Влияние типа гелевой матрицы на ранозаживляющую активность адгезивных аппликаций наносеребра с гуминовыми кислотами на модели термического ожога у крыс

Полный текст

АКТУАЛЬНОСТЬ

Разработка новых фармакологических препаратов и лекарственных композиций, изучение специфических механизмов их действия на различных биологических моделях с последующей экстраполяцией биологических эффектов на человека являются одним из важнейших направлений экспериментальной фармакологии [1].

Термические повреждения кожи (ожоги) относятся к распространенным бытовым и техногенным травматическим поражениям человека [2]. В военное время термический фактор является дополнительным поражающим фактором при комбинированных поражениях кожи поражающих элементов современного оружия [3].

Несмотря на комплексный подход в лечении пациентов комбустиологического профиля, местное консервативное лечение пациентов с ожоговыми ранами имеет большое значение, поскольку препятствует развитию микробной контаминации и гнойно-воспалительных осложнений, ускоряет процесс заживления без риска формирования рубцовых образований [4]. Несмотря на многообразие лекарственных средств для местного лечения ожогов и ран, в целом, большинство результатов терапии остается неудовлетворительным, в связи с чем проводится научный поиск новых эффективных средств для местного лечения ожоговых поражений, основываясь на теоретических данных известных субстанций [5]. Одним из характерных примеров подобных субстанций являются гели различного состава, способные существенно повышать скорость заживления при лечении ожогов и ран [4]. Благодаря широкому спектру составов, подходящих для создания гелей и возможности включения в гелевую матрицу интересующих активных компонентов, в том числе антибактериальных и ранозаживляющих, подобные композиции представляют существенный интерес в терапии поражений различного генеза [6].

            В настоящее время, существенный интерес в противодействии инфекциям представляют гуминовые вещества [7] и их композиции с различными металлическими наночастицами [8, 9], обладающие антибактериальной активностью. Включение в состав подобных субстанций наночастиц серебра является одним из наиболее перспективных направлений, вследствие их комбинированного антибактериального и пролиферативного эффекта [10]. Существенен также вклад состава гелевой матрицы и гуминовых веществ в понижение цитотоксичности серебряных наночастиц и в повышение их биодоступности в полости раны. Благодаря этому, особенно важно изучение влияния высвобождения описанных композиций из гелевой матрицы на процесс заживления ран для потенциального применения в терапии.

Цель настоящего исследования заключалась в оценке терапевтическую эффективность гелей на основе наночастиц серебра в сочетании с гуминовыми кислотами на заживление ожоговой раны после экспериментального термического повреждения кожи у крыс.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Общий дизайн экспериментального исследования.

Выполнено экспериментальное исследование, оценивающее эффективность ежедневного влияния аппликаций различных гидрогелей с (8,5±0,5)% включением модифицированных наносеребром гуминовых кислот, изготовленной фармакопейным образом, на модели термического ожога кожи лабораторных животных белых нелинейных крысах-самцах массой 218-260 г. (n=57), полученных из ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово», Ленинградская область). В качестве гелевой основы в 3-х экспериментальных группах использовали натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы (Na-КМЦ), полиакриламид (ПААМ), полиэтиленгликоль (ПЭГ). Группой сравнения служили лабораторные животные, получающие мазь «Левомеколь», интактным контролем служили лабораторные животные, не получающие лечение.

Содержание животных, формирование опытных групп и рандоминизация. После получения из питомника крыс содержали в течение карантина, длительность которого составила не менее 14 суток. Лабораторные животные содержались в стандартных условиях вивария по 2-3 однополых особей в группе, при этом каждая группа имела доступ к воде и пище ad libidum. Экспериментальные животные в первой серии экспериментальных наблюдений были разделены с помощью генератора случайных чисел на 3 равные экспериментальные и группу сравнения, оставшиеся 9 нерандомизированных животных составили группу интактного контроля (Таблица 1). Длительность эксперимента составила 35 дней.

Моделирование термического ожога

Несмотря на то, что выбор термического агента, моделирование и патогенез ожоговой раны несколько отличаются от реальных условий их получения, нами  выполнена воспроизводимая и простая модель термического ожога соответствующая III В ст. Повреждение кожи наносили в области проксимальной части спины при помощи термоаппликатора с плоской рабочей частью в форме круга диаметром 20 мм после предварительной депиляции кожи, чтобы лабораторные животные не имели возможности контакта мордой и лапами с раневой поверхностью. Процедуру ожога кожи крысам выполняли под общей анестезией препаратами Золетил^®100 в сочетании с 0,01% раствором клофелина в соотношении 2:1. Через 72 часа после нанесения ожога рану освобождали от струпа полным его иссечением по границе с неповрежденной кожей.  Так как у норных животных крайне выражена контракция, после иссечения струпа кожу вокруг раны прошивали хирургической нитью установкой шинирующего кольца внутренним диаметром 25 мм и наружным диаметром 27 мм.

 

Наблюдение за лабораторными животными

Для получения объективных показателей заживления ран вторичным натяжением мы использовали широко распространенный в клинической практике планиметрический метод Л.Н. Поповой (1942), основанный на регистрации скорости уменьшения раневой поверхности во времени. Индекс заживления ран в сутки определяли по формуле А.Е. Троица (1989):

V=	S0 - St	˟  100%
	St ˟ n

где V – скорость (индекс) заживления площади раны в сутки, S₀ - исходная площадь раны, S_t - площадь в день измерения, n - количество суток (интервал между измерениями).

Для объективизации данных на всех основных этапах эксперимента проводили фотофиксацию состояния ран с использованием масштабной линейки для последующего расчета их площади. Для определения площади ран использовали программу Universal Desktop Ruler, позволяющую определять геометрические параметры раны по фотографии, с предварительной калибровкой точности измерения по отраженной на фотографии масштабной линейке.

Статистическая обработка.

Методы описательной статистики включали общепринятые методы описательной статистики с учетом статистики малых групп включали в себя как среднее значение с оценкой стандартной ошибки среднего (SE) и стандартного отклонения (SD), так и медиана признака с определением верхнего и нижнего квартилей (25%- и 75% перцентиля), при этом определялся вариант распределения признака в группе: нормальное и отличное от нормального. Распределение признака в группах определяли на основании критерия Андерсона-Дарлинга. С учетом особенностей распределения признака группы в каждом эксперименте сравнивали по U-критерий Манна – Уитни, с учетом относительно небольшой выборки дополнительно использовался F-тест. Для сравнения динамики эпителизации ран лабораторных животных использовали графический метод по типу кривых Е.Л. Каплана и П. Мейера, при этом при построении кривой в каждой контрольной временной точке демонстрировал средний уровень оставшейся раневой в данный период времени от 100% в день начала эксперимента до 0% при полной эпителизации, при этом рассчитывали медиану времени до 25%, 50% и 75% эпителизации. После окончания эксперимента (35 сут.) выполнялось моделирование кривых до 0%. Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (при отсутствии значимых различий или факторных влияний) принимали равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Установлено, что в серии экспериментов с термическим повреждением кожи с последующим нанесением основного после выполнения отложенной (через 72 часа) хирургической некрэктомии в зоне глубокого ожога кожи в виде спрея 1 раз в сутки сопровождалось достоверным сокращением площади раны по отношению с интактным контролем, однако динамика заживления в группах Ia и Ic была сопоставима с группой, получающей референсный препарат – мазь «Левомеколь», при этом в группе Ib результаты были не сильно отличны от интактного контроля (Таблица 2).

Динамика заживления ран по остаточной средней площади раневой поверхности, на основании кривых Е.Л. Каплана и П. Мейера по остаточной средней раневой поверхности в группах продемонстрировала равномерную динамику заживления ран вне зависимости от групп (Рисунок 1)

При измерении динамики эпителизации при неинфицированных ранах было установлено, что медианы времени до 25%, 50%, 75% эпителизации раны в группах, которые получали лечение, отличались группы сравнения и интактного контроля также в зависимости от гелевой основы: наиболее высокие результаты были в Ia группе, в группе Ib и интактном контроле медиана до 75% эпителизации ран не достигнута (Таблица 3).

Анализируя полученные данные, при положительной динамике геле на основе гуминовых веществ модифицированных наносеребром по продолжительности и степени заживления ожогов у животных, следует отметить, что при выраженных прорегенераторных эффектах значение имеет гелевая основа препарата. Так наличие в качестве основы карбоксиметилцеллюлозы (Na-КМЦ), полиэтиленгликоля (ПЭГ) или полиакриламида (ПААМ) оказывает существенное влияние на процесс ранозаживления (Рисунок 2). Так можно наблюдать, что при лечении с использованием гелей на основе Na-КМЦ к 27-му дню происходит полная эпителиализация раны без существенных дефектов, применение основанного на ПЭГ геля также позволяет добиться полной эпителиализации поверхности раны, но с существенными утолщениями и глубокими выростами в рубцовую ткань и повышенной васкуляризацией соединительной ткани. При использовании ПААМ наблюдается отсутствие эпителия в центре дефекта и существенная васкуляризация молодой соединительной ткани, с присутствием под корочкой слоя нейтрофильных лейкоцитов. Таким образом можно судить, что применение геля на основе Na-КМЦ позволяет добиться наиболее положительных результатов при заживлении тяжёлых ожоговых ран по сравнению с гелями на основе ПААМ и ПЭГ.

Заживление ожогов представляет собой длительный многоэтапный биологический процесс, включающий несколько последовательных фаз, при этом основной задачей клинициста является контроль за инфекцией, воспалительной реакцией и регенерацией. Несмотря на продемонстриованную эффективность биоинженерных заменителей кожи и клеточной терапии в комбустиологии, высокая стоимость данных медицинских технологий и изделий медицинского назначения ограничивает их применение в широкой медицинской практике, что делает гели и мази с активными субстанциями основными лекарственными формами, применяемыми в местной терапии ожоговых ран. Огромное значение для выбора лекарственного средства с целью лечения ожогов является наличие покровной, обеспечивающей снижение контаминации раны назокомиальной микробиотой и фазность процессов регенерации, противомикробной и прорегенеративной функции. Разработанная композиция показывает существенное влияние на ускорение регенеративного процесса и противодействие инфицированию ожоговых ран на протяжении всего времени наблюдения за подопытными животными.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Применение гидрогелей на основе модифицированных наносеребром гуминовых кислот, может являться перспективной адъювантной терапией термических поражений кожи, что не уступает по своей эффективности стандартным лекарственным средствам, при этом наиболее эффективной является гелевая основа в виде натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы. Прорегенераторные свойства данных комбинаций в сочетании с потенциальными противомикробными свойствами позволяет проводить обработку как раневой поверхности, и снижать вторичную контаминацию ран.

Таблица 1. Характеристика исследуемых групп лабораторных животных

Группа №	Кол-во жив-х	Название группы	Исследуемая субстанция	Гелевая основа	Способ нанесения
Ia	12	Опытная 1	гумат наносеребра	Na-КМЦ	1 раз в сутки объемом 3,5±0,3 мл
Ib	12	Опытная 2		ПААМ
Ic	12	Опытная 3		ПЭГ
II	12	Группа сравнения	мазь «Левомеколь»
III	9	Интактный контроль	Отсутствие лечения

 

 

 

 

Таблица 2 – Результаты измерения площади поверхности раны в области термического ожога у крыс (в мм²)

день эксперимента	Группы лабораторных животных
	Iа (КМЦ)	Ib (ПАМ)	Ic (ПЭГ)	II	III
10	216 (211;219) ♭	245 (231;260,5)	247 (230;285) ♭	236 (230;279) ♭	251 (246;254,75)
14	185 (173;186) ♭	221,2±3,6	194,5±0,8♭	200 (198;202) ♭	225,5 (217;230)
17	162 (157;163) ♭	201,4±3,1	169,6±1,8♭	186 (183;187) ♭	204,5 (200;210,3)
21	136 (123;139) ♭	167,4±1,4	144,6±2,6♭	158 (155;160) ♭	181,5 (174,8;192,5)
24	121 (105;123) ♭	154,8±3,7	147,5±2,8♭	136 (134;139) ♭	161 (159,3;172,3)
28	89 (82;98) ♭♮	136 (130,8;152,8)	115,0±1,7♭	117 (115;118) ♭	140,1±4,9 (13,8)
Примечание: статистически значимое отличие (при позитивном результате) ♭ - в сравнении с интактным контролем, ♮ - по отношению к референсному препарату (Левомеколь, группа II);  ⸸ - между Ia и Ic группами

 

 

 

 

Таблица 3 – Динамика эпителизации ран в течение эксперимента

день эксперимента	Группы лабораторных животных
	опытные группы			группа сравнения	интактный контроль
	Ia	Ib	Ic
Среднее время (медиана) 25% эпителизации ран, сут.	8,3±0,24†	10 (9;11)	12 (12;13)	10,1±0,25	12,63±0,38
Среднее время (медиана) 50% эпителизации ран, сут.	18,8±0,33†	25 (25;28,25)	22 (20;22)	21,1±0,34†	25,75±0,82
Среднее время 75%  (медиана) эпителизации ран	29,4±0,2†	не достигнута	34 (33;34)	33,3±0,45	не достигнута
Индекс заживления (за 28 суток), %/сут	8,6	4,8	6,5	6,1	4,4
Примечание: статистически значимое отличие (при позитивном результате) † - в сравнении с интактным контролем, ♮ - по отношению к референсному препарату (Левомеколь, группа II);  ⸸ - между Ia и Ic группами

 

 

 

Рисунок 1. Динамика зависимости степени эпителизации экспериментальных термических ран от времени для контрольных групп животных Ia (●), Ib (○), Iс (▼), II (△), III (■).

Picture 1. Dynamics of cutaneous wound repairs in the form of curves constructed based on changes of the wound surface area.

 

 

(c)

(b)

(a)

Рисунок 2. Гистологический анализ ран подопытных животных, проведённый после эвтаназии на 27-й день с момента ожога при применении гелевой матрицы на основе Na-КМЦ (а), ПААМ (b), ПЭГ (с).

Picture 2. Histological evaluation of experimental subjects, carried out after euthanasia on 27-th day after wounding with application of Na-CMC- (a), PAM- (b) and PEG-based (c) gels.

Об авторах

Руслан Иванович Глушаков

Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова

Автор, ответственный за переписку.
Email: glushakoffruslan@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-0161-5977
SPIN-код: 6860-8990

, д-р мед. наук; ORCID: ; eLibrary SPIN: e-mail:

Россия, Санкт-Петербург

Ирина Васильевна Перминова

МГУ им. Ломоносова

Email: iperminova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9084-7851

д-р хим. наук, профессор, заведующий научно-исследовательской лабораторией природных гуминовых систем кафедры медицинской химии и тонкого органического синтеза химического факультет

Россия, 119991, Российская Федерация, Москва, Ленинские горы, д. 1

Список литературы