ND. V.N. Mochalin и соавт. [106] отмечают около десяти методов [детонационный синтез (DND), дробление алмазов, полученных при высоких давлениях и температурах (HPHT), химическое осаждение из пара (CVD) и т. д.]. Но для использования в биологических исследованиях можно выделить два метода, которые по терминологии нанотехнологий можно назвать «top down» или «botton up»: дробление алмазов, получаемых статическим синтезом (HPHT), или же их получение динамическим синтезом (DND) [107]. Существует еще один тип ND, очень важный для биологических исследований — так называемые флуоресцирующие наноалмазы (FND). Такие ND благодаря наличию дефектных NV-центров в кристаллической решетке при возбуждении светом с определенной длиной волны могут излучать беспрецедентно стабильную флуоресценцию [108, 109]. Поскольку эти флуоресцирующие дефекты защищены кристаллической решеткой, они стабильны в процессе исследования и не отбеливаются [110, 111]. Более того, образование флуоресцентной метки происходит внутри кристаллической решетки и никак не влияет на поверхность частиц [112].

Но в целом следует отметить, что чистота ND оставляет желать лучшего. Очищенный детонационный углерод может содержать до 90–97 % различных видов ND и 3–10 % наноалмазного углерода и других примесей [113]. Биологические аспекты использования ND изучают очень интенсивно (см. обзоры [114–116]).

Упоминание об использовании алмаза в качестве яда встречается уже в автобиографии Бенвенуто Челлини [117]. Он описывает, как его пытались убить добавлением в еду толченого алмаза. Естественно, что механизм токсичности такого алмаза связан напрямую с механическим воздействием частичек с острыми краями на стенки желудка, а не с каким-то биологическим действием. Поэтому-то от алмазов не ожидают также особых «неприятностей». В частности, от них не ждут канцерогенности, так как в алмазных структурах атомы углерода находятся в sp³-гибридизации, реакционная способность которых относительно невысока. Вероятно, поэтому ND и обладают наименьшей токсичностью среди наноструктур углерода [118, 119].

Тем не менее, как видно из рис. 4, поверхность частиц ND неоднонородна, и может содержать как различные функциональные группы, так и отдельные атомы. Это, с одной стороны, облегчает функционализацию, с другой — такое разнообразие заместителей должно в принципе отрицательно влиять на токсичность.

 

Рис. 4. Строение частицы наноалмаза [120]

 

Более того, строение поверхности частиц ND зависит от метода получения. Так, на поверхности DND имеется существенная доля атомов углерода в sp²-гибридизации [121]. Соотношение атомов углерода sp³/sp² зависит от степени очистки ND. И это один из факторов, влияющих на токсичность, — была показана корреляция потенциала АФК с соотношением углерода sp³/sp² — генерация АФК увеличивалась по мере уменьшения этого соотношения [122]. Хотя и считается, что ND статического синтеза не вызывают окислительного стресса, есть работа, в которой показано, что повреждающее действие ND на насекомых, Acheta domesticus (Orthoptera), хронически получавших их в рационе, объясняется окислительным стрессом (хотя воздействие, по-видимому, менее серьезно, чем у других наночастиц) [123].

О токсичности ND и зависимости ее, в частности, от чистоты образцов и функционализации см. также [124, 125].

Со времени пионерских исследований токсичности ND [118, 119] были проведены многочисленные исследования на разных объектах для получения всеобъемлющих токсикологических профилей этих наночастиц [126–128]. Основной задачей этих исследований было определение типа токсичности и основных механизмов ее проявления. И общий вывод, который можно сделать из многочисленных исследований токсичности, заключается в том, что производные ND различного происхождения и размеров не повреждают основные функции клеток, органов и организмов в разумном диапазоне концентраций.

Что касается конкрентных примеров, то A.M. Schrand и соавт. [118] с использованием различных методов анализа жизнеспособности клеток показали, что ND статического синтеза (размером от 2 до 10 нм) не токсичны для различных типов клеток. Кроме того, они не генерируют значительных количеств активных форм кислорода. Отсутствие токсичности неоднократно доказали другие авторы [106, 118, 129, 130]. Не токсичны, естественно, и FND [131–133].

Про токсичность ND in vivo известно очень мало, хотя доступные сведения позволяют говорить об их нетоксичности. Так, при замене в рационе мышей воды гидрозолями ND (в течение 3–6 мес.) было показано, что ND не вызывают их гибели и не влияют на нормальный рост внутренних органов [134]. Именно благодаря своей нетоксичности флуоресцирующие ND представляют альтернативу для квантовых точек, которые как раз и отличаются высокой токсичностью [135, 136]. Отсутствие токсичности и безвредность ND в опытах in vivo была также показана на эмбрионах zebrafish [137], хотя есть данные о дозозависимой токсичности ND на этой же модели [138].

У беспозвоночных Caenorhabditis elegans не наблюдалось изменений в продолжительности жизни, репродуктивном потенциале или уровне стресса в ответ на ND [139]. При кормлении этих червей суспензией FND видно, что конъюгаты с декстраном и с BSA проникают в клетки кишечника, а сами ND, распределенные в просвете кишечника, выделяются после кормления их Escherichia coli [139].

Модификация или функционализация развитой и разнообразной по свойствам поверхности ND имеют большое значение для их использования в биологии и медицине. Влияние модификации поверхности ND на их токсичность рассмотрены в работе [140].

Карбоксилированные наноалмазы (DNA), в концентрациях до 1000 мкг/мл, не токсичны для клеток и способны проникать во внутриклеточное пространство [141, см. также 118]. Хотя поглощение крупных частиц модифицированных DNA (размером порядка 100 нм) небезразлично для клеток HeLa — их жизнеспособность понижается по сравнению с чистыми DNA [142]. Но вряд ли это наблюдение можно считать показателем «обычной» токсичности, так как использовались достаточно крупные частицы, способные повреждать клетку чисто механически.

Доступные литературные данные указывают, что различные типы ND практически не токсичны. Вероятно, этого и следовало ожидать, так как системы метаболизма живых организмов не могут действовать на ND. В частности, показано, что цитохром Р450 способен окислять поверхность ND, но не разрушать их [143]. Более того, показано, что DNA, равно как GO и ND графита, ингибировали каталитическую активность цитохромов Р450 в микросомальных моделях (см. также [144]). Уже диамандоиды типа диамантана, триамантана, 2-изопропенил-2-метиладамантана и 3-изопропенил-3-метилдиамантана ингибируют активный центр ферментов подсемейства 2B цитохромов Р450 подсемейства IIB путем связывания с активным центром [145]. Все эти данные однозначно свидетельствуют о высокой метаболической устойчивости ND, причем как детонационного синтеза, так и синтеза под высоким давлением. Следовательно, и токсичность этих наночастиц будет низкой, и вероятно, что именно ND можно считать наименее токсичными из всех углеродных наноматериалов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Токсичность любого вещества связана, как правило, с тем, что оно вмешивается в какие-либо биохимические процессы в организме. Однако наноструктуры углерода не способны сами по себе вступать в какие-либо процессы в качестве реагентов. Поэтому проявлять токсичность они могут только опосредованно, например, генерируя АФК. Тем не менее в подавляющем большинстве случаев эта способность у наноструктур углерода (за исключением фуллеренов) выражена слабо. Поэтому наноструктуры углерода относятся к малотоксичным соединениям.

Несмотря на то что биологические свойства и возможность применения в биологии и медицине наноструктур углерода изучаются уже около 30 лет, многие вопросы остаются неисследованными. Поэтому сделанный выше вывод относится только к острой токсичности.

Что касается хронической токсичности наноструктур углерода, то этот вопрос, по нашим данным, практически не исследовался. И относится это в том числе и к сферическим наноструктрурам, особенно фуллеренам, которые представляют собой наиболее изученные наноструктуры. А без знания возможности проявления хронических эффектов трудно прогнозировать практические перспективы применения какого-либо соединения, в том числе и наноструктур углерода, какими бы они перспективными не выглядели [19]. Хотя некоторый оптимизм внушает тот факт, что для наноструктур углерода не обнаружена острая токсичность.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Вклад каждого автора: Е.В. Литасова, В.В. Ильин, М.А. Брусина — написание статьи, анализ данных; Л.Б. Пиотровский — редактирование статьи, разработка общей концепции.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Работа выполнена в рамках государственного задания № 075-01135-22-00 Минобрнауки России.

ADDITIONAL INFORMATION

Authors’ contribution. Thereby, all authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the study. The contribution of each author: E.V. Litasova, V.V. Ilyin, M.A. Brusina — manuscript drafting, writing and pilot data analyses; L.B. Piotrovsky — paper reconceptualization and general concept discussion.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Funding source. This study was supported by State Programme No. 075-01135-22-00, Ministry of Science and High Education of Russia.

^* О «fiber pathogenicity paradigm» («парадигме токсичности волокон»), определяемой шириной, длиной и биологической устойчивостью, а также высоким соотношением «толщина – длина» (aspect ratio) волокнистых наноматериалов, включая УНТ, как критических детерминант заболевания легких, включая мезотелиому, см. [14].

About the authors

Elena V. Litasova

Institute of Experimental Medicine

Author for correspondence.
Email: llitasova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0999-8212
SPIN-code: 5568-8939

Cand. Sci. (Biol.), leading research associate of the Laboratory of synthesis and nanotechnology of drag, Department of neuropharmacology

Russian Federation, Saint Petersburg

Victor V. Iljin

Institute of Experimental Medicine

Email: victor.iljin@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1012-7561
SPIN-code: 5559-8089

Cand. Sci. (Chem.), research associate of the Laboratory of synthesis and nanotechnology of drag, Department of neuropharmacology

Russian Federation, Saint Petersburg

Maria A. Brusina

Institute of Experimental Medicine

Email: mashasemen@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-8433-120X
SPIN-code: 8953-8772

Cand. Sci. (Chem.), junior research associate of the Laboratory of synthesis and nanotechnology of drag, Department of neuropharmacology

Russian Federation, Saint Petersburg

Levon B. Piotrovskiy

Institute of Experimental Medicine

Email: levon-piotrovsky@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8679-1365
SPIN-code: 2927-6178

Dr. Sci. (Biol.), head of the Laboratory of synthesis and nanotechnology of drag, Department of neuropharmacology

Russian Federation, Saint Petersburg

References