Changes in intracellular potentials and ionic currents of the mollusk and activity of Cl--channels under exposure to some inhibitory amino acids and new litium-containing compounds of them

Full Text

Изучению многостороннего влияния фармакологических средств на биологические объекты посвящены десятки тысяч публикаций. Исследование действия известных и вновь синтезированных соединений на клеточно-молекулярном уровне представляет наибольший интерес, поскольку при этом вскрываются или уточняются механизмы молекулярного действия и места связывания в клетке [2-8]. Аминокислоты являются не только метаболитами и составным компонентом белков, но и как физиологически активные вещества выполняют в организме и многочисленные регуляторные функции, главным образом нейромедиаторные. Известны многочисленные производные аминокислот с выраженными фармакологическими свойствами. Поиск новых лекарственных средств среди производных аминокислот продолжается. Для ГАМК показано многообразие физиологических и биохимических функций, имеются данные о нарушении ее образования при некоторых психопатологических и неврологических расстройствах [9-13]. Модификация молекулы ГАМК введением фенильного радикала привела к созданию препарата фенибута, который легко преодолевает гематоэнцефалический барьер и оказывает выраженное тормозное транквилизирующее действие. Со временем удалось установить, что в тканях мозга ГАМК утрачивает аминогруппу, которая замещается гидроксилом, образуется гамма-оксимасляная кислота (ГОМК). Ее натриевая соль - оксибутират натрия - широко используется в качестве наркозного средства. Создание ГАМК-подобных препаратов и изучение их эффектов позволило говорить о существовании двух основных функций ГАМК - медиаторной и метаболической. С медиаторной функцией связано участие ГАМК в регуляции уровня бодрствования, двигательной активности, сосудистого тонуса, поддержании высокого судорожного порога и отчасти улучшении памяти и мышления. Метаболическая функция - это прежде всего обеспечение мозга энергией, устойчивость к кислородному голоданию и другим вредным воздействиям. Другая тормозная аминокислота - глицин (α-аминоуксусная кислота). Будучи тормозным медиатором, глицин «работает» на спинальном уровне, препятствуя распространению импульса, пришедшего по чувствительным задним корешкам спинного мозга. Природные антагонисты глицина - столбнячный токсин и алкалоид стрихнин, блокируя глициновые рецепторы, вызывают тоническое сокращение мышц всего тела, которое принимает типичную при отравлении стрихнином или столбняке позу опистотонуса: выгибание с опорой на затылок и пятки. В современной медицине стрихнин используется редко. А вот глицин завоевывает все большую популярность. Он не только усиливает действие противосудорожных средств, но и ускоряет засыпание, обладает антиоксидантным, противострессорным, транквилизирующим и ноотропоподобным действием, блокируя гиперактивность гипофизарно-адреналовой системы. Он не оказывает миорелаксантного действия, ослабляет эффект алкоголя, не вызывает зависимости, повышает скорость реакций, усиливает умственную работоспособность. Показаниями к применению глицина считаются стрессовые состояния, психоэмоциональное напряжение, повышенная возбудимость, эмоциональная лабильность, неврозы, вегетососудистая дистония, последствия черепно-мозговой травмы, энцефалопатии, в том числе алкогольные, нарушения сна. Таким образом, производные тормозных аминокислот могут оказаться перспективными в лечении и профилактике многих психоневрологических заболеваний [7, 8, 11-14]. В настоящее исследование включено изучение мембранотропных эффектов литийсодержащих соединений, синтезированных на основе тормозных аминокислот - ГАМК, глицина, β-аланина, структурные формулы которых представлены на рисунке 1. В связи с тем что сравнительных сведений об изменениях электрофизиологических параметров функционального состояния нейронов (потенциал покоя, потенциал действия, различных типов ионных токов) под влиянием новых литийсодержащих соединений в литературе нет, представляется актуальным изучение их мембранотропных свойств, влияние на электрическую активность нейронов и их трансмембранные ионные токи. Методика исследования Микроэлектродные исследования выполнены на наиболее крупных идентифицируемых (100-200 мкм) нейронах педальных ганглиев изолированной ЦНС моллюска катушки роговой (Planorbarius corneus). Нейроны в ганглиях данного моллюска пигментированы и хорошо видны под бинокулярной лупой (рис. 2). Из тела моллюска вырезали кольцо ганглиев и помещали в камеру объемом около 0,5 см3 с физиологическим раствором (в мМ/л): NaCl - 50; KCl - 2; CaCl2 - 4; MgCl2 - 1,5; трис-ОН - 10; рН - 7,5. Для регистрации электрофизиологических характеристик нейронов использовали стеклянные МЭ, заполненные 2,5 М KCl, с сопротивлением 10-20 мОм [2, 3]. Измерения ионных токов при фиксации потенциала и регистрации трансмембранных ионных токов проведены на изолированных неидентифицированных нейронах с диаметром около 100 мкм как катушки, так и прудовика (Lymnaea stagnalis) [2, 3]. Состояние хлорных каналов изучали в опытах in vitro с помощью метода «пэтч-кламп» [1] на клетках глиомы крысы линии C6. Регистрировали равновесный мембранный потенциал клеток глиомы крысы в покое и при активации (открывании) хлорных каналов. В последнем случае равновесный мембранный потенциал сдвигается от -90 до -60 мВ и даже -55 мВ. Литийсодержащие соединения (ЛСС) растворяли в физиологическом растворе до концентрации 5 мМ, далее разбавляли до 1 и 0,1 мМ и изучали их при внеклеточном приложении. В первой части работы оценивали (качественно) динамику изменений потенциала покоя (ПП), импульсной активности (ИА), параметров потенциалов действия (ПД) и суммарных ионных токов (по первой производной ПД - dV/dt). Во второй части - регистрировали изменения амплитуд калиевых ионных токов и характер изменений их кинетики активации и инактивации (качественно). Биопотенциалы регистрировали с помощью аналогоцифрового преобразователя фирмы L-Card L-791 (Россия). Для построения и наложения на один кадр кривых ионных токов использовали программу Excel. Результаты исследования Исходные величины ПП для разных нейронов катушки варьировали от -45 до -60 мВ, нейроны генерировали ПД амплитудой от 50 до 90 мВ с «овершутом». Некоторые из них были молчащими или с различным характером импульсной активности (ИА): регулярной или нерегулярной, одиночной или пачечной. Большинство результатов получено на импульсноактивных нейронах педальных ганглиев. В первой серии экспериментов на изолированной ЦНС катушки показано, что под влиянием ЛСС в диапазоне концентраций от 0,1 до 5 мМ в целом происходили зависимые от концентрации де- и гиперполяризационные изменения ПП с соответствующими изменениями ИА, параметров ПД и скоростей развития ПД (dV/dt, отражающих суммарные входящие и выходящие ионные токи). Эффекты стабилизировались в течение 1-3 мин от начала действия ЛСС, они были обратимы в течение 2-10 мин. На фоне незначительных изменений ПП перестройка ИА была разнообразной, что зависело от типа нейронов, величины ПП (уровня функционального состояния), характера фоновой ИА и концентраций ЛСС. Таким образом, хотя исходные параметры электрической активности различных нейронов и их реакции на ЛСС были вариабельными, но их характерные тенденции повторялись. Так, на одном и том же нейроне левого педального ганглия (ЛПед1) с нерегулярной пачечной активностью последовательно были зарегистрированы эффекты на три ЛСС в трех концентрациях (рис. 3). Видно, что реакции на различные соединения были сходными (рис. 3 А, Б и В): дозозависимыми, обратимыми, с небольшой деполяризацией (от 1-2 до 6-7 мВ), со снижением амплитуд ПД. При этом соединения по повышению степени развивающейся деполяризации и снижению амплитуд ПД можно расположить в ряд по убыванию активности: соединение 3 > соединение 2 > соединение 1, то есть наиболее активным оказалось соединение 3. Далее, на другом рисунке (рис. 6) и на ускоренной развертке во времени, показано, что наряду с дозозависимой деполяризацией при возрастающих концентрациях соединений увеличивается длительность спонтанных ПД и сокращаются скорости их развития (dV/dt), отражающие суммарные входящие (натрий-кальциевые) и выходящие (калиевые) ионные токи. На этом же нейроне было показано, что его реакции на три соединения в концентрации 1 мМ (рис. 4 А, 1-3) по степени выраженности повторяли тот же ряд (соединение 3 > соединение 2 > соединение 1). Существенно более сильная реакция соединения 3 (вплоть до обратимого подавления ИА), по сравнению с другими, была зарегистрирована на нейроне левого педального ганглия (ЛПед3) в их одинаковой концентрации 5 мМ (рис. 4 Б, 2, 4, 6). Это указывает на неодинаковую чувствительность различных нейронов ЦНС катушки к соединению 3. Принципиально отличный эффект соединения 3 наблюдался на нейроне правого педального ганглия (ППед1): реакция нейрона на него была в виде дозозависимой и обратимой гиперполяризации на 2-3 до 10 мВ и прекращения ИА (нейрон одного животного - рисунки 5 А, 2 и 9; такой же нейрон другого животного - Б, 2 и 4). По сравнению с гиперполяризующим эффектом соединения 3 соединения 1 и 2 на этом нейроне вызывали деполяризацию (рисунок 5, фрагменты 4, 6, 7 и 8; рисунок 5, Б, 6 и 8). Выше упоминалось, что на фоне деполяризации нейронов под влиянием ЛСС наблюдается снижение амплитуд ПД, увеличение частоты ПД, их длительности и уменьшения скоростей развития ПД (суммарных ионных токов). Характерный пример такой реакции представлен на развернутых во времени кривых ИА, ПД и dV/dt (рис. 6, А-Г, 1 и 2), представленных выше на рисунке 3 для эффектов соединения 1, видно и восстановление параметров электрической активности после отмывания соединения (рис. 6, Д, 1 и 2). Далее, на изолированных нейронах катушки и прудовика в условиях фиксации мембранного потенциала было показано, что под влиянием ЛСС в концентрациях 0,1-5 мМ изменения ионных токов (на примере медленных выходящих калиевых токов) слабо дозозависимы, незначительны и почти одинаковые для всех трех исследованных соединений (рис. 7). Так, соединение 2 незначительно (5-7 %) увеличивало (активировало) токи (рис. 7 А и Б). Примерно сходным образом в концентрации 5 мМ соединение 1 (см. рис. 7 В) и соединение 3 (рис. 7 В) увеличивали эти токи, а изменения сохранялись и после отмывания ЛСС. Кинетика активации и инактивации калиевых токов существенно не изменялась. Все изменения ионных токов под влиянием ЛСС наступали в течение 1 мин, но их восстановление при отмывании было замедленным. Неспецифические токи утечки мембраны нейронов под влиянием ЛСС существенно не изменялись. Изменения входящих ионных токов были столь же несущественными, но под влиянием ЛСС они снижались: амплитуда натриевых токов уменьшалась слабо дозозависимо и примерно одинаково для всех трех соединений и при концентрации 5 мМ на 8-10 % (рис. 8 А - пример для соединения 1). Амплитуда кальциевых токов при действии ЛСС снижалась чуть более, чем натриевых токов и при концентрации 5 мМ на 10-15 % (рис. 8, Б-Г). Эффекты развивались и устранялись при отмывании ЛСС быстро (1-3 мин). При анализе данных, полученных в опытах in vitro с помощью метода «пэтч-кламп», было показано, что равновесный мембранный потенциал клеток глиомы крысы линии C6 на вторые сутки с момента культивирования лежит в диапазоне от -90 до -70 мВ. При активации (открывании) хлорных каналов мембранный потенциал сдвигается к равновесному потенциалу хлорных каналов, который составляет -55… -60 мВ. Из представленных данных видно (рис. 9, 10), что как ГАМК, так и глицин в концентрации 10 мкмоль/л достоверно изменяют трансмембранный потенциал, то есть активируют (открывают) хлорный канал, причем эффект глицина оказался даже более выраженным, чем у ГАМК, тогда как другой известный агонист глициновых рецепторов β-аланин не влиял на активность хлорных каналов. Подобную же направленность эффектов продемонстрировали и литиевые соли вышеозначенных тормозных аминокислот (в связи со схожестью результатов данные не представлены). Полученные данные свидетельствуют о том, что глицин, так же как и ГАМК, может влиять на активность хлорных каналов, т. е. функциональное состояние ГАМК-бензодиазепинового рецепторного комплекса. Обсуждение полученных результатов Полученные данные о сравнительных изменениях электрофизиологических параметров нейронов под влиянием ЛСС убедительно свидетельствуют об их существенно выраженной мембранотропной активности, возможной и, по-видимому, достаточно широкой терапевтической активности анксиолитической и противосудорожной направленности. Сходная дозозависимая и обратимая деполяризация под влиянием соединений 1, 2 и 3 на большинстве нейронов и усиление (повышение возбудимости и активация) электрической активности могут указывать на их активирующий эффект. Соединение 3 при этом оказалось более активным и, кроме того, на идентифицированном ППед1 нейроне - с противоположным - гиперполяризующим («успокаивающим») эффектом (со снижением возбудимости, урежением и прекращением импульсной активности). Таким образом, с удлинением молекул ЛСС их эффекты усиливаются. Деполяризация клеточных мембран может быть связана с подавлением электрогенной части в работе натрий-калиевого насоса и с изменениями пассивной проницаемости клеточных мембран к ионам натрия, кальция или калия при действии ЛСС, хотя неспецифические токи утечки мембраны изменялись незначительно [2-4]. Гиперполяризацию клеток при действии соединения 3 или после его действия можно объяснить усилением вклада в величину ПП электрогенной составляющей натрий-калиевого насоса, снижением пассивной проницаемости к ионам натрия и кальция или повышением ее к ионам калия [1-3]. Не исключается участие в этих процессах ионов хлора или каких-либо клеточных (мембранных) рецепторов. Кроме того, не исключается липидотропное действие ЛСС на мембраны, приводящее к увеличению их текучести - так называемое «разжижающее» действие. Это приводит к изменению их жидко-кристаллического состояния, возрастает подвижность молекул липидов и белков в ее липидном бислое. Известно, что изменения фазового состояния мембраны оказывают существенное влияние на процессы мембранного транспорта, на системы трансмембранной передачи информации, на активность мембраносвязанных ферментов [3, 5]. Могут изменяться нейромедиаторные процессы, функционирование ферментов и ионных каналов. Изменения суммарных ионных токов, параметров ПД и ИА нейронов под влиянием ЛСС обусловлены как соответствующими изменениями ПП, так и незначительным прямым влиянием на потенциалоуправляемые ионные каналы [2-6]. Поскольку ведущими в клеточных эффектах ЛСС являются изменения ПП, то для выяснения молекулярных механизмов их действия нами выполнены дополнительные эксперименты по изучению возможного участия в этом мембранных рецепторов (и в первую очередь основного тормозного ГАМК-рецептора). В наших прежних работах анализировались в основном натриевые, калиевые и кальциевые трансмембранные токи. В данной работе представлено влияние литийсодержащих соединений на хлорные каналы в исследовании с помощью метода «пэтч-кламп» на клетках глиомы крысы линии C6. В частности, в этих исследованиях было показано, что равновесный мембранный потенциал клеток глиомы крысы линии C6 на вторые сутки с момента культивирования лежит в диапазоне от -90 до -70 мВ. При активации (открывании) хлорных каналов мембранный потенциал сдвигается к равновесному потенциалу хлорных каналов, который составляет -55… -60 мВ. Тормозные нейромедиаторы ГАМК и глицин в концентрации 10 мкмоль/л достоверно меняли трансмембранный потенциал, способствуя активации (открыванию) хлорных каналов. При этом эффект глицина оказался более выраженным, чем у ГАМК, в то время как другой известный агонист глициновых рецепторов β-аланин вовсе не влиял на активность хлорных каналов. Подобную же направленность эффектов продемонстрировали и литиевые соли вышеозначенных тормозных аминокислот (соединения 1, 2 и 3). В целом их действие было однотипным в сравнении с эффектами глицина и ГАМК. Полученные данные свидетельствуют, что глицин, так же как и ГАМК, может влиять на активность хлорных каналов, то есть на функциональное состояние трансмембранного комплекса ГАМКА-рецептор/Cl--канал. Заключение Таким образом, можно сделать основной вывод, что ЛСС через изменения ПП модулируют электрическую активность и ионные токи нейронов моллюсков, а также влияют на активность хлорных каналов нейронов крыс. ЛСС оказывают как активирующее действие на электрическую активность нейронов моллюсков, так и угнетающее выраженное гиперполяризующее («тормозное») действие на отдельные нейроны (соединение 3). Молекулярные механизмы разнонаправленных клеточных эффектов ГАМК и глицина, с одной стороны, и ЛСС - с другой, с большой степенью вероятности можно объяснить вовлечением в их действие не только трансмембранного комплекса ГАМКА-рецептор/Cl--канал, но и других молекулярных мишеней, например NMDA-рецепторов, с блокадой которых может быть связано противосудорожное действие тормозных медиаторов и полученных на их основе литийсодержащих соединений.

About the authors

Petr Dmitrievich Shabanov

Institute of Experimental Medicine

Email: pdshabanov@mail.ru
Dr. Med. Sci. (Pharmacology), Professor

Anatoliy Ivanovich Vislobokov

First St. Petersburg State Medical University

Email: vislobokov@yandex.ru
Dr. Biol. Sci. (Physiology), Head, Dept. of Cytopharmacology

Georgiy Nolianovich Shilov

Belorussian State Medical Academy of Advanced Studies

Email: george_shilau@mail.ru
PhD (Neurology), Researcher

P M Bulay

Belorussian State University

Assistant Professor, Deptartment of Biophysics

A P Lugovskii

Belorussian State University

Assistant Professor, Deptartment of Biophysics

References