Changes in intracellular potentials and ionic currents of the mollusk and activity of Cl--channels under exposure to some inhibitory amino acids and new litium-containing compounds of them

Cover Page

Abstract


The Changes of membrane rest potential (RP), action potential (AP), impulse activity (IA) as well as sodium, calcium and potassium ionic currents in neurons of isolated central nervous system of the Planorbarius corneus mollusk (pedal ganglia) under the extracellular action of inhibitory amino acids GABA, glycine and β-alanine and their litium-containing derivatives (LCD) in 0.1, 1 and 5 mM concentrations have been studied using a microelectrode technique. They induced the same dose-dependent and irreversible depolarization of neurons on 2-10 mV accompanied by increase of AP frequency, prolongation of their duration and decrease of summmerized ionic currents (dV/dt). According to degree of depolarization, the drugs were placed in the following range in decreasing activity: compound 3 > compound 2 > compound 1. In identified pedal ganglion neurons (PPed1), compound 3 in contrast to other compounds induced hyperpolarization by 2-10 mV and blocked impulse activity. The amplitude of sodium and calcium channels was decreased by 7-15 %, in the same degree after application of all compounds exposed in concentration of 5 mM. Efflux potassium ionic currents were increased in dose-dependent manner and irreversibly about by 3-7 % assessed on amplitude indexes without changes in kinetic parameters after application of LCD. Therefore, the decrease of ionic current amplitudes was due to both depolarization of neurons and direct action of LCD on ionic channels. Thus, LCD possess membranotropic activity and can modulate functional state of neurons. In the study of chloride channels in cells culture of rat glioma C6 in vitro by patch-clamp method, GABA, glycine, β-alanine and their LCD 10 µM/l activated chloride channels, shifting equiliblium membrane potential of glioma cells from -90… -70 mV to -55... -60 mV. All compounds (transmitters and LCD) were placed in the following range: glycine > GABA > β-alanine and compound 1 > compound 3 > compound 2 according to descending activity. Therefore, the most active compounds activating Cl--channels were glycine and compound 1 (LCD). Glycine was shown to be coagonist GABA receptors and its litium salt possessed significant membranotropic activity.

Full Text

Изучению многостороннего влияния фармакологических средств на биологические объекты посвящены десятки тысяч публикаций. Исследование действия известных и вновь синтезированных соединений на клеточно-молекулярном уровне представляет наибольший интерес, поскольку при этом вскрываются или уточняются механизмы молекулярного действия и места связывания в клетке [2-8]. Аминокислоты являются не только метаболитами и составным компонентом белков, но и как физиологически активные вещества выполняют в организме и многочисленные регуляторные функции, главным образом нейромедиаторные. Известны многочисленные производные аминокислот с выраженными фармакологическими свойствами. Поиск новых лекарственных средств среди производных аминокислот продолжается. Для ГАМК показано многообразие физиологических и биохимических функций, имеются данные о нарушении ее образования при некоторых психопатологических и неврологических расстройствах [9-13]. Модификация молекулы ГАМК введением фенильного радикала привела к созданию препарата фенибута, который легко преодолевает гематоэнцефалический барьер и оказывает выраженное тормозное транквилизирующее действие. Со временем удалось установить, что в тканях мозга ГАМК утрачивает аминогруппу, которая замещается гидроксилом, образуется гамма-оксимасляная кислота (ГОМК). Ее натриевая соль - оксибутират натрия - широко используется в качестве наркозного средства. Создание ГАМК-подобных препаратов и изучение их эффектов позволило говорить о существовании двух основных функций ГАМК - медиаторной и метаболической. С медиаторной функцией связано участие ГАМК в регуляции уровня бодрствования, двигательной активности, сосудистого тонуса, поддержании высокого судорожного порога и отчасти улучшении памяти и мышления. Метаболическая функция - это прежде всего обеспечение мозга энергией, устойчивость к кислородному голоданию и другим вредным воздействиям. Другая тормозная аминокислота - глицин (α-аминоуксусная кислота). Будучи тормозным медиатором, глицин «работает» на спинальном уровне, препятствуя распространению импульса, пришедшего по чувствительным задним корешкам спинного мозга. Природные антагонисты глицина - столбнячный токсин и алкалоид стрихнин, блокируя глициновые рецепторы, вызывают тоническое сокращение мышц всего тела, которое принимает типичную при отравлении стрихнином или столбняке позу опистотонуса: выгибание с опорой на затылок и пятки. В современной медицине стрихнин используется редко. А вот глицин завоевывает все большую популярность. Он не только усиливает действие противосудорожных средств, но и ускоряет засыпание, обладает антиоксидантным, противострессорным, транквилизирующим и ноотропоподобным действием, блокируя гиперактивность гипофизарно-адреналовой системы. Он не оказывает миорелаксантного действия, ослабляет эффект алкоголя, не вызывает зависимости, повышает скорость реакций, усиливает умственную работоспособность. Показаниями к применению глицина считаются стрессовые состояния, психоэмоциональное напряжение, повышенная возбудимость, эмоциональная лабильность, неврозы, вегетососудистая дистония, последствия черепно-мозговой травмы, энцефалопатии, в том числе алкогольные, нарушения сна. Таким образом, производные тормозных аминокислот могут оказаться перспективными в лечении и профилактике многих психоневрологических заболеваний [7, 8, 11-14]. В настоящее исследование включено изучение мембранотропных эффектов литийсодержащих соединений, синтезированных на основе тормозных аминокислот - ГАМК, глицина, β-аланина, структурные формулы которых представлены на рисунке 1. В связи с тем что сравнительных сведений об изменениях электрофизиологических параметров функционального состояния нейронов (потенциал покоя, потенциал действия, различных типов ионных токов) под влиянием новых литийсодержащих соединений в литературе нет, представляется актуальным изучение их мембранотропных свойств, влияние на электрическую активность нейронов и их трансмембранные ионные токи. Методика исследования Микроэлектродные исследования выполнены на наиболее крупных идентифицируемых (100-200 мкм) нейронах педальных ганглиев изолированной ЦНС моллюска катушки роговой (Planorbarius corneus). Нейроны в ганглиях данного моллюска пигментированы и хорошо видны под бинокулярной лупой (рис. 2). Из тела моллюска вырезали кольцо ганглиев и помещали в камеру объемом около 0,5 см3 с физиологическим раствором (в мМ/л): NaCl - 50; KCl - 2; CaCl2 - 4; MgCl2 - 1,5; трис-ОН - 10; рН - 7,5. Для регистрации электрофизиологических характеристик нейронов использовали стеклянные МЭ, заполненные 2,5 М KCl, с сопротивлением 10-20 мОм [2, 3]. Измерения ионных токов при фиксации потенциала и регистрации трансмембранных ионных токов проведены на изолированных неидентифицированных нейронах с диаметром около 100 мкм как катушки, так и прудовика (Lymnaea stagnalis) [2, 3]. Состояние хлорных каналов изучали в опытах in vitro с помощью метода «пэтч-кламп» [1] на клетках глиомы крысы линии C6. Регистрировали равновесный мембранный потенциал клеток глиомы крысы в покое и при активации (открывании) хлорных каналов. В последнем случае равновесный мембранный потенциал сдвигается от -90 до -60 мВ и даже -55 мВ. Литийсодержащие соединения (ЛСС) растворяли в физиологическом растворе до концентрации 5 мМ, далее разбавляли до 1 и 0,1 мМ и изучали их при внеклеточном приложении. В первой части работы оценивали (качественно) динамику изменений потенциала покоя (ПП), импульсной активности (ИА), параметров потенциалов действия (ПД) и суммарных ионных токов (по первой производной ПД - dV/dt). Во второй части - регистрировали изменения амплитуд калиевых ионных токов и характер изменений их кинетики активации и инактивации (качественно). Биопотенциалы регистрировали с помощью аналогоцифрового преобразователя фирмы L-Card L-791 (Россия). Для построения и наложения на один кадр кривых ионных токов использовали программу Excel. Результаты исследования Исходные величины ПП для разных нейронов катушки варьировали от -45 до -60 мВ, нейроны генерировали ПД амплитудой от 50 до 90 мВ с «овершутом». Некоторые из них были молчащими или с различным характером импульсной активности (ИА): регулярной или нерегулярной, одиночной или пачечной. Большинство результатов получено на импульсноактивных нейронах педальных ганглиев. В первой серии экспериментов на изолированной ЦНС катушки показано, что под влиянием ЛСС в диапазоне концентраций от 0,1 до 5 мМ в целом происходили зависимые от концентрации де- и гиперполяризационные изменения ПП с соответствующими изменениями ИА, параметров ПД и скоростей развития ПД (dV/dt, отражающих суммарные входящие и выходящие ионные токи). Эффекты стабилизировались в течение 1-3 мин от начала действия ЛСС, они были обратимы в течение 2-10 мин. На фоне незначительных изменений ПП перестройка ИА была разнообразной, что зависело от типа нейронов, величины ПП (уровня функционального состояния), характера фоновой ИА и концентраций ЛСС. Таким образом, хотя исходные параметры электрической активности различных нейронов и их реакции на ЛСС были вариабельными, но их характерные тенденции повторялись. Так, на одном и том же нейроне левого педального ганглия (ЛПед1) с нерегулярной пачечной активностью последовательно были зарегистрированы эффекты на три ЛСС в трех концентрациях (рис. 3). Видно, что реакции на различные соединения были сходными (рис. 3 А, Б и В): дозозависимыми, обратимыми, с небольшой деполяризацией (от 1-2 до 6-7 мВ), со снижением амплитуд ПД. При этом соединения по повышению степени развивающейся деполяризации и снижению амплитуд ПД можно расположить в ряд по убыванию активности: соединение 3 > соединение 2 > соединение 1, то есть наиболее активным оказалось соединение 3. Далее, на другом рисунке (рис. 6) и на ускоренной развертке во времени, показано, что наряду с дозозависимой деполяризацией при возрастающих концентрациях соединений увеличивается длительность спонтанных ПД и сокращаются скорости их развития (dV/dt), отражающие суммарные входящие (натрий-кальциевые) и выходящие (калиевые) ионные токи. На этом же нейроне было показано, что его реакции на три соединения в концентрации 1 мМ (рис. 4 А, 1-3) по степени выраженности повторяли тот же ряд (соединение 3 > соединение 2 > соединение 1). Существенно более сильная реакция соединения 3 (вплоть до обратимого подавления ИА), по сравнению с другими, была зарегистрирована на нейроне левого педального ганглия (ЛПед3) в их одинаковой концентрации 5 мМ (рис. 4 Б, 2, 4, 6). Это указывает на неодинаковую чувствительность различных нейронов ЦНС катушки к соединению 3. Принципиально отличный эффект соединения 3 наблюдался на нейроне правого педального ганглия (ППед1): реакция нейрона на него была в виде дозозависимой и обратимой гиперполяризации на 2-3 до 10 мВ и прекращения ИА (нейрон одного животного - рисунки 5 А, 2 и 9; такой же нейрон другого животного - Б, 2 и 4). По сравнению с гиперполяризующим эффектом соединения 3 соединения 1 и 2 на этом нейроне вызывали деполяризацию (рисунок 5, фрагменты 4, 6, 7 и 8; рисунок 5, Б, 6 и 8). Выше упоминалось, что на фоне деполяризации нейронов под влиянием ЛСС наблюдается снижение амплитуд ПД, увеличение частоты ПД, их длительности и уменьшения скоростей развития ПД (суммарных ионных токов). Характерный пример такой реакции представлен на развернутых во времени кривых ИА, ПД и dV/dt (рис. 6, А-Г, 1 и 2), представленных выше на рисунке 3 для эффектов соединения 1, видно и восстановление параметров электрической активности после отмывания соединения (рис. 6, Д, 1 и 2). Далее, на изолированных нейронах катушки и прудовика в условиях фиксации мембранного потенциала было показано, что под влиянием ЛСС в концентрациях 0,1-5 мМ изменения ионных токов (на примере медленных выходящих калиевых токов) слабо дозозависимы, незначительны и почти одинаковые для всех трех исследованных соединений (рис. 7). Так, соединение 2 незначительно (5-7 %) увеличивало (активировало) токи (рис. 7 А и Б). Примерно сходным образом в концентрации 5 мМ соединение 1 (см. рис. 7 В) и соединение 3 (рис. 7 В) увеличивали эти токи, а изменения сохранялись и после отмывания ЛСС. Кинетика активации и инактивации калиевых токов существенно не изменялась. Все изменения ионных токов под влиянием ЛСС наступали в течение 1 мин, но их восстановление при отмывании было замедленным. Неспецифические токи утечки мембраны нейронов под влиянием ЛСС существенно не изменялись. Изменения входящих ионных токов были столь же несущественными, но под влиянием ЛСС они снижались: амплитуда натриевых токов уменьшалась слабо дозозависимо и примерно одинаково для всех трех соединений и при концентрации 5 мМ на 8-10 % (рис. 8 А - пример для соединения 1). Амплитуда кальциевых токов при действии ЛСС снижалась чуть более, чем натриевых токов и при концентрации 5 мМ на 10-15 % (рис. 8, Б-Г). Эффекты развивались и устранялись при отмывании ЛСС быстро (1-3 мин). При анализе данных, полученных в опытах in vitro с помощью метода «пэтч-кламп», было показано, что равновесный мембранный потенциал клеток глиомы крысы линии C6 на вторые сутки с момента культивирования лежит в диапазоне от -90 до -70 мВ. При активации (открывании) хлорных каналов мембранный потенциал сдвигается к равновесному потенциалу хлорных каналов, который составляет -55… -60 мВ. Из представленных данных видно (рис. 9, 10), что как ГАМК, так и глицин в концентрации 10 мкмоль/л достоверно изменяют трансмембранный потенциал, то есть активируют (открывают) хлорный канал, причем эффект глицина оказался даже более выраженным, чем у ГАМК, тогда как другой известный агонист глициновых рецепторов β-аланин не влиял на активность хлорных каналов. Подобную же направленность эффектов продемонстрировали и литиевые соли вышеозначенных тормозных аминокислот (в связи со схожестью результатов данные не представлены). Полученные данные свидетельствуют о том, что глицин, так же как и ГАМК, может влиять на активность хлорных каналов, т. е. функциональное состояние ГАМК-бензодиазепинового рецепторного комплекса. Обсуждение полученных результатов Полученные данные о сравнительных изменениях электрофизиологических параметров нейронов под влиянием ЛСС убедительно свидетельствуют об их существенно выраженной мембранотропной активности, возможной и, по-видимому, достаточно широкой терапевтической активности анксиолитической и противосудорожной направленности. Сходная дозозависимая и обратимая деполяризация под влиянием соединений 1, 2 и 3 на большинстве нейронов и усиление (повышение возбудимости и активация) электрической активности могут указывать на их активирующий эффект. Соединение 3 при этом оказалось более активным и, кроме того, на идентифицированном ППед1 нейроне - с противоположным - гиперполяризующим («успокаивающим») эффектом (со снижением возбудимости, урежением и прекращением импульсной активности). Таким образом, с удлинением молекул ЛСС их эффекты усиливаются. Деполяризация клеточных мембран может быть связана с подавлением электрогенной части в работе натрий-калиевого насоса и с изменениями пассивной проницаемости клеточных мембран к ионам натрия, кальция или калия при действии ЛСС, хотя неспецифические токи утечки мембраны изменялись незначительно [2-4]. Гиперполяризацию клеток при действии соединения 3 или после его действия можно объяснить усилением вклада в величину ПП электрогенной составляющей натрий-калиевого насоса, снижением пассивной проницаемости к ионам натрия и кальция или повышением ее к ионам калия [1-3]. Не исключается участие в этих процессах ионов хлора или каких-либо клеточных (мембранных) рецепторов. Кроме того, не исключается липидотропное действие ЛСС на мембраны, приводящее к увеличению их текучести - так называемое «разжижающее» действие. Это приводит к изменению их жидко-кристаллического состояния, возрастает подвижность молекул липидов и белков в ее липидном бислое. Известно, что изменения фазового состояния мембраны оказывают существенное влияние на процессы мембранного транспорта, на системы трансмембранной передачи информации, на активность мембраносвязанных ферментов [3, 5]. Могут изменяться нейромедиаторные процессы, функционирование ферментов и ионных каналов. Изменения суммарных ионных токов, параметров ПД и ИА нейронов под влиянием ЛСС обусловлены как соответствующими изменениями ПП, так и незначительным прямым влиянием на потенциалоуправляемые ионные каналы [2-6]. Поскольку ведущими в клеточных эффектах ЛСС являются изменения ПП, то для выяснения молекулярных механизмов их действия нами выполнены дополнительные эксперименты по изучению возможного участия в этом мембранных рецепторов (и в первую очередь основного тормозного ГАМК-рецептора). В наших прежних работах анализировались в основном натриевые, калиевые и кальциевые трансмембранные токи. В данной работе представлено влияние литийсодержащих соединений на хлорные каналы в исследовании с помощью метода «пэтч-кламп» на клетках глиомы крысы линии C6. В частности, в этих исследованиях было показано, что равновесный мембранный потенциал клеток глиомы крысы линии C6 на вторые сутки с момента культивирования лежит в диапазоне от -90 до -70 мВ. При активации (открывании) хлорных каналов мембранный потенциал сдвигается к равновесному потенциалу хлорных каналов, который составляет -55… -60 мВ. Тормозные нейромедиаторы ГАМК и глицин в концентрации 10 мкмоль/л достоверно меняли трансмембранный потенциал, способствуя активации (открыванию) хлорных каналов. При этом эффект глицина оказался более выраженным, чем у ГАМК, в то время как другой известный агонист глициновых рецепторов β-аланин вовсе не влиял на активность хлорных каналов. Подобную же направленность эффектов продемонстрировали и литиевые соли вышеозначенных тормозных аминокислот (соединения 1, 2 и 3). В целом их действие было однотипным в сравнении с эффектами глицина и ГАМК. Полученные данные свидетельствуют, что глицин, так же как и ГАМК, может влиять на активность хлорных каналов, то есть на функциональное состояние трансмембранного комплекса ГАМКА-рецептор/Cl--канал. Заключение Таким образом, можно сделать основной вывод, что ЛСС через изменения ПП модулируют электрическую активность и ионные токи нейронов моллюсков, а также влияют на активность хлорных каналов нейронов крыс. ЛСС оказывают как активирующее действие на электрическую активность нейронов моллюсков, так и угнетающее выраженное гиперполяризующее («тормозное») действие на отдельные нейроны (соединение 3). Молекулярные механизмы разнонаправленных клеточных эффектов ГАМК и глицина, с одной стороны, и ЛСС - с другой, с большой степенью вероятности можно объяснить вовлечением в их действие не только трансмембранного комплекса ГАМКА-рецептор/Cl--канал, но и других молекулярных мишеней, например NMDA-рецепторов, с блокадой которых может быть связано противосудорожное действие тормозных медиаторов и полученных на их основе литийсодержащих соединений.

About the authors

Petr Dmitrievich Shabanov

Institute of Experimental Medicine

Email: pdshabanov@mail.ru
Dr. Med. Sci. (Pharmacology), Professor

Anatoliy Ivanovich Vislobokov

First St. Petersburg State Medical University

Email: vislobokov@yandex.ru
Dr. Biol. Sci. (Physiology), Head, Dept. of Cytopharmacology

Georgiy Nolianovich Shilov

Belorussian State Medical Academy of Advanced Studies

Email: george_shilau@mail.ru
PhD (Neurology), Researcher

P M Bulay

Belorussian State University

Assistant Professor, Deptartment of Biophysics

A P Lugovskii

Belorussian State University

Assistant Professor, Deptartment of Biophysics

References

  1. Букинич А. А., Шабанов П. Д. Функциональное значение димерных (гетеромерных) рецепторов в ЦНС позвоночных. Обз. по клин. фармакол. и лек. терапии. 2015; 13 (1): 25-31.
  2. Вислобоков А. И., Игнатов Ю. Д., Галенко-Ярошевский П. А., Шабанов П. Д. Мембранотропное действие фармакологических средств. СПб.-Краснодар: Просвещение-Юг, 2010. - 528 с.
  3. Вислобоков А. И., Борисова В. А., Прошева В. И., Шабанов П. Д. Фармакология ионных каналов. Серия: Цитофармакология (Т. 1), СПб.: Информ-Навигатор, 2012. - 528 с.
  4. Камкин А. Г., Киселева И. С. Физиология и молекулярная биология мембран клеток: учеб. пособие. М.: ИЦ Академия, 2008. - 592 с.
  5. Катцунг Б. Г. Базисная и клиническая фармакология. М.: Бином, 2000; 406-28.
  6. Сергеев П. В., Шимановский Н. Л. Рецепторы физиологически активных веществ. М.: Медицина,1987; 213-29.
  7. Шилов Г. Н., Бубель О. Н., Пушкарчук А. Л. Перспективы обоснования назначения глицина в комплексной противосудорожной терапии на основе некоторых новых представлений о структуре ГАМК-бензодиаепиновых рецепторов. Человек и лекарство. Тез. докл. ХI Рос. нац. конгр. М., 2004; 61.
  8. Яхно Н. Н., Штульман Д. Р. Болезни нервной системы. М., 2003; 208-44.
  9. Brody T. M. et al. Human pharmacology, molecular to clinical. 3rd ed. New York: Mosby Year Book Inc., 1998; 1001.
  10. Camerino D. C., Tricarico D., Desaphy J. F. Ion channel pharmacology. Neurotherapeutics. 2007; 4 (2): 184-98.
  11. Goodman & Gilman’s. The pharmacological basis of therapeutics. 9th ed. New York: McGraw Hill. 2004; 461-86.
  12. Narahashi T. Neuroreceptors and ion channels as the basis for drug action: past, present, and future. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2000; 294 (1): 1-26.
  13. Shilov G. N. Cyclic GABA conformer and Glycine as natural endogen agonists of GABA-benzodiazepine-receptor complex. 31st Int. Epilepsy Congr. Istanbul, Turkey, 2015.
  14. Smith C. U. M. Elements of molecular neurobiology. 2nd ed. London: J. Wiley, 1996. - 552 p.

Statistics

Views

Abstract - 1263

PDF (Russian) - 310

Cited-By


Article Metrics

Metrics Loading ...

PlumX

Dimensions


Copyright (c) 2015 Shabanov P.D., Vislobokov A.I., Shilov G.N., Bulay P.M., Lugovskii A.P.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies