Studying the anticonvulsive activity of new ligands of NDMA-receptor complex – imidazole-4,5-dicarbonic acid derivatives

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Глутаматные NMDA-рецепторы являются критически важными молекулами, обеспечивающими физиологическое функционирование нервной системы и модулирующими нейротрасмиссию. При активации глутаматного рецептора ионный канал избирательно пропускает катионы Na⁺ и Ca²⁺ внутрь клетки, а K⁺ из клетки, что обусловливает процессы синаптической и нейрональной пластичности [5]. Интенсивное воздействие глутамата, равно как и применение агонистов глутаматных рецепторов, сопровождается перевозбуждением нейрона и переходом в состояние эпилептиформной активности с развитием судорог [25].

При появлении конкурентных антагонистов NMDA-рецепторов фармакологами начала активно изучаться возможность их применения в качестве противосудорожных средств [1]. К настоящему моменту большое количество экспериментальных данных, полученных на различных моделях судорог, свидетельствует о выраженном противосудорожном действии антагонистов NMDA-рецепторов различных классов, однако применение изученных NMDA-лигандов остается ограниченным в связи с их плохой переносимостью и токсическими эффектами. Известно, что глутаматергическая система принимает участие в универсальном механизме повреждения нервной ткани, именуемом «эксайтотоксическая смерть нейронов», опосредуя запуск кальций-зависимых эндонуклеаз, фосфолипаз и протеаз [14, 17]. В связи с этим фармакологические подходы к модуляции нейрональных процессов, связанных с функционированием глутаматных рецепторов, должны основываться на мягком, управляемом воздействии на данный класс молекул. Таким образом, NMDA-рецепторный комплекс остается одной из ключевых мишеней в поиске новых эффективных и безопасных средств регулирования нарушений синаптической передачи, играющих значимую роль в патогенезе судорожных состояний [9].

Целью исследования являлось изучение противосудорожного действия новых лигандов глутаматного NMDA-рецепторного комплекса — производных имидазол-4,5-дикарбоновых кислот.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выбор животных. Эксперименты выполнены на белых мышах-самцах массой 18–25 г, полученных из питомника «Рапполово» (Ленинградская обл.). Животных содержали в стандартных пластмассовых клетках в условиях вивария при свободном доступе к воде и пище при температуре 22 ± 2 °C и в эксперименте разделяли на несколько групп (по 6 животных в каждой). Все опыты проведены в осенне-зимний период. Содержание животных соответствовало правилам лабораторной практики (GLP), нормативным документам «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию вивариев» и Приказу МЗ и социального развития РФ от 23.08.2010 № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики».

Приготовление и введение исследованных соединений, препарата сравнения и конвульсантного агента. Тестируемые вещества — производные имидазол-4,5-дикарбоновой кислоты (ИДК): ИЭМ-2258 и ИЭМ-2248 — растворяли в дистиллированной воде, доводили с помощью 0,5 н NaOH до рН 7,0 и вводили в боковой желудочек мозга бодрствующей мыши в дозах 0,1–0,5 мкмоль в 5 мкл за 15 мин до конвульсанта [16]. В качестве конвульсанта в боковой желудочек мозга вводили водный раствор NMDA (Sigma, США, 5 мкг в 5 мкл). Препарат сравнения — вальпроевая кислота (Депакин^® хроно, Санофи Винтроп Индустрия, Франция) растворяли в дистиллированной воде и вводили в желудок мыши с помощью зонда в дозе 20 мг/кг.

Регистрировали двигательную активность, поведение животных на фоне введения исследуемых соединений. Седативный эффект диагностировали по неподвижной позе животного и величине сужения глазной щели (птозу). Отдельно с помощью теста удерживания на перевернутой сетчатой платформе изучали миорелаксирующую активность исследуемых веществ [7].

Изучение противосудорожной активности. После введения исследованных соединений и затем через 15 мин NMDA в каждой экспериментальной группе фиксировали интенсивность, продолжительность тонико-клонических судорог и частоту летальных исходов. После каждого опыта у всех животных проводили верификацию попадания тестируемых веществ в БЖ мозга [2].

Статистическая обработка полученного материала. Статистическую обработку результатов проводили с помощью MS Excel 2010 и BioStat 2009. Нормальность распределения данных определяли по критерию Шапиро – Уилка. Достоверность различий значений между группами определяли с помощью непараметрических критериев: Крускала – Уоллиса и точного критерия Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В модели NMDA-индуцированных судорог исследуемые производные ИДК в диапазоне доз от 0,1 до 0,5 мкмоль проявляли противосудорожную активность различной степени выраженности. Результаты экспериментов представлены в таблице.

 

§     Влияние производных имидазол-4,5-дикарбоновой кислоты (ИЭМ-2258, ИЭМ-2248) и вальпроевой кислоты на NMDA-индуцированные судороги
Вещество	Доза	Эффект	Миорелаксация	Судороги на фоне NMDA
				интенсивность	продолжительность, с	летальный исход, %
Контроль (NMDA)	5 мкг в 5 мкл	Тонико-клонические судороги	–	+++	19,67 ± 12,4	100
Вальпроевая кислота	20 мг/кг	Снижение активности в 67 % случаев	–	++	11 ± 10,24	66,7
ИЭМ-2258	0,1 мкмоль в 5 мкл	Снижение активности, замирание	–	+++	54,33 ± 27,72*,**	66,7
То же	0,2 мкмоль в 5 мкл	То же	+	+++	327,5 ± 299*,**	50
« «	0,3 мкмоль в 5 мкл	Седативный эффект	++	++	324,67 ± 302,9*,**	50
« «	0,4 мкмоль в 5 мкл	То же	+++	++	125 ± 35,07*,**	0
« «	0,5 мкмоль в 5 мкл	То же	++	+++	333,33 ± 292,2*,**	50
ИЭМ-2248	0,1 мкмоль в 5 мкл	Снижение активности, замирание	+	+++	188,33 ± 112,6	16,7
То же	0,2 мкмоль в 5 мкл	Седативный эффект	++	отсутствуют в 100 %	–	0
« «	0,3 мкмоль в 5 мкл	То же	+	++, отсутствуют в 37,5 %	23,83 ± 19,8	37,5
« «	0,4 мкмоль в 5 мкл	↑ЧД, ЧСС, судорожные подергивания, тремор, распластывание				75
« «	0,5 мкмоль в 5 мкл					75
Примечание. «–» — отсутствие признака; «+» — слабо выраженный признак; «++» — умеренно выраженный признак; «+++» — выраженный признак; n = 6. * Различия достоверны при р < 0,05 по сравнению с контрольной группой, получавшей NMDA. ** Различия достоверны при р < 0,05 по сравнению с группой, получавшей вальпроевую кислоту. ЧД — частота дыхания, ЧСС — частота сердечных сокращений.

 

Введение вальпроевой кислоты в данном тесте приводило к уменьшению количества летальных исходов, а также интенсивности и длительности судорог, полностью отсутствовавших в 33 % случаев. При этом соединение ИЭМ-2258 в дозах 0,1 мкмоль и 0,2–0,3 мкмоль снижало процент летальных исходов, вызванных NMDA-индуцированными судорогами, в 1,5 и 2 раза соответственно. На фоне введения ИЭМ-2258 в дозе 0,4 мкмоль летальные исходы полностью отсутствовали. Помимо уменьшения количества летальных исходов на фоне применения ИЭМ-2258 снижалась интенсивность тонико-клонических судорог. Изменение продолжительности судорог на фоне введения соединения ИЭМ-2258 в возрастающих дозах также отражает тенденцию к ее уменьшению, однако, в связи со снижением процента летальных исходов, наблюдаемых на первых секундах после введения NMDA, абсолютная продолжительность судорог была выше в группах, где выживало больше животных. Достоверное уменьшение продолжительности судорог, по сравнению с предыдущей дозой соединения ИЭМ-2258, отмечено только в дозе 0,4 мкмоль, при этом летальные исходы в данной группе животных полностью отсутствовали, что свидетельствует о значимом противосудорожном эффекте. Дальнейшее увеличение дозы исследуемого вещества до 0,5 мкмоль приводило к увеличению интенсивности судорог и процента летальности.

Соединение ИЭМ-2248 также проявляло противосудорожную активность в тесте NMDA-индуцированных судорог, уменьшая в дозе 0,1 мкмоль процент смертности животных в 6 раз, по сравнению с контролем, а в дозе 0,2 мкмоль в 100 % случаев предотвращая летальные исходы и полностью защищая животных от наступления судорог. В дозе 0,3 мкмоль на фоне введения ИЭМ-2248 противосудорожный эффект был выражен слабее (тонико-клонические судороги и летальный исход отмечались в 37,5 % случаев). При дальнейшем увеличении дозы у животных отмечались субтоксические и токсические эффекты (увеличение частоты дыхания, частоты сердечных сокращений, судорожные подергивания и тремор), в 75 % случаев приводящие к гибели.

Помимо установленного противосудорожного действия при увеличении дозы соединения ИЭМ-2258 от 0,1 до 0,4 мкмоль отмечено нарастание его седативного и миорелаксирующего эффектов. Соединение ИЭМ-2248 также проявляло седативное действие, однако его миорелаксирующая активность была выражена слабее, по сравнению с ИЭМ-2258 (см. таблицу).

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Таким образом, среди новых лигандов NMDA-рецепторного комплекса выявлены соединения, проявляющие противосудорожное действие при введении в дозах 0,1–0,5 мкмоль в боковые желудочки мозга грызунов. Механизм действия исследованных соединений предполагает дозозависимое ингибирование глутаматных NMDA-рецепторов, что является значимым аспектом для мягкого регулирования нарушений синаптической передачи с вовлечением глутаматергических структур, играющих значимую роль в патогенезе судорожных состояний.

Интерес к поиску и разработке новых антиконвульсантов на основе антагонистов NMDA-рецепторов основан на доказанной роли и эффективности данного класса препаратов, в том числе при некоторых формах судорожных расстройств, резистентных к ранее существующей терапии: выявлено, что некоторые конкурентные антагонисты NMDA при внутримозговом введении проявляют более сильное противосудорожное действие, чем классический антиконвульсант диазепам [1]. Известно, что значимую роль в инициации судорог и их распространении играет гиперактивация глутаматных синапсов с вовлечением ионотропных глутаматных NMDA-рецепторов [4, 18]. В физиологических условиях NMDA-рецепторы инициируются незначительным количеством глутамата, который присутствует в синаптической щели в течение нескольких миллисекунд. Глутамат обеспечивает мгновенную деполяризацию постсинаптического нейрона через ионотропные NMDA-рецепторы прежде, чем астроциты превратят его в глутамин, который не оказывает возбуждающего воздействия на клетки [11, 22]. В норме концентрация глутамата во внеклеточном пространстве поддерживается на низком уровне (0,6–2,0 мкМ), но при некоторых патологических состояниях, в том числе эпилепсии, механизмы удаления глутамата из синаптической щели могут нарушаться [6]. Особенностью NMDA-рецепторов является регуляция проводимости ионных каналов для ионов Ca²⁺. Вследствие возбуждения NMDA-рецепторов наблюдается более активное поступление ионов Са²⁺ в клетки и накопление ионов K⁺ во внеклеточном пространстве, что способствует деполяризации клеточной мембраны [1]. Высокая проницаемость для ионов Са²⁺ и перевозбуждение нейрона при интенсивном воздействии глутамата сопровождается переходом физиологически функционирующих нейронов в состояние эпилептиформной активности и может привести даже к развитию эпилептического статуса [3]. Повышение концентрации внеклеточного K⁺, по мнению некоторых авторов, также может являться пусковым механизмом в процессах эпилептогенеза [13]. Более того, показано, что на фоне изменения внеклеточных концентраций Mg²⁺ при деполяризации мембраны полностью устраняется магниевый блок, что усиливает проводимость NMDA-рецепторов и поддерживает процессы эпилептогенеза (см. рисунок).

 

Схематическое изображение нейротрансмиссии через глутаматные рецепторы (Ca²⁺-, Na⁺-, K⁺-, Mg²⁺-токи в ответ на активацию глутаматергических синапсов). Чрезмерная активация приводит к изменению потенциала синаптической мембраны

 

Об актуальности поиска новых лигандов NMDA-рецепторов свидетельствует включение данных молекул в «Перечень биомишеней для разработки схожих по фармакотерапевтическому действию и улучшенных аналогов инновационных лекарственных препаратов», утвержденный приказом Минздрава России от 19.05.2016 № 1605/308н. Однако на сегодняшний момент существующие средства остаются недостаточно эффективными и/или обладают широким спектром нежелательных реакций при клиническом применении [7, 15, 16]. Установлено, что NMDA-антагонист фелбамат является противоэпилептическим препаратом, эффективным при различных типах судорог, однако его использование ограничивают гемато- и гепатотоксический эффекты [8, 13]. Низкоафинный неконкурентный антагонист NMDA-рецептора ремацемид показал хорошую противосудорожную активность на различных моделях у лабораторных животных, однако его высокая эффективность в клинике не подтверждена [17]. Среди антагонистов АМРА-рецепторов, также имеющих потенциал к снижению нейронального возбуждения, единственным к настоящему моменту зарегистрированным в России противоэпилептическим препаратом является перампанел, применяющийся в качестве вспомогательного средства для лечения парциальных судорожных приступов [10, 14]. Дело в том, что, как известно, помимо регуляции синаптической передачи, глутаматергическая система принимает непосредственное участие в механизмах эксайтотоксичности, обусловливающих проявления окислительного стресса, митохондриальной дисфункции, нейровоспаления и других процессов, приводящих к гибели нейронов [1].

В результате исследований механизмов эксайтотоксичности предложено несколько направлений для разработки протективных средств. На экспериментальных моделях снижение эксайтотоксичности было достигнуто через прямое влияние на ионотропные, метаботропные рецепторы глутамата, активацию транспортеров глутамата, осуществляющих захват нейромедиатора из синаптической щели, блокаду поступления ионов кальция в нейроны. Однако проблемы безопасности, связанные с глутаматергической модуляцией, по-прежнему актуальны и состоят в чрезвычайно важной роли глутамата и его рецепторов в ключевых функциях ЦНС. Известно, что все клетки мозга имеют рецепторы к глутамату, и множество нейронов используют глутамат как нейротрансмиттер, поэтому любое изменение активности рецепторов глутамата неизбежно влияет на важные структурно-функциональные параметры деятельности мозга. Доказано, что лиганды глутаматных рецепторов проявляют значительный потенциал в отношении предотвращения гибели нейронов, при этом приоритетным направлением разработки соединений этой фармакологической группы остается поиск средств, позволяющих осуществить воздействие на глутаматергическую систему путем мягкой, управляемой модуляции [5]. В этой связи результаты, полученные в настоящем исследовании, свидетельствующие о способности новых производных имидазол-4,5-дикарбоновых кислот (ИЭМ-2258 и ИЭМ-2248) оказывать значимое и при этом регулируемое величиной дозы тестируемого вещества противосудорожное действие, обусловленное блокадой NMDA-рецепторного комплекса, свидетельствует о перспективности разработки данных веществ и дальнейшего поиска эффективных и безопасных противосудорожных средств среди соединений данного класса.

About the authors

Ekaterina E. Jakovleva

Institute of Experimental Medicine

Author for correspondence.
Email: eeiakovleva@mail.ru

PhD, Scientific Researcher of The Laboratory of Chemistry and Pharmacology of Pharmaceutical Drug of S.V. Anichkov Department of Neuropharmacology

Russian Federation, Saint Petersburg

Stanislav P. Foksha

Institute of Experimental Medicine

Email: dr.foksha@mail.ru

PhD Student, S.V. Anichkov Department of Neuropharmacology

Russian Federation, Saint Petersburg

Marija A. Brusina

Institute of Experimental Medicine

Email: mashasemen@gmail.com

PhD, Junior Scientific Researcher of The Laboratory for the synthesis and nanotechnology of drugs of S.V. Anichkov Department of Neuropharmacology

Russian Federation, Saint Petersburg

Larisa G. Kubarskaja

Institute of Experimental Medicine; Institute of Toxicology, Federal Medical and Biological Agency

Email: larkub@yandex.ru

PhD, Leading Engineer, S.V. Anichkov Department of Neuropharmacology; Senior Researcher

Russian Federation, Saint Petersburg

Levon B. Piotrovskij

Institute of Experimental Medicine

Email: piotrovsky@yandex.ru

Doctor of Biological Sciences, Professor, Head of The Laboratory for the synthesis and nanotechnology of drugs of S.V. Anichkov Department of Neuropharmacology

Russian Federation, Saint Petersburg

Eugenii R. Bychkov

Institute of Experimental Medicine; S.M. Kirov Military Medical Academy

Email: bychkov@mail.ru

PhD, Head of The Laboratory of Chemistry and Pharmacology of Pharmaceutical Drugs of S.V. Anichkov Department of Neuropharmacology; Lecturer Department of Pharmacology

Russian Federation, Saint Petersburg

Petr D. Shabanov

Institute of Experimental Medicine

Email: pdshabanov@mail.ru

Dr. Med. Sci. (Pharmacology), Professor and Head, Dept. of Neuropharmacology

Russian Federation, Saint Petersburg

References