Study of the effects of kisspeptin analogs on the behavior of  Danio rerio

Vladanka A. Goltz; Гольц  Владанка  Александровна; Andrey A. Lebedev; Лебедев Андрей Андреевич; Aleksandra  A. Blazhenko; Блаженко Александра  Александровна; Viktor  A. Lebedev; Лебедев Виктор  Андреевич; Sergei  V. Kazakov; Казаков Сергей  Владимирович; Alikber  A. Bayramov; Байрамов  Аликбер  Азизович; Platon P. Khokhlov; Хохлов  Платон  Платонович; Eugenii  R. Bychkov; Бычков Евгений  Рудольфович; Sarng  S. Pyurveev; Пюрвеев  Сарнг  Саналович; Petr D. Shabanov; Шабанов Петр  Дмитриевич

doi:10.17816/RCF321976

Study of the effects of kisspeptin analogs on the behavior of Danio rerio

Authors: Goltz V.A.¹, Lebedev A.A.¹, Blazhenko A.A.¹, Lebedev V.A.¹, Kazakov S.V.¹, Bayramov A.A.², Khokhlov P.P.¹, Bychkov E.R.¹, Pyurveev S.S.¹, Shabanov P.D.¹
Affiliations:
1. Institute of Experimental Medicine
2. Almazov National Medical Research Centre
Issue: Vol 21, No 2 (2023)
Pages: 159-169
Section: Original articles
URL: https://journals.eco-vector.com/RCF/article/view/321976
DOI: https://doi.org/10.17816/RCF321976
ID: 321976

Cite item

Full Text

Open Access
Restricted Access

Access granted
Restricted Access

Subscription or Fee Access

Abstract
Full Text
About the authors
References
Statistics

Abstract

BACKGROUND: This study aims to analyze the behavioral effects of mammalian Kiss1 kisspeptin analogs, Clone (USA): KS4, KS5, KS6, KS7, KS8, KS9, and Kiss10, on Danio rerio (zebrafish). The peptides have structural variations in the final four amino acids.

MATERIALS AND METHODS: Kisspeptins were dissolved in aquarium water and administered in two doses: 1) 0.01 mg per 1000 ml of water, and 2) 0.1 mg per 1000 ml of water. Phenazepam, an anxiolytic, was also dissolved in water and used in three doses: 1) 0.1 mg per 1000 ml, 2) 0.5 mg per 1000 ml, and 3) 1 mg per 1000 ml. The study compared kisspeptines with anxiolytics using phenazepam as an example in the novelty test. The fish’s response to novelty in the viewing tank was assessed, including diving to the bottom, increased freezing, and decreased movement in the upper half of the tank. Fish residence time in the lower part of the tank after phenazepam administration decreased, especially at a dose of 0.5 and 1 mg/l.

RESULTS: Kisspeptin analogues decreased the indices characterizing the anxious state of the fish. Against the background of Kiss1 kisspeptin analogues, the average fish path length differed significantly in contrast to the effects of phenazepam. KS4 at a dose of 0.1 mg/l showed a 1.4-fold decrease in the number of freezing, in the freezing time, in the trajectory length and 1.5-fold increase in the number of transitions to the upper part of the tank. The dose of 0.01 mg/l decreased the number of freezing, freezing time, and trajectory length by 1,5-3 times. KS5 at a dose of 0.1 mg/l decreased the number of freezing, the freezing time, the trajectory length and the number of transitions to the upper part of the tank by 1.2–1.6 times. The dose of 0.01 mg/l decreased the number of freezing, freezing time, trajectory length by 2.8–3 times. KS6 at a dose of 0.1 mg/l decreased the number of freezing, the freezing time, and the trajectory length by 2–2.5 times. The number of transitions to the upper part of the aquarium increased 2.5 times. The dose of 0.01 mg/ml decreased the number of freezing, freezing time, and trajectory length by 1.7–2.2 times. KS7 at a dose of 0.1 mg/l decreased the number of freezing, freezing time, and trajectory length by 1.3–2 times. The number of movements to the top of the aquarium increased 1.6-fold. The dose of 0.01 mg/l decreased the number of freezing, freezing time, trajectory length by 1.6 times. KS8 at a dose of 0.1 mg/l decreased the number of freezing, the freezing time, and the trajectory length by 1.6 times. The dose of 0.01 mg/l decreased the number of freezing, the freezing time, and the trajectory length by 1.8–2.3 times. KS9 at a dose of 0.1 mg/l decreased the number of freezing, the freezing time, and the trajectory length by 1.2–2 times. The dose of 0.01 mg/l reduced the number of freezing, the freezing time, and the trajectory length by 1.6 times. In Kiss10 at a dose of 0.1 mg/l, there was a 1.4–1.6-fold decrease in the number of freezing, in freezing time, and in trajectory length. There was a 2.7-fold increase in the transitions to the upper part of the aquarium. The dose of 0.01 mg/l decreased the number of freezing, freezing time, and trajectory length by 1.3–1.7 times. We observed a 1.3-fold increase in the number of trajectories. Summarizing the obtained indicators, we came to the conclusion that kisspeptin analogues were not inferior in their effect to the effects obtained after taking the tranquilizer phenazepam. Among mammalian kisspeptin analogues, KS6 at a dose of 0.1 mg/L showed the best performance.

CONCLUSIONS: The study concludes that mammalian Kiss1 kisspeptin analogs and Kiss10 reduce anxiety-phobic reactions to novelty in Danio rerio. The effects of the studied kisspeptin analogs are lower than those of phenazepam. Kisspeptin is involved not only in the modulation of serotonin-dependent behavior in Danio rerio but also in the GABA-ergic system, resembling benzodiazepine-type tranquilizers. The results support the hypothesis that kisspeptin may be involved in the regulation of anxiety-phobic states, likely playing a role in maintaining the emotional aspects of reproductive behavior, such as sexual motivation and arousal.

Keywords

Danio rerio, kisspeptins, anxiety, fear, tranquilizers, phenazepam

Full Text

АКТУАЛЬНОСТЬ

Кисспептин (ранее известный как метастин) — это белок, который кодируется геном KISS1, расположенным в локусе 1q32. Данный нейропептид представляет собой последовательность из 145 аминокислот, от которого под воздействием протеолитических ферментов отщепляется кисспептин 54 (Кп-54). Протеолитическое расщепление этого пептида из 54 аминокислот приводит к образованию более коротких биологически активных продуктов, обозначаемых кисспептином-14 (Кп-14), кисспептином-13 (Кп-13) и кисспептином-10 (Кп-10) [1]. Кисспептины млекопитающих относятся к классу амидных пептидов RF семейства, поскольку они имеют характерный консервативный карбоксильный конец Arg-Phe-NH₂ [2]. Кисспептин ассоциирован с белком G, что обеспечивает активацию всеми биологическими продуктами гена Kiss1. Рецептор Gpr54 в 2001 г. был обозначен рецептором кисспептина-1 (KISS1R) [3]. KISS1R состоит из 398 аминокислот и относится к семейству родопсиновых рецепторов, сопряженных с G-протеинами 7 трансмембранными доменами. Установлено, что взаимодействие кисспептина с рецептором приводит к внутриклеточной активации фосфолипазы С и вторичных мессенджеров, приводящих к высвобождению кальция и протеинкиназы С, реализующих функции пептида [4, 5]. Впервые был обнаружен в мозге крыс как орфанный рецептор, имевший 40 % сходства с галаниновыми рецепторами [6].

Кисспептин экспрессируется в нескольких областях центральной нервной системы крыс, включая ядра гипоталамуса (например, дугообразное ядро, передне-вентральное паравентрикулярное ядро — AVPV, ядра таламуса, миндалину, гиппокамп, латеральную перегородку, ядро ложа терминальной полоски, полосатое тело, прилежащее ядро — NAc, периакведуктальное серое и locus coeruleus) [7, 8]. Аналогично Kiss1r был локализован у крыс в гипоталамусе (например, паравентрикулярном, дугообразном и супраоптическом ядре), таламусе, гиппокампе, миндалине, перегородке, полосатом теле, ядрах рафов и коре головного мозга [6, 9]. Помимо видов млекопитающих система кисспептина также обнаружена у позвоночных, не относящихся к млекопитающим. Действительно, в 2004 г. ортолог рецептора кисспептина (Kiss2r) был впервые выделен у вида костистых (нильская тилапия), что дало первоначальные доказательства наличия кисспептиновой системы у рыб [10]. В отличие от грызунов и людей у многих видов рыб было идентифицировано более одной формы кисспептина и парологов рецепторов кисспептина. Например, рыбки данио обладают двумя генами кисспептина (Kiss1 и Kiss2) и двумя соответствующими генами родственных рецепторов (Kiss1r и Kiss2r) [11]. В то время как и Kiss1, и Kiss1r совместно экспрессируются в вентральной хабенуле, нейроны, экспрессирующие Kiss2, находятся в преоптической области гипоталамуса и участвуют в секреции гонадотропина [12, 13]. Однако стоит отметить, что несколько исследований мутаций генов у рыбок данио и медаки показывают, что репродуктивная роль кисспептина может быть необязательной [14–17].

В исследовании, в котором рыбкам данио внутричерепно вводили кисспептин, отмечалось увеличение числа переходов в верхнюю часть аквариума в тесте новизны, что указывало на наличие исследовательского поведения и ослабление тревоги [18]. Данные состояния связывают со значительной экспрессией mRNA в вентральной хабенуле, являющейся эволюционно консервативной в мозге позвоночных и принимающей участие в эмоциональных ответах, которые связаны по большей части с реакциями страха и тревоги [11]. Отмечалось, что у самцов мышей введение кисспептина способствовало социальному поведению, а стимуляция нейронов кисспептина в медиальное задне-дорзальное ядро миндалины также увеличивало время нахождения в открытых рукавах теста «приподнятый крестообразный лабиринт» [19]. Это дает основание полагать, что кисспептин обладает анксиолитическим действием. Однако эти данные весьма противоречивы. В недавнем исследовании изучалось, влияет ли интрацеребровентрикулярное введение фрагмента Кп-8 на тревожные реакции у грызунов. В ходе исследования отмечали снижение времени в открытых рукавах лабиринта после интрацеребровентрикулярного введения у самцов крыс. Наблюдали также увеличение уровня кортикостерона, что дает основание полагать об анксиогенных эффектах кисспептина [20]. Напротив, в ходе дальнейших исследований не было обнаружено связи модулирующего действия и тревоги у грызунов. Внутрибрюшинное введение кисспептина не влияло на уровень адренокортикотропного гормона и кортикостерона после 30-минутного стресса, осуществляемого посредством иммобилизации в пластиковой пробирке [21]. Аналогичным образом, было замечено, что интрацеребровентрикулярное введение кисспептина самцам крыс не влияло на поведение, связанное со стрессом [22]. Сообщается, что интрацеребровентрикулярное введение Кп-13 оказывает анксиогенный эффект на самцов крыс. Кп-13 не только индуцировал значительное повышение уровня кортикостерона в плазме, но и уменьшал количество заходов и время нахождения в открытых рукавах приподнятого крестообразного лабиринта [23]. С целью выяснить, с какими рецепторами происходит взаимодействие кисспептина, было проведено исследование на пассивное избегание обучения у мышей, в ходе которого выявилось, что Кп-13 способствует обучению за счет взаимодействия с адренергическими, серотонинергическими, холинергическими, ГАМКергическими рецепторами [24]. С помощью флуоресцентной иммунохимии в миндалине грызунов были обнаружены нейроны кисспептина, находящиеся в тесном расположении с вазопрессинэргическими и дофаминэргическими нейронами. Нейроны миндалины у самцов мышей представляют собой смешанную популяцию, в которой 71 % приходится на ГАМКергические рецепторы (Vgat) и 29 % на глутаматергические (Vglut2) [25–27].

Известно, что γ-аминомасляная кислота (ГАМК) — широко распространенный нейромедиатор в нервной системе позвоночных животных. Его основной предшественник, L-глутаминовая кислота, подвергается декарбоксилированию в α-С-сайте, катализируемой у млекопитающих глутаматдекарбоксилазой (GAD) 67 или 65. Субклеточная локализация данных изоформ различна, при этом обнаружено, что GAD67 почти повсеместно присутствует в нейронах, продуцирующих ГАМК, а GAD65 специфически расположен на концах аксонов, где он связывается с митохондриями и синаптическими пузырьками. У высших позвоночных система нейронов, продуцирующих ГАМК, локализована в дорсомедиальном, паравентрикулярном, перефорникальном ядрах гипоталамуса, а также амигдале, принимающей участие в корригировании постстрессорных состояний. ГАМКергические нейроны идентифицированы у рыб данио. Этот вид рыб имеет три изоформы GAD, из которых две, gad1a и gad1b, напоминают GAD67 млекопитающих, а третья, gad2, гомологична GAD65. Эти ферменты были локализованы в мозжечке взрослой рыбы и в переднем мозге во время эмбрионального развития. Экспериментально доказано, что ГАМК_А-рецепторы также расположены в сетчатке рыб данио, в то время как ГАМК_B — только в мозжечке и обонятельных луковицах. Известно также, что кисспептин индуцирует антидепрессантоподобное действие у грызунов через адренергическую и серотонинергическую системы [28]. В соответствии с этим нейроны кисспептина в хабенуле модулируют серотонинергическую систему, подавляя реакцию страха у рыб данио [18, 29]. Можно выдвинуть предположение о вовлечении кисспептина в функции данных нейромедиаторных систем. Поскольку ген kiss1 у костистых рыб является консервативным ортологом гена Kiss1 млекопитающих и участвует в регуляции тревоги и страха, нами было сделано предположение о возможном анксиолитическом действии аналогов кисспептина Kiss1 млекопитающих у Danio rerio. Ранее мы подтвердили гипотезу о том, что аналоги кисспептина действительно снижают тревожно-фобические реакции у этих рыб в ответ на стресс новизны. Однако в сравнении с антидепрессантами серотонинового типа действия они проявляли более слабый эффект [30]. В настоящем исследовании для изучения тревоги и страха мы использовали тест новизны, описанный в наших предыдущих исследованиях [31, 32].

Цель — изучение действия аналогов кисспептина млекопитающих и Kiss10 на тревожно-фобические состояния в тесте новизны у Danio rerio.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выбор животных

В работе использованы 105 половозрелых рыб Danio rerio (zebrafish) в возрасте 6–8 мес. (молодые половозрелые животные, жизненный цикл до 5 лет) фирмы «Аква Питер», выращенные в ФГБНУ «ИЭМ», — Danio rerio, дикий тип (wild type). Для тестирования использовали интактных животных после 2-недельного периода адаптации к помещению и аквариумам водоизмещением 40 л по 20–30 животных в каждом. Температуру воды 25–27 °C поддерживали постоянно. Животных содержали в стандартных условиях светового режима (8:00–20:00) при температуре помещения 22 ± 2 °C, кормили дважды в день стандартным кормом Tetramin tropical flakes.

Тест стресса новизны

Для экспериментов оценки новизны применяли стандартный просмотровый аквариум, который используется для изучения тревожно-фобических реакций у Danio rerio [33, 34]. Он имел водоизмещение 1,5 л, трапециевидную форму, высоту 15 см и ширину 7 см. Длина аквариума в основании составляла 22 см, в верхней части — 28 см. Такая конструкция позволяет минимизировать латеральные движения рыбки и свободно наблюдать за вертикальными и горизонтальными движениями. Поскольку данный поведенческий тест основывается главным образом на инстинкте поиска защиты от незнакомой обстановки погружением на дно [35, 36], аквариум был разделен чертой на две равные части — верхнюю и нижнюю. Рыбку помещали сначала в мерный стакан водоизмещением 200 мл с растворенным фармакологическим веществом (или водой) на 5 мин, затем в предстартовый аквариум с водой (10 × 10 × 10 см) на 5 мин и далее в просмотровый аквариум на 6 мин, где регистрировали двигательную активность за опыт (длина трека рыбки), число переходов в верхнюю и нижнюю половины аквариума и время нахождения в них. Автоматически регистрировали число и время паттернов «фризинг» (обездвиживание, или «примерзание») за опыт, которые обычно наблюдаются при стрессе новизны и отражают уровень тревожности животного [37]. Поведение регистрировали автоматически с помощью системы NoldusEthoVision XT7, которая позволяет просмотреть видеотреки рыбки. Система дает возможность как снимать показания в цифровом выражении, так и визуально контролировать видеотрек. Весь период наблюдения непрерывно регистрировался, при помощи программы шла запись траектории движения.

Фармакологические вещества

Для фармакологического анализа использовали аналоги кисспептина Kiss1 млекопитающих Сloud Clone (США): KS4, KS5, KS6, KS7, KS8, KS9, а также Kiss 10 (Tyr-Asn-Trp-Asn-Ser-Phe-Gly-Leu-Arg-Phe-NH₂). Пептиды отличались строением конечных четырех аминокислот. Кисспептины растворяли в воде для аквариумов и применяли в двух дозах: 0,01 мг/л и 0,1 мг/л. В качестве препарата сравнения использовали субстанцию феназепама ОАО «Новосибхимфарм» (Россия). Феназепам растворяли в воде для аквариумов и применяли в трех дозах: 0,1; 0,5; 1 мг/л.

Статистические методы анализа

Оценку статистической достоверности различий проводили при помощи пакета программ GraphPad Prism 8.4. с использованием однофакторного дисперсионного анализа. Для сравнения контрольной и экспериментальных групп использовали однофакторный дисперсионный анализ ANOVA. Полученные результаты по анализу биологического материала определяли по t-критерию Стьюдента. Из непараметрических критериев использовали критерий Ньюмена – Кейлса для сравнения групп. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05. Для представления полученных данных использовали такие показатели описательной статистики, как среднеарифметическое значение и ошибка среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В процессе проведения экспериментов были установлены типичные поведенческие реакции на новизну (то есть на помещение животного в просмотровый аквариум). Как правило, рыба находилась в это время в нижней части просмотрового аквариума и совершала небольшие перемещения вдоль него. Средняя длина пути рыбы составляла 1205 ± 91,8 см (табл. 1). При этом часто наблюдали фризинг (примерзание, время полной неподвижности). Число и время паттерна «фризинг» автоматически регистрировались и составляли за опыт соответственно 68,2 ± 5,7 и 36,5 ± 4,5 с. Среднее время пребывания рыбы в нижней части аквариума составляло 351,0 ± 36,4 с. Число перемещений рыбы в верхнюю часть просмотрового аквариума за опыт — 1,2 ± 0,8. На фоне введения феназепама были выявлены типичные для анксиолитика поведенческие реакции на новизну. Как правило, рыбы не только находились в это время в нижней части просмотрового аквариума, но и часто заплывали в верхнюю его часть. На фоне феназепама их средняя длина пути существенно не изменялась в диапазоне использованных доз по сравнению с контрольной группой животных. При этом, так же как и в контроле, наблюдался фризинг. Число и время паттерна «фризинг» достоверно снижались по сравнению с контрольной группой животных (р < 0,05) и проявляли дозозависимый эффект. Среднее время пребывания рыбы в нижней части аквариума также достоверно снижалось по сравнению с контрольной группой животных (р < 0,05) и составляло при введении дозы 0,1; 0,5 и 1 мг/л соответственно 297,0 ± 37,6; 207,6 ± 52,2 и 142,8 ± 44,1 с, проявляя дозозависимый эффект. Наиболее статистически значимыми являлись дозировки 1 и 0,5 мг/л соответственно (табл. 1).

Таблица 1. Действие феназепама в разных концентрациях на поведенческие ответы Danio rerio в тесте стресса новизны, M ± m

Группа, концентрация вещества, мг/л	Число фризинга	Время фризинга, с	Длина траектории, см	Время нахождения в нижней части аквариума, с	Число переходов в верхнюю часть аквариума
Контроль	68,2 ± 5,7	36,5 ± 4,5	1205 ± 91,8	351 ± 36,4	1,2 ± 0,8
Феназепам 0,1	52,4 ± 8,1	34,6 ± 3,9	1315 ± 88,1	297 ± 37,6	3,1 ± 1,1
Феназепам 0,5	36,3 ± 7,5*	23,7 ± 6,2*	1256 ± 106,2	207,6 ± 52,2*	18,6 ± 4,3*
Феназепам 1,0	29,7 ± 5,2*	17,3 ± 4,6*	1422 ± 91,1	142,8 ± 44,1*	57 ± 9,2**

*р < 0,05; **р < 0,01 относительно группы рыб с чистой водой (контроль) в просмотровом аквариуме.

На фоне действия аналогов кисспетина Kiss1 мы получили следующие данные. В сравнении с контролем:

у KS4 в дозе 0,1 мг/л отмечали снижение числа фризинга в 1,4 раза, времени фризинга в 1,4 раза, длины траектории в 1,4 раза. Число переходов в верхнюю часть аквариума увеличивалось в 1,5 раза. В дозе 0,01 мг/л уменьшалось число фризинга в 1,5 раза, время фризинга в 1,5 раза, длина траектории в 3 раза;
у KS5 в дозе 0,1 мг/л уменьшались число фризинга в 1,6 раза, время фризинга в 1,6 раза, длина траектории в 1,17 раза. Увеличивалось число переходов в верхнюю часть аквариума в 1,5 раза. В дозе 0,01 мг/л уменьшались число фризинга в 3 раза, время фризинга в 2,8 раза, длина траектории в 2,8 раза;
у KS6 в дозе 0,1 мг/л уменьшались число фризинга в 2,7 раза, время фризинга в 2 раза, длина траектории в 2,5 раза. Увеличивалось число переходов в верхнюю часть аквариума в 2,5 раза. В дозе 0,01 мг/мл снижались число фризинга в 2,6 раза, время фризинга в 2,6 раза, длина траектории в 1,7 раза;
у KS7 в дозе 0,1 мг/л уменьшались число фризинга в 1,7 раза, время фризинга в 1,4 раза, длина траектории в 1,3 раза. Увеличивалось число перемещений в верхнюю часть аквариума в 1,6 раза. В дозе 0,01 мг/л снижались число фризинга в 1,7 раза, время фризинга в 1,4 раза, длина траектории в 1,6 раза;
у KS8 в дозе 0,1 мг/л снижались число фризинга в 1,6 раза, время фризинга в 1,7 раза, длина траектории в 1,6 раза. В дозе 0, 01 мг/ л снижались число фризинга в 2,3 раза, время фризинга в 2,2 раза, длина траектории в 1,8 раза;
у KS9 в дозе 0,1 мг/л снижались число фризинга в 2 раза, время фризинга в 2 раза, длина траектории в 1,2 раза. В дозе 0,01 мг/л снижались число фризинга в 1,5 раза, время фризинга в 1,5 раза, длина траектории в 1,6 раза;
у Kiss10 в дозе 0,1 мг/л наблюдали снижение числа фризинга в 1,6 раза, время фризинга в 1,5 раза, длины траектории в 1,4 раза. Наблюдалось увеличение переходов в верхнюю часть аквариума в 2,7 раза. В дозе 0,01 мг/л снижались число фризинга в 1,7 раза, время фризинга в 1,6 раза, длина траектории в 1,3 раза. Наблюдали увеличение числа траектории в 1,3 раза.

Резюмируя полученные показатели, мы пришли к выводу, что аналоги кисспептина по своему действию не уступают полученным эффектам после приема транквилизатора феназепама. Однако ожидаемые нами результаты продемонстрировал KS6 в дозе 0,1 мг/л (табл. 2).

Таблица 2. Действие аналогов кисспептина и кисспептина-10 на поведенческие ответы Danio rerio в тесте стресса новизны, M ± m

Группа, концентрация вещества, мг/л	Число фризингов	Время фризинга, с	Длина траектории, см	Время в нижней части аквариума, с	Число переходов в верхнюю часть аквариума
Контроль	81,38 ± 4,95	41,35 ± 2,31	1643,0 ± 289,8	213,9 ± 32,46	19,67 ± 3,756
KS4 0,1	55,17 ± 9,16*	28,67 ± 4,33*	1158,0 ± 217,8	314,8 ± 96,68	29,0 ± 3,856
KS4 0,01	53,0 ± 4,64**	27,58 ± 2,28**	482,8 ± 68,15**	201,7 ± 57,7	10,67 ± 2,765
KS5 0,1	48,33 ± 7,92**	24,33 ± 3,89**	1394,0 ± 691,5	209,2 ± 50,72	28,67 ± 6,859
KS5 0,01	27,83 ± 3,28#	14,33 ± 1,95#	572,0 ± 117,5**	133,9 ± 42,71	11,67 ± 3,273
KS6 0,1	29,67 ± 4,88#	18,92 ± 5,52**	663,6 ± 188,6*	183,1 ± 84,21	50,83 ± 6,695**
KS6 0,01	31,17 ± 4,16#	15,67 ± 2,14#	922,5 ± 249,4	186,5 ± 49,87	21,5 ± 3,695
KS7 0,1	47,33 ± 8,32**	29,08 ± 7,9	1205,0 ± 260,5	250,9 ± 79,55	31,83 ± 8,134
KS7 0,01	47,5 ± 10,32*	29, 33 ± 7,98	995,0 ± 258,5	149,2 ± 51,33	12,5 ± 3,294
KS8 0,1	48,17 ± 9,85*	24,0 ± 5,03*	997,9 ± 289,1	232,7 ± 45,37	21,83 ± 5,388
KS8 0,01	35,5 ± 10,09**	18,67 ± 4,76**	905,4 ± 236,9	188,0 ± 60,76	13,0 ± 2,191
KS9 0,1	41,0 ± 9,25**	20,58 ± 4,66**	1330,0 ± 401,6	116,2 ± 55,03	21,17 ± 6,565
KS9 0,01	53,83 ± 12,77	26,23 ± 6,73	1027,0 ± 237,3	147,8 ± 52,47	18,33 ± 4,271
Kiss10 0,1	50,33 ± 10,9*	28,42 ± 7,96	1163,0 ± 155,6	224,4 ± 38,58	54,83 ± 9,268**
Kiss10 0,01	48,67 ± 14,09	25,33 ± 7,65	1273,0 ± 276,5	180,7 ± 41,22	25,5 ± 3,879

*p < 0,05; **p < 0,005; #p < 0,0001 относительно контрольной группы.

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Ранее исследования на новизну помещения в аквариум у Danio rerio были описаны на примере антидепрессантов серотонинового типа действия. При этом мы определили, что в сравнении с контролем и аналогами кисспептина анксиолитические эффекты антидепрессантов имели наиболее высокие показатели. На сегодняшний день в клинической практике назначают препараты группы cелективных ингибиторов обратного захвата серотонина (СИОЗС). Согласно проведенному метаанализу в сравнении с плацебо наибольшее действие препараты группы СИОЗС оказали на пациентов с социальной тревожностью. На втором месте — пациенты с генерализованным тревожным расстройством, и затем — пациенты с паническим расстройством [38]. Однако длительный прием антидепрессантов приводит к селективному синдрому апатии. В ходе проведенного исследования была выявлена связь развития депрессии на фоне длительного употребления антидепрессантов в сравнении с плацебо [39]. В данном случае синдром СИОЗС связан с формированием протагонизма серотонина и дофамина в структурах ЦНС. Повышение уровня серотонина на фоне приема СИОЗС приводит к снижению активности дофамина в мезокортикальном и мезолимбическом путях, отвечающих за мотивацию и эмоциональные состояния соответственно. В связи с тем что эти системы ответственны за мотивационную активность, снижение их активности приводит к развитию данного синдрома [40]. Подбор препарата для лечения расстройств всегда сопровождался осложнениями, связанными с побочными эффектами. Помимо антидепрессантов группы СИОЗС мы рассмотрели действие препаратов группы бензодиазепина на примере феназепама. Однако наиболее частыми побочными эффектами становятся сонливость и заторможенность [41]. Несмотря на недостатки описанных групп препаратов, они продолжают широко использоваться на фармацевтическом рынке.

Наши исследования показали, что реакция на новизну помещения в новый аквариум у Danio rerio на фоне введения транквилизатора вызывает типичную картину поведенческих актов. При этом время нахождения рыбки в верхней части аквариума достоверно увеличивалось. Длина траектории движения рыбы после введения феназепама увеличивалась. Число и время паттерна «фризинг» достоверно уменьшались по сравнению с контролем, и наблюдался дозозависимый эффект. Время в нижней части аквариума на фоне феназепама существенно снижалось. Число перемещений рыбы в верхнюю часть просмотрового аквариума достоверно увеличивалось по сравнению с контрольной группой животных. Необходимо отметить, что анксиолитические эффекты аналогов кисспептина млекопитающих, определяемые по снижению времени в нижней половине аквариума и увеличению числа переходов в верхнюю часть аквариума, оказались не такими высокими по сравнению с поведенческими эффектами, которые наблюдались после введения феназепама. Наибольшая достоверность была у KS6. Наиболее эффективная доза для действия изученных аналогов кисспептина соответствовала 0,1 мг/л.

Страх — одна из примитивных эмоций, эволюционно сформированной от низших до высших организмов как ответ на угрожающие сигналы среды [42]. По всей видимости, общими будут и нейронные механизмы у разных классов животных. Уже известно, что ген kiss1 у костистых рыб является консервативным ортологом гена KISS1 / Kiss1 млекопитающих и участвует в регуляции тревоги и страха, опосредуя 5 HT-систему [18, 43], на основании чего Danio rerio были выбраны как первичный объект исследования. Однако тревожно-фобические реакции опосредуются не только серотонинэргической системой. В данном исследовании мы предположили, что помимо 5 НТ-системы в реакции страха участвует система ГАМК. Поскольку проводятся исследования касательно эффектов кисспептинов и уже известно, что у млекопитающих данный пептид взаимодействует с серотонинергическими, холинергическими, ГАМКергическими рецепторами [24], то мы предположили об аналогичных механизмах поведения в связи со стрессом у рыб данио. Наличие Kiss-R в уздечке рыб и млекопитающих [44] предполагает, что роль передачи сигналов кисспептина может быть эволюционно сохранена у позвоночных.

ВЫВОДЫ

Аналоги кисспептина Kiss1 млекопитающих снижают тревожно-фобические реакции на новизну у Danio rerio. В то же время эффекты исследуемых аналогов кисспептина незначительно ниже, чем у феназепама.
Судя по всему, кисспептин участвует не только в модуляции серотонинзависимого поведения у Danio rerio, но и ГАМКергической системы, подобно транквилизаторам бензодиазепинового ряда.
Результаты исследований подтверждают гипотезу о том, что кисспептин может участвовать в регуляции тревожно-фобических состояний, по-видимому, для поддержания эмоциональных аспектов репродуктивного поведения, таких как половая мотивация и возбуждение.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Вклад каждого автора: В.А. Гольц, А.А. Блаженко, В.А. Лебедев, С.В. Казаков, А.А. Байрамов, П.П. Хохлов, Е.Р. Бычков, С.С. Пюрвеев — написание статьи, анализ данных; А.А. Лебедев, П.Д. Шабанов — разработка общей концепции.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России FGWG-2022-0004 на 2022–2025 гг. «Поиск молекулярных мишеней для фармакологического воздействия при аддиктивных и нейроэндокринных нарушениях и создание новых фармакологически активных веществ, действующих на рецепторы ЦНС».

ADDITIONAL INFORMATION

Authors’ contribution. Thereby, all authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the study. Personal contribution of each author: V.A. Golts, A.A. Blazhenko, V.A. Lebedev, S.V. Kazakov, A.A. Bayramov, P.P. Khokhlov, E.R. Bychkov, S.S. Purveev — manuscript drafting, writing and pilot data analyses; А.А. Lebedev, P.D. Shabanov — general concept discussion.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Funding source. The work was carried out within the framework of the state task of the Ministry of Education and Science of Russia FGWG-2022-0004 for 2022–2025 “Search of molecular targets for pharmacological action in addictive and neuroendocrine disorders and the creation of new pharmacologically active substances acting on CNS receptors”.

About the authors