Tissue specific peculiarities of vibration-induced hypoxia of the rabbit heart, liver and kidney

Full Text

Введение Повторяющееся и накапливаемое на протяжении определенного времени воздействие вибрации вызывает развитие вибрационной болезни, которую относят к одной из ведущих профессиональных патологий как в России, так и в других индустриально развитых странах мира [44, 45, 49, 76, 80, 104]. Согласно клинико-эпидемиологическим данным, длительное воздействие вибрации является одним из факторов риска возникновения патологии сердечно-сосудистой системы, почек и органов желудочно-кишечного тракта [29, 66, 68, 76, 86]. Больные вибрационной болезнью в связи с повышенной активностью симпатоадреналовой системы [10, 93] имеют гиперкинетический тип центральной гемодинамики, сниженную сократительную способность миокарда в фазу подготовительного периода, признаки диастолической дисфункции левого и правого желудочков. Более чем у половины больных обнаруживаются признаки миокардиодистрофии и ремоделирования [65, 74, 79] миокарда и сосудов [69, 70], снижается физическая работоспособность, повышается кислородная стоимость единицы работы и кислородный долг миокарда [34, 45, 57, 71]. В экспериментальных работах показано, что вибрационное воздействие на изолированное сердце экспериментальных животных (собаки, кролики) формирует зоны ишемии [85], угнетает сократимость миокарда [14] и его ритмическую деятельность [77], снижает способность папиллярных мышц к релаксации [46]. В настоящее время не вызывает сомнения воздействие факторов профессионального труда на формирование патологии желудочно-кишечного тракта. В частности, доказано, что вибрация вызывает нарушение гликогенной, антитоксической, белковой и ферментативной функций печени у экспериментальных животных. Отмечено нарушение липидного обмена, ведущее к прогрессирующему увеличению числа жиросодержащих клеток печени, а также активности орнитинкарбомоилтрансферазы, холинэстеразы, щелочной фосфатазы. Угнетается гликогенобразовательная функция гепатоцитов, и изменяется характер распределения гликогена в клетках. Эти изменения зависят от амплитуды, частоты и продолжительности воздействия вибрации. Предполагается, что снижение запасов гликогена в печени отражает изменение уровня окислительных процессов в системе изоферментов цитохрома Р-450 [35]. Собственный ритм колебаний клеточных и субклеточных структур вступает во взаимодействие с механодеформирующими силами вибрации. Результирующие векторы оказывают независимое повреждающее воздействие на клетки, мембраны, органеллы [14, 46, 68, 77, 82, 85, 91], при этом максимально отрицательным эффектом обладает частота, резонансная частоте данной ткани или органа, материальной основой которого в биологических объектах являются масса и ее упругие свойства. Диапазон резонансных частот для тканей и органов теплокровных животных и человека находится в диапазоне от 1 до 200 Гц [43, 70]. Порождая гидродинамические силы, вибрация вызывает колебания центрального и периферического внутрисосудистого давления, изменяющие кровенаполнение, выброс миокарда, периферический крово- и лимфоотток из паренхиматозных органов. Наблюдаются значительные изменения ультраструктуры клеток мышечного слоя артерий, деградация нейрогуморальной регуляции их тонуса, перестройка базальных мембран сосудов, ведущая к уплотнению и разрастанию периваскулярной соединительной ткани, нарушения сосудисто-тромбоцитарного звена гомеостаза [40, 50]. Между вибрационно-опосредованными нейроэндокринными нарушениями [9], мембранопатиями, активацией системы перекисного окисления липидов, торможением антиокислительной системы и состоянием сосудов при вибрационной болезни существуют тесные взаимообратные связи, формирующие системные микроангиопатии, ведущие к капиллярно-трофической недостаточности тканей и органов. Таким образом, энергия колебания, порождаемая вибрацией, оказывает повреждающее воздействие на органы и ткани человека и животного, формирует дистрофические изменения [33, 43, 47, 66, 82, 85, 97] и отражается такими тканевыми биомаркерами, как протеогликаны, сульфатированные гликозаминогликаны [2, 36, 73, 87]. Ультраструктурными мишенями для воздействия вибрации являются все органеллы клетки, но наиболее чувствительны мембраны и митохондрии [95]. Вибрация вызывает набухание, просветление матрикса и реакцию крист митохондрий, разрушение наружных и внутренних мембран, изменение формы и появление большого количества мелких органелл, трансформируются межмитохондриальные взаимодействия [4]. Нарушение состояния клеток и мембран вследствие вибрационного воздействия оценивается как вибрационно-опосредованные цитопатии и мембранопатии и играет важную роль в патогенезе гипоксии при вибрационной болезни [95]. Фундаментальные исследования последних десятилетий показали, что митохондрии не только являются основным продуцентом энергетических эквивалентов в клетках, но и, выполняя важную регуляторную и объединяющую функцию, обеспечивают динамическое равновесие между различными путями метаболизма, участвуют в процессах апоптоза [23, 24]. В настоящее время митохондриальные дисфункции представляются одними из ведущих элементов в иерархии звеньев патогенеза многих заболеваний и патологических синдромов [22, 38, 55, 62, 75, 81, 89, 99]. Более того, митохондриальные дисфункции и биоэнергетическую гипоксию относят к типовым патологическим процессам [20, 39, 55, 59, 69, 81]. Известно, что основную адаптивную роль в условиях стрессирующих воздействий играет электронтранспортная функция сукцинатоксидазного пути окисления [60, 92]. Активация II фермент-субстратного комплекса при гипоксии неизменно сопровождается ростом содержания в тканях сукцината, являющегося специфическим лигандом метаботропного пуринергического G-белок-сопряженного рецептора из семейства P2Y, найденного в плазматической мембране GPR91 [100-103]. Стимулированная сукцинатом экспрессия данного типа рецепторов является составной частью компенсаторных реакций аэробного энергетического обмена при гипоксии более чем 20 тканей, обусловливая тканеспецифические особенности рецепторно-сигнальных функций [19, 41]. Несмотря на то что в ряде экспериментальных работ доказана вибрационно-опосредованная трансформация энергетического обмена [94-98], роль нарушения тканевой биоэнергетики в развитии вибрационно-обусловленных миокардиодистрофии и висцеропатий остается изученной недостаточно, поэтому для повышения эффективности профилактических и лечебных мероприятий [58, 67, 95] целью исследования явилось изучение тканеспецифических особенностей биоэнергетической гипоксии сердца, печени и почки кролика под влиянием вибрации в эксперименте. Материалы и методы Исследования проводили на кроликах-самцах весом 2,5-3 кг. Действие общей вертикальной вибрации с амплитудой 0,5 мм и частотой 8 и 44 Гц [69] моделировали на промышленной установке УВ 70/200. Сеанс воздействия длился по 60 мин ежедневно в течение 7, 21 и 56 дней в утренние часы (с 9 до 11). Контрольные и экспериментальные группы животных включали до 10 особей. После вскрытия грудной клетки и брюшной полости животного быстро извлекали сердце, печень, почку и помещали в среду выделения фиксированного состава, охлажденную до 0 °C. Для имитации состава внутриклеточной среды использовали апробированные в других исследованиях сложные солевые растворы [8, 94]. Кусочки верхушки сердца, коркового слоя почки, печени массой примерно 250-300 мг помещали в охлажденный стальной пресс с отверстиями 1 мм и продавливали в калиброванный гомогенизатор Даунса из кварцевого стекла с тефлоновым пестиком при соотношении «среда выделения» : «ткань» = 1 : 2, получая таким образом 30 %-й гомогенат ткани [8, 51]. С целью структурно-функциональной сохранности митохондрий исключали этап промывки, использовали высококонцентрированный гомогенат, а из среды выделения и инкубации исключали этилендиаминотетрауксусную кислоту (ЭДТА) [8, 52]. Изучение функциональных состояний нативных митохондрий [52] в составе гомогенатов проводили полярографическим методом [6, 52, 56] с помощью закрытого кислородного датчика гальванического типа в термостатируемой кювете объемом 1 мл при постоянном перемешивании в солевой среде инкубации, уравновешенной по газовому составу с воздухом при температуре 37 °C. В целях обеспечения синхронности измерений в сжатые сроки использовали неполный цикл метаболических состояний [16, 17] «эндогенное дыхание → покой → активность» [72]. Полярографическая измерительная установка в соответствии с требованиями метода состояла из электрода, ячейки с перемешивающим стержнем, термостатируемого кожуха, водяного термостата I ТЖ-0 03 (Россия), магнитной мешалки ММ-3 М (Россия), cамописца LKB Bromma 2210 2-Channel Reсorder (Швеция). Метаболические состояния митохондрий миокарда, печени и почки экспериментальных животных моделировали in vitro при окислении эндогенных субстратов (до и после введения ингибиторов разных звеньев дыхательной цепи), при варьировании экзогенных энергетических субстратов (до и после введения в ячейку 2,4-ДНФ) [6, 51-53, 72]. Скорость дыхания митохондрий (V) в зависимости от добавок в среду инкубации выражали в нг · атом О мин-1 мг-1 белка. После внесения в ячейку 100 мкл свежеприготовленного гомогената в течение 60 с записывали эндогенное дыхание (Vэ), скорость которого - интегральный кинетический показатель, характеризующий оснащенность систем энергопродукции ткани эндогенными энергетическими субстратами и откликающийся на воздействие внешних факторов, направленных на целостный организм [30, 37]. Для оценки динамики истощения совокупности эндогенных энергетических субстратов в ткани использовали «тест временной деградации митохондрий». Сопоставляли изменчивость Vэ на протяжении 60 мин хранения гомогената в аэробных условиях при комнатной температуре 18-20 °C. Каждые 20 мин отбирали пробы для измерения Vэ и соотносили значения с исходной скоростью, измеренной тотчас же после получения свежего гомогената. Вклад основных фракций дыхательной цепи (НАД- и ФАД-зависимых) в активность митохондрий оценивали посредством ингибиторного анализа [3, 63, 64]. Для этого в ячейку вводили либо ингибитор НАД · Н дегидрогеназы - амитал или ингибитор сукцинатдегидрогеназы (СДГ) - малонат до конечной концентрации в ячейке 2 мМ [94, 95]. Чувствительность Vэ к ингибиторам вычисляли по формуле «Инг. ч.» = (1 - Vинг / Vэнд) • 100 %, где «Инг. ч.» - чувствительность эндогенного дыхания к малонату (мал. ч.) или амиталу (ам. ч.); Vинг (Vам или Vмал) - скорость окисления эндогенных энергетических субстратов в присутствии соответствующего ингибитора в ячейке в концентрации 2 мМ. Введением в ячейку 5 мкл экзогенного субстрата митохондрии переводили в состояние субстратного дыхания (состояние «покоя»). В качестве НАД-зависимого субстрата использовали смесь глутамата и малата по 3 мМ, в качестве ФАД-зависимого субстрата - янтарнокислый натрий - до 1 мМ [37, 53, 63, 64]. Скорость субстратного дыхания (Vяк и Vглу + мал) в митохондриях тканей интактных животных, как правило, выше, чем эндогенного, и зависит от проницаемости мембран, способности ферментного комплекса окислять данный субстрат и готовности последующих участков дыхательной цепи транспортировать электроны к кислороду [72]. Экзогенные энергетические субстраты способны стимулировать ту фракцию дыхательной цепи, через которую транспортируются электроны после его окисления [63, 64, 72]. Прием стимуляции эндогенного дыхания экзогенным субстратом используется для оценки перехода митохондрий в метаболическое состояние «покоя» [8]. Количественно это можно выразить в виде коэффициентов стимуляции (КСяк и КСглу + мал). Энергезирующее действие экзогенных субстратов создает «мягкие» условия инкубации гомогената. Отсутствие стимуляции указывает на регуляторное угнетение или отключение, а возможно, на повреждение соответствующего звена дыхательной цепи [8]. Через 60 с субстратного дыхания в ячейку вводили разобщитель окисления-фосфорилирования 2,4-ДНФ [8, 72] до общепринятой разобщающей концентрации 20 мкМ. Протонофор 2,4-ДНФ ликвидирует электрохимический потенциал мембраны, что нарушает синтез АТФ и его регулирующее влияние в пунктах сопряжения дыхания с фосфорилированием [7]. Вследствие этого скорость окисления субстратов (Vяк. р, Vглу + мал. р) возрастает. 2,4-ДНФ одинаково разобщает все точки сопряжения в дыхательной цепи, увеличивает уровень АДФ, снижает содержание АТФ за счет активизации АТФазы. При этом in vitro создается высокая функциональная нагрузка на ДЦ, что обеспечивает «активное» состояние митохондрий [72]. Величина протонной проводимости мембран в митохондриях во многом определяет их биоэнергетические характеристики [72]. Дыхательная цепь отвечает на введение разобщителя резким увеличением протонной проницаемости (и дыхания), аналогично тому, что происходит при синтезе АТФ. Однако при этом нет возврата митохондрий в состояние «отдыха» после классического перехода всей добавки АДФ в АТФ [16, 17], то есть к термодинамическому равновесию, когда выброс протонов дыхательной цепью автоматически уравновешен их медленной утечкой через сопрягающую мембрану. В разобщенном состоянии скорость дыхания определяется кинетическими свойствами дыхательной цепи. При этом дыхание становится неконтролируемым [8, 72]. Исходя из этих данных можно косвенно оценить уровень энергетической регуляции дыхания в нативных митохондриях без АДФ по стимуляции субстратного дыхания разобщителем [72]. Стимуляция субстратного дыхания разобщителем 2,4-ДНФ тем выше, чем прочнее сопряженность окислительного фосфорилирования; чем эффективнее регуляция процессов окисления и преобразования энергии в дыхательной цепи в различные формы [7, 8]. В условиях сохранности I ФСК (НАД-зависимого звена) дыхательной цепи, в ответ на внесение в полярографическую ячейку композиции глутамат + малат и 2,4-ДНФ, наблюдается увеличение КСглу + мал и/или КРглу + мал. Если основной НАД-зависимый путь подавлен или разобщен, то эти показатели снизятся. Об активизации системы окисления янтарной кислоты - пути окисления (ФАД-зависимого звена) - будет свидетельствовать увеличение КСяк и КРяк, а снижение этих показателей (по отношению к интактным животным) укажет либо на регуляторное ограничение активности сукцинатзависимой энергетики или торможение вследствие развития низкоэнергетического сдвига [51-53]. На исходно разобщенных или слабосопряженных (низкоэнергетичных) препаратах митохондрий стимулирующее действие 2,4-ДНФ не только не проявится, а может сменяться торможением дыхания. Вероятно, это происходит вследствие «разрыхления» структурно-функциональной организации ДЦ и глубоких нарушений процессов переноса электронов, синтеза АТФ и других видов трансформации энергии. В частности, величина КРс ≤ 1,0 интерпретировалась как уменьшение сопряженности окислительного фосфорилирования и развитие низкоэнергетического сдвига [72]. Параметры Vэ, Vяк, Vглу + мал, Vяк. р, Vглу + мал. р относили к кинетическим, призванным комплексно характеризовать стационарные метаболические состояния митохондрий тканей. Терминами «состояние активности», «активное метаболическое состояние», «разобщенное» или «состояние в условиях АТФазной нагрузки» обозначали состояние митохондрий на фоне введения 2,4-ДНФ. Оценивали динамику соотношения парциальных реакций эндогенного дыхания, характеризующих изменчивость основных потоков электронов при окислении НАД- и ФАД-зависимых субстратов в ферментных комплексах соответствующих фракций дыхательной цепи как отклик на воздействие in vivo неблагоприятного фактора. Для этого в доступных для нашего исследования метаболических состояниях митохондрий дополнительно ввели «регуляторные» коэффициенты приращения субстратного дыхания (КП) в состоянии покоя (п) и разобщения (р): 1) КПэ = [ФАД / НАД]э = мал. ч. / ам. ч.; 2) КПп = [ФАД / НАД]п = Vяк / Vглу + мал; 3) КПр = [ФАД / НАД]р = Vяк. р / Vглу + мал. р, где мал. ч. и ам. ч. - доли малонат- и амиталчувствительного эндогенного дыхания; Vяк и Vглу + мал - скорости окисления экзогенного сукцината и смеси глутамата и малата в состоянии «покоя»; Vяк. р и Vглу + мал. р - скорости окисления субстратов в «активном» состоянии митохондрий в условиях АТФазной нагрузки, моделируемой с помощью разобщителя 2,4-ДНФ [3, 63, 64]. Способность митохондрий переходить из одного метаболического состояния в другое определяется полноценностью соответствующих регулирующих механизмов и может быть оценена по отношению скоростей дыхания в момент перехода [17]. Параметры-отклики позволяют дифференцировать экспериментальные группы по переходным состояниям митохондрий, полученных из тканей животных, подвергнутых разным тестирующим воздействиям. Под действием экзогенного субстрата митохондрии, окисляющие на данный момент эндогенные субстраты, переходят в состояние субстратного дыхания, дополнительно активизируя дегидрогеназу, соответствующую добавленному экзогенному субстрату [61]. Точка перехода из одного состояния в другое информативна и является функцией отклика, позволяющей фиксировать различия между экспериментальными группами [72, 97]. Для характеристики митохондрий в переходных состояниях использовали коэффициенты стимуляции дыхания субстратом (КСс) и разобщителем (КР). Введение показателей типа КС и КР позволило количественно оценивать in vitro регулирующее действие экзогенного субстрата (ФАД-, НАД-зависимых) или разобщающее действие 2,4-ДНФ как отражение общей сопряженности препарата [7, 8, 63, 64]. В последнем случае исходили из того, что чем выше КР, тем сопряженнее окисление-фофорилирование в митохондриях [7, 8]. «Регуляторные» параметры характеризуют митохондрии в переходных состояниях (из состояния эндогенного дыхания в состояние субстратного или «покоя»; из состояния «покоя» в состояние «активности»). Коэффициенты КСяк, КСглу + мал, КРглу + мал, КРяк вычисляли по формулам КСс = Vс / Vэ, КРс = Vс. р / Vс, где КСс - стимуляция эндогенного дыхания после введения в ячейку экзогенного субстрата (с); Vс - скорость дыхания митохондрий после добавления в ячейку экзогенного субстрата (ЯК или Глу + Мал); Vэ - скорость окисления эндогенных субстратов; КРс - стимуляция субстратного дыхания 2,4-ДНФ; Vс. р - скорость окисления экзогенного субстрата после добавления 2,4-ДНФ. Коэффициенты КСс и КРс выражали в относительных единицах измерения. При содержательной интерпретации данных исходили из критерия оптимального уровня энергетической и субстратной регуляции митохондрий. За него принимали значения переходных параметров, приближенные к таковым у интактных животных, у которых уровень регуляции характеризовался наибольшим приростом скоростей в «активном» и разобщенном состоянии. Концентрацию белка в гомогенате измеряли модифицированным микробиуретовым экспресс-методом по J. Goa [32], который обладает высокой специфичностью, чувствительностью, не зависит от аминокислотного состава белка и характеризуется линейной связью между концентрацией белка и интенсивностью окраски проб в широком диапазоне концентраций. В наших экспериментах содержание белка в ячейке после добавления гомогенатов тканей составляло 2,4 ± 0,5 мг. После забоя животных, их вскрытия и изъятия тканей для анализа биоэнергетических процессов иссекали кусочек мышцы миокарда левого желудочка в области верхушки, кусочки печени, коркового слоя почки и помещали в 10 % нейтральный раствор формалина (соотношение «ткань» : «раствор» = 1 : 10). Дальнейшая обработка материала проводилась стандартно методом спиртово-парафиновой проводки в гистологической лаборатории. Окраска гистологических препаратов осуществлялась гематоксилином и эозином. Статистическую обработку полученных результатов проводили с применением комплекса статистических программ Exсel-2002, STATISTICA 6,0 с расчетом средней и ошибки средней арифметической (М ± m) и 95 % доверительного интервала. Статистическую значимость межгрупповых различий оценивали с помощью параметрического (t-критерия Стьюдента) и непараметрического (Манна-Уилки- U-теста) в зависимости от типа распределения параметра, которое проверяли по тесту Колмогорова-Смирнова, Шапиро-Уилка и Лиллиефорса в модуле Basic Statistics/Tables. Результаты исследования Энергетические возможности органов с импульсным характером функционирования (сердце, мышцы) отличаются от органов с постоянным уровнем фунциональной активности (печень, мозг) [1, 11, 12, 54]. Интенсивность окисления митохондриями эндогенных субстратов определяется тканевой принадлежностью, в частности, в наших исследованиях эндогенное дыхание в почке контрольных животных оказалось на 60 % выше, чем в митохондриях ткани печени (табл. 1) [97]. В экспериментах для митохондрий миокарда (табл. 2) интактных контрольных животных получены показатели градаций метаболических состояний, согласующиеся с литературными данными [37]. Параметры эндогенного дыхания митохондрий печени и почки кролика подвергались изменениям на фоне вибрации 44 Гц различной длительности (см. табл. 1). Например, в процессе кумуляции эффектов вибрации на уровне ткани почки через 7 сеансов наблюдали ускорение окисления эндогенных субстратов на 24 %, через 21 сеанс - на 42 % (р < 0,01), к завершению вибрации показатель возвращался к уровню интактного контроля, свидетельствуя о сохранности резерва эндогенных энергетических субстратов и большей устойчивости к воздействию вибрации эндогенного дыхания почки по сравнению с аналогичным показателем печени. Процессы окисления эндогенных энергетических субстратов нативными митохондриями сердца кроликов in situ и его чувствительность к ингибиторам изменялись в зависимости от количества сеансов и частоты общей вибрации, действующей на целостный организм (табл. 3). Значения параметров скорости эндогенного дыхания, чувствительности к малонату или амиталу соответствовали тесту на нормальность распределения по критериям Лиллиефорса и Шапиро-Уилка (p > 0,05), что позволило использовать дисперсионный анализ для множественных сравнений и количественной оценки влияния факторов вибрации на параметры-отклики. Степень и значимость влияния независимых факторов общей вибрации - частоты (А), длительности, как и общего количества ежедневных сеансов общей вибрации (В) и их взаимодействия (А · В), оценивали по матрице полного факторного эксперимента. В качестве параметров-откликов, количественно характеризующих влияние факторов А и В на систему энергопродукции сердца, рассматривали показатели Vэнд, мал. ч. и ам. ч. Факторы варьировали на трех уровнях. Уровни фактора А (q = 3): А1 - отсутствие вибрации, А2 - общая вибрация 8 Гц, А3 - общая вибрация 44 Гц. Уровни фактора В (p = 3): В1 - 7 сеансов общей вибрации, В2 - 21 сеанс, В3 - 56 сеансов. Число опытных точек по дизайну полного факторного эксперимента составило p · q = 9. На каждом сочетании факторов наблюдали по 5 животных (n = 5). По матрице полного факторного эксперимента проведено N = p · q · n = 45 опытов. Характер изменений показателя Vэ митохондрий отличался по своей направленности на разных уровнях сочетаний факторов частоты (А), длительности вибрации (В). На средней частоте вибрации через 56 сеансов значение этого показателя увеличивалось на 43,5 %, тогда как на высокой - к 7-21-му дню наблюдали увеличение на 38-58,8 %. Между контролем и группами животных, подвергнутых вибрации с различной частотой и длительностью воздействия (А2-В1, А2-В2 и А3-В3), различия скорости эндогенного дыхания митохондрий не проявились. Однако это не свидетельствовало об идентичности процессов эндогенного дыхания нативных митохондрий сердца кроликов при исследованных сочетаниях факторов, поскольку по данным теста «переживания ткани» и ингибиторного анализа препараты оказались дифференцированными. Показатель Vэ митохондрий миокарда контрольных животных в тесте «переживания ткани» не менялся, но при градациях факторов А2-В1, А2-В2 и А3-В3 он достоверно уменьшался на 30-50 %. Если у митохондрий in situ при действии вибрации происходило увеличение Vэ, то по тесту «переживания ткани» они демонстрировали большую устойчивость. Значимость различий (р) средних значений параметров эндогенного дыхания митохондрий миокарда кроликов на разных уровнях варьирования факторов вибрации (А-В) по критерию множественного сравнения LSD: для Vэнд - А1 и А2-В3 р = 0,0147, А1 и А3-В1 р = 0,046, А1 и А3-В2 р = 0,007, А2-В3 и А2-В1 р = 0,025, А3-В2 и А2-В2 р = 0,0136, А3-В2 и А2-В1 р = 0,0186, А3-В2 и А3-В3 р = 0,006; для мал. ч. - А1 и А2-В1 р = 0,000 …, А1 и А2-В2 р = 0,022, А1 и А2-В3 р = 0,001, А1 и А3-В1 р = 0,0002, А1 и А3-В2 р = 0,023, А2-В1 и А2-В2 р = 0,001, А2-В1 и А2-В3 р = 0,023, А2-В1 и А3-В1 р = 0,048, А2-В1 и А3-В2 р = 0,000…, А2-В1 и А3-В3 р = 0,000…, А2-В2 и А3-В2 р = 0,000…, А2-В2 и А3-В3 р = 0,000…, А2-В3 и А3-В2 р = 0,000…, А2-В3 и А3-В3 р = 0,000…; для ам. ч. - А2-В1 и А2-В3 р = 0,039, А3-В2 и А2-В2 р = 0,049, А3-В2 и А2-В3 р = 0,023, А3-В2 р = 0,039, А3-В3 и А2-В2 р = 0,048, А3-В3 и А2-В3 р = 0,021, А3-В3 и А3-В1 р = 0,037; содержание белка в ячейке - 2,4 (0,4) мг/мл. Согласно ингибиторному анализу на уровнях градаций факторов А (частота в Гц) и В (количество сеансов) чувствительность эндогенного дыхания митохондрий сердца к малонату и амиталу значительно менялась по сравнению с контролем. Малонатчувствительное дыхание увеличивалось через 7 сеансов вибрации, и в дальнейшем на обеих частотах возрастало. Изменчивость амиталчувствительности при варьировании факторов вибрации носила менее определенный характер. При всех сочетаниях уровней факторов вибрации (кроме А1 и А2-В1) чувствительность Vэ к малонату превышала чувствительность к амиталу (согласно значениям отношения мал. ч./ам. ч.). Уменьшенные соотношения мал. ч./ам. ч. на 7-й сеанс вибрации проявились на обеих частотах. На частоте 8 Гц оно оказалось весьма значительным и сопряженным со снижением Vэ в тесте «переживания ткани». Для определения весомости параметров отклика и дальнейшего обоснования интегральной характеристики состояния системы энергопродукции сердца в условиях воздействия вибрации необходимо было количественно оценить ответ исследуемых выходных параметров тканевой биоэнергетики (Vэ, мал. ч. и ам. ч.) миокарда на факторы вибрации с точки зрения их информативности и значимости. Согласно результатам дисперсионного анализа по одной из его разновидностей - матрице полного факторного эксперимента (табл. 4), в величине, значимости и информативности эффектов исследованных факторов вибрации по совокупности их действия на параметры-отклики биоэнергетики миокарда выявились существенные отличия. В отношении показателей Vэ и мал. ч. значимыми (p ≤ 0,05) оказались эффекты контролируемых факторов, то есть частоты вибрации и количества сеансов (А и В) и эффекты их взаимодействия А · В. Они обусловили большую часть дисперсии. В обоих случаях весомыми и достоверными оказались вклады частоты вибрации (фактор А) и количество ее сеансов (фактор В). Количественно это выразилось в том, что влияние совокупности контролируемых факторов на изменчивость дисперсии Vэ и малонатчувствительности оказалось на уровне 52,8 и 78,5 % соответственно и превысило вклад случайных факторов. В противоположность этому на дисперсию показателя амиталчувствительности достоверно влияло только сочетание факторов А · В вибрации, тогда как вклад случайных факторов более чем в 2 раза превышал вклад контролируемых. На основании полученных данных были построены линейные модели прогноза параметров-откликов в виде уравнений с разной степенью адекватности: Vэ = 18,72 + 0,142 А; Мал. ч. = 35,23 + 0,227 А + 0,268 В; Ам. ч. = 32,57 + 0,197 А - 0,01 В. Коэффициенты регрессии для Vэ и малонатчувствительности оказались статистически значимыми (р ≤ 0,0057), в отличие от амиталчувствительности (р > 0,188). Уравнение прогноза по линейной модели скорости эндогенного дыхания достоверно зависело от частоты общей вибрации, а его чувствительность к малонату - как от частоты, так и от длительности. Моделирование градаций метаболических состояний митохондрий [16] с помощью экзогенных субстратов окисления и разобщителя (см. табл. 4) подтвердило преимущественную активацию сукцинатзависимой энергетики тканей в условиях пролонгации вибрационного воздействия и позволило соотнести их с этапами биоэнергетической гипоксии [59, 60, 94, 95]. В митохондриях миокарда скорости окисления композиции глутамата и малата в состоянии «покоя» и «активности» независимо от длительности вибрации были ниже, чем скорости окисления янтарной кислоты. Падение Vглу + мал через 56 сеансов составило 43 % (р ≤ 0,05). Динамика окисления НАД-зависимых субстратов в «активном» метаболическом состоянии характеризовалась депрессией значений: через 21 сеанс - на 21 % (р ≤ 0,05), а через 56 сеансов - на 30 % (р ≤ 0,01). При 44 Гц Vяк достигла максимума к 21-му сеансу, возрастая на 77 % (р ≤ 0,05), и снизилась к 56-му сеансу, тем не менее оставаясь выше показателей интактных животных на 38,5 % (р ≤ 0,05). Результирующую наиболее значимого (p ≤ 0,05) и весомого влияния (по величине К, %, помеченной в таблице 5 жирным шрифтом) совокупности контролируемых факторов общей вибрации на изменчивость параметров-откликов наблюдали со стороны эндогенного дыхания и окисления глутамата и малата в состоянии покоя (Vглу + мал) и максимальной функциональной нагрузки на дыхательную цепь (Vглу + мал. р). Вариабельность откликов (по совокупности межгрупповых различий) после добавки сукцината к нативным митохондриям кардиомиоцитов in vitro в состоянии «покоя» и «активности» оказалась менее выраженной. Обобщенный результат дисперсионного анализа явился отражением способности экзогенной янтарной кислоты оказывать мощное энергизирующее действие на митохондрии и тем самым «поглощать» часть изменчивости, обусловленной вибрацией. Можно предположить также, что регулирующее действие данного субстрата проявлялось in vitro таким образом, что его следует интерпретировать не как «шум» из-за неучтенных (случайных) условий эксперимента, а как частичное нивелирование экзогенным субстратом дизрегуляционных эффектов вибрации на уровне функционирования систем энергопродукции миокарда. Возможно еще одно объяснение: нелинейность зависимости выходных эффектов от входных факторов и их сочетаний. В печени на фоне угнетения окисления экзогенных НАД-зависимых субстратов в состоянии «покоя» скорость метаболизма экзогенной янтарной кислоты возрастает на 44 % (р ≤ 0,05) после 21 сеанса вибрации 44 Гц и угнетается по мере пролонгации воздействия. В состоянии «активности» митохондрий печени окисление янтарной кислоты на фоне высокочастотной вибрации превосходит темпы окисления данного субстрата на фоне вибрации 8 Гц в два раза (р ≤ 0,01) через 21 сеанс. Однако к 56-му сеансу показатель Vяк. р начинает снижаться. Стимулирующее действие экзогенной янтарной кислоты на дыхание митохондрий почки при воздействии вибрации 44 Гц (Vяк) практически отсутствовало. Депрессия показателя на фоне вибрации 44 Гц колебалась на уровне 59-22-17 % в сроки 7-21-56 сеансов соответственно. В активном состоянии митохондрии почки, так же как митохондрии сердца и печени, окисляли экзогенную янтарную кислоту более интенсивно, чем НАД-зависимые субстраты. На фоне вибрации наблюдался подъем Vяк. р на 40 % относительно интактного контроля, сохраняющийся к завершению вибрационного воздействия. В ткани миокарда через 7 сеансов вибрации КПмал. ч возрастал в 1,5 раза (р ≤ 0,05) по сравнению с показателем интактной контрольной группы (табл. 5); через 21 сеанс - в 1,8 раза (р ≤ 0,05), оставаясь без существенных изменений к 56-му сеансу. В ткани печени также увеличивалась чувствительность к малонату на 20 %, свидетельствуя о накоплении эндогенной янтарной кислоты и увеличении ее вклада в процессы окисления. Однако после 56 сеансов вибрации КПмал. ч снижался на 40 % (р < 0,01), ниже уровня контроля, отражая начавшиеся процессы повреждения в ФАД-зависимом звене дыхательной цепи и истощение механизмов адаптивных перестроек, реализуемых прежде всего через активизацию сукцинатдегидрогеназной биоэнергетики [30, 94]. Динамика показателя КПмал. ч почки была аналогичной. Для всех изучаемых тканей выявлено, что по мере накопления эффектов вибрации происходило угнетение окисления НАД-зависимых субстратов митохондрий. Активизация (печень, почка) и даже гиперактивация сукцинатзависимой энергопродукции кардиомиоцитов приводили к феномену «разрыхления» дыхательной цепи [51-53], нарушению ее электронтранспортной функции и началу биоэнергетической гипоксии [59, 60]. Соотношение активности ФАД- и НАД-зависимых оксидаз митохондрий тканей иллюстрирует наибольшую чувствительность к вибрационному воздействию ткани миокарда (табл. 6). Сукцинатдегидрогеназная активность митохондрий миокарда после 7-21 сеанса имела незначительные различия с показателем интактного контроля, однако через 56 сеансов наблюдался существенный подъем стимулирующего эффекта сукцината на 66 % (р ≤ 0,01), нашедший отражение в коэффициенте стимуляции КСяк. Стимулирующее действие 2,4-ДНФ на сукцинатное дыхание практически не зависело от количества сеансов. В этом случае отклик на вибрационное воздействие сводился к достоверному смещению всех значений КРяк в диапазоне на 10-30 % ниже по сравнению с показателями интактных животных. Тормозящего влияния 2,4-ДНФ на сукцинатное дыхание не наблюдали, показатель КРяк оставался ≤ 1,0. Регулирующая роль НАД-зависимых субстратов была слабо выражена, что свидетельствовало о снижении активности этого участка дыхательной цепи и уменьшении его вклада в энергообеспечение ответной реакции миокарда на вибрацию, тогда как роль ФАД-зависимых субстратов возрастала по мере суммации эффектов вибрации и в наибольшей мере проявилась в состоянии «покоя» через 56 сеансов, о чем свидетельствует значение КСяк > 3,5. Однако снижение КРяк к уровню 1,0 ± 0,1 ед. подчеркивает диссонанс между показателями переходных состояний митохондрий, подчиняющийся формуле «КС растет, а КР падает», выявляя тенденции к гиперактивации [63] системы окисления янтарной кислоты с признаками «истощения». В печени коэффициенты КСглу + мал и КРглу + мал в ответ на вибрационное воздействие угнетаются. Исчезает стимулирующее действие разобщителя (КРглу + мал → 1,0). Это, вероятно, происходит по причине «разрыхления» структурно-функциональной организации дыхательной цепи на данном участке и нарушения процессов переноса электронов. Следствием этого является нарушение трансформации энергии в различные формы (АТФ, Г ТФ, ∆µ H, ∆µ ψ и др.) [1, 7, 11, 12] и развитие низкоэнергетического сдвига или биоэнергетической гипоксии. В почке на фоне вибрации также отсутствовало активизирующее воздействие экзогенных НАД-зависимых субстратов, что свидетельствует о нарушениях в зоне первого фермент-субстратного комплекса дыхательной цепи. Напротив, стимуляция дыхания в системе окисления янтарной кислоты более выраженна и аналогична картине, которая описана для печени. Коэффициент КРглу + мал. р падает ниже уровня контроля на 66-20 % (р ≤ 0,05) и достигает значения, близкого к 1,0. Это свидетельствует об отсутствии стимулирующего действия 2,4-ДНФ и коррелирует с утратой сопряженности между окислением и фосфорилированием и, следовательно, с уровнем энергетической регуляции дыхания в зоне НАД-зависимого звена дыхательной цепи. Картина глубоких изменений усугубляется тем, что стехеометрически на НАД-зависимом участке дыхательной цепи митохондрий в физиологических условиях функционируют 3-4 пункта сопряжения и теоретически эффективность окислительного фосфорилирования в 1,5-2 раза выше, чем на ФАД-зависимом участке [8]. При окислении янтарной кислоты в митохондриях почки стимулирующее действие 2,4-ДНФ проявилось неоднозначно, коэффициент КСяк. р монотонно и недостоверно превосходил показатель интактного контроля на 14-30 %. Таким образом, дыхательная цепь почки откликается на изменения режимов вибрации перестройками окислительного метаболизма, так же как в миокарде и печени развивалась митохондриальная дисфункция по типу биоэнергетической гипоксии I-II стадии. Морфологически в сердце (рис. 1, А, Б) по мере накопления количества сеансов общей вибрации наблюдалось нарастание набухания клеток кардиомиоцитов и их ядер с дистрофическими изменениями. Выявлялись признаки гипертрофии, увеличение зон дистрофии и их распространение от субэндокардиальных в интрамуральные отделы, нарастание стромально-клеточной реакции и полнокровия сосудов сердечной мышцы. В интерстиции миокарда увеличивалась популяция клеток лимфоцитарного и гистиоцитарного типа строения. На фоне развивающейся гипертрофии кардиомиоцитов накапливались очаги некроза и разрушения стромальных элементов. Микроангиопатии проявлялись отеком стенок сосудов, их спазмом, разрежением артериолярной и капиллярной сети. Изменения в системе микроциркуляции, очевидно, явились одной из предпосылок, ведущих к ишем

About the authors

Viktoriya V Vorobieva

North-western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Email: v.v.vorobeva@mail.ru
Doctor of Med. Sci. (Pharmacology), head of department of pharmacology

Petr D Shabanov

S.M. Kirov Military Medical Academy

Email: pdshabanov@mail.ru
Professor, Head, Dept. of Pharmacology

References