Antihypoxic properties of 2-ethylthiobenzimidazole succinate

Elena N. Selina; Селина Елена Николаевна; Irina B. Krylova; Крылова Ирина Борисовна; Andrey V. Lyubimov; Любимов Андрей Владимирович; Anton I. Orlov; Орлов Антон Иосифович; Ekaterina V. Maslovets; Масловец Екатерина Валентиновна; Petr D. Shabanov; Шабанов Петр Дмитриевич

doi:10.17816/RCF678948

Antihypoxic properties of 2-ethylthiobenzimidazole succinate

Authors: Selina E.N.¹, Krylova I.B.¹, Lyubimov A.V.¹, Orlov A.I.¹, Maslovets E.V.¹, Shabanov P.D.¹
Affiliations:
1. Institute of Experimental Medicine
Issue: Vol 23, No 3 (2025)
Pages: 287-293
Section: Original study articles
Submitted: 05.05.2025
Accepted: 08.10.2025
Published: 16.10.2025
URL: https://journals.eco-vector.com/RCF/article/view/678948
DOI: https://doi.org/10.17816/RCF678948
EDN: https://elibrary.ru/MMLAAH
ID: 678948

Cite item

Full Text

Open Access
Restricted Access

Access granted
Restricted Access

Subscription or Fee Access

Abstract
Full Text
About the authors
References
Statistics

Abstract

Background: 2-ethylthiobenzimidazole succinate (I) is a novel compound synthesized by analogy with Metaprot® (bemitil), a Russian-produced hydrobromide salt of 2-ethylthiobenzimidazole (II).

Aim: The work aimed to compare the antihypoxic effects of Compounds I and II in two models of normobaric hypoxia in mice.

Methods: Mice were randomized into eight groups (n = 8–12 per group) and exposed to normobaric hypoxia under two conditions: (1) in a jar test and (2) in a hypoxic chamber with a controlled gas composition, in which oxygen concentration was gradually reduced from 21% to 2% by nitrogen displacement. Compounds I and II were administered intraperitoneally once, 1 hour before hypoxia, at doses of 50 mg/kg and 100 mg/kg.

Results: In the jar test (hypercapnic hypoxia), both compounds significantly increased survival time by 13%–21%, with the 50 mg/kg dose being more effective. Under normobaric hypoxia with a variable gas composition, survival time at critical oxygen concentrations decreasing from 6% to 2% increased by 108% (from 8.2 to 17.0 min, p < 0.05) with Compound I and by 135% (to 19.3 min, p < 0.01) with Compound II. The threshold oxygen concentration tolerated by mice decreased from 4.56% in the control group to 3.23% after Compound I and to 2.97% after Compound II, corresponding to 71% and 65% of baseline values, respectively. The hypoxia-resistance score increased from 4.0 in controls to 8.8, corresponding to 220% (p < 0.01), and 9.5, corresponding to 238% (p < 0.001), after administration of Compounds I and II, respectively.

Conclusion: Compounds I and II at doses of 50 and 100 mg/kg exhibit a pronounced antihypoxic effect in two models of normobaric hypoxia in mice. The antihypoxic activity is comparable in magnitude for both compounds. The mechanism of the antihypoxic action of Compounds I and II appears to be similar and associated with the 2-ethylthiobenzimidazole moiety rather than with the anionic part of the molecule.

Keywords

antihypoxants, 2-ethylthiobenzimidazole, succinate, hydrobromide, jar test, normobaric hypoxia, mice

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

2-Этилтиобензимидазола сукцинат (соединение I) представляет собой новое химическое соединение, созданное по аналогии с выпускаемым отечественной промышленностью препаратом Метапрот® (бемитил), который является гидробромидной солью 2-этилтиобензимидазола (соединение II). Исходя из соображения структурного сходства с соединением II, которое обладает актопротекторными и антигипоксическими свойствами, предполагается, что соединение I может проявлять сходную фармакологическую активность, причем наличие сукцинатного аниона в его структуре потенциально может усилить его действие за счет активации SUCNR1 рецепторов. Сукцинатные рецепторы SUCNR1, ранее называемые GPR91, относятся к сопряженным с G-белком рецепторам (G-protein-coupled receptors) и активируются сукцинатом. Сукцинат-анион, образуемый из янтарной кислоты в процессе высвобождения протона (Н⁺), обеспечивая взаимодействие с SUCNR1, участвует во многих патологических процессах, включая ишемию, воспаление, ожирение, фагоцитоз, стрессогенные реакции и т. д. [1]. Однако, не исключено, что сукцинатные рецепторы реагируют только на высокие концентрации эндогенного сукцината [2]. Поэтому нельзя с уверенностью утверждать, что введение сукцината в молекулу потенциального антигипоксанта повышает его активность. Примером может служить наша работа по сравнению антигипоксических свойств ряда потенциальных антигипоксантов разной структуры с включением сукцината, которая не позволяет сделать однозначный вывод о потенцировании сукцинатом антигипоксических свойств соединений [3].

Цель исследования

Сравнение антигипоксических эффектов соединений I и II в двух моделях нормобарической гипоксии у мышей.

МЕТОДЫ

Эксперименты выполнены на белых беспородных мышах-самцах массой 20–22 г. Опыт включал 2 этапа: 1) изучение антигипоксической активности исследуемых соединений на модели нормобарической гипоксии с гиперкапнией в «баночной пробе» и 2) оценка их действия при нормобарической гипоксической гипоксии (НГГ) без гиперкапнии. Животные были рандомизированы на 8 групп, в каждой — по 8–12 мышей, которых подвергали нормобарической гипоксии: 1 — контроль I баночная гипоксия (БГ); 2 — БГ+соединение I 50 мг/кг; 3 — БГ+соединение I 100 мг/кг; 4 — БГ+соединение II 50 мг/кг; 5 — БГ+соединение II 100 мг/кг; 6 — контроль II (НГГ в гипоксической камере); 7 — НГГ+соединение I 100 мг/кг; 8 — НГГ+соединение II 100 мг/кг. Исследуемые соединения растворяли в 0,9% растворе натрия хлорида с добавлением твина-80 и вводили однократно внутрибрюшинно (в/б) в заявленных дозах за 1 ч до гипоксического воздействия. Дозы соединений выбраны на основе описанных максимальных антигипоксических эффектов 2-этилтиобензимидазола [4, 5]. Контрольным животным вводили равный объем растворителя.

БГ воспроизводили путем помещения мышей в индивидуальные стеклянные камеры объемом 0,25 л, которые герметически закрывали, переворачивали и опускали в воду на высоту крышки, чтобы избежать подсоса воздуха. Регистрировали продолжительность жизни животных в минутах.

НГГ создавали у мышей с помощью герметичной газовой камеры для лабораторных исследований (КГЭЛ-1 ООО «НИИ ГЕРОПРО», Россия) в комплекте с устройством для очистки газовой среды от СО₂ и блоком автоматического контроля, управления и поддержания состава гипоксической среды в камере БК ГС «Дупло-мини» производства (ООО «НИИ ГЕРОПРО», Россия). Камера позволяет моделировать НГГ, снижая концентрацию кислорода в газовой смеси с 21 до 2% путем вытеснения его азотом. Снижение концентрации кислорода осуществляли в два приема: вначале автоматическим постепенным уменьшением концентрации кислорода с 21 до 6%, а затем ступенчато с 6 до 2%, путем снижения на 1% на каждой последующей площадке и содержанием животных на каждой из них в течение 5 мин.

Гипоксическая камера позволяла одновременно помещать в нее мышей контрольной и опытных групп. Антигипоксическую активность препаратов оценивали по следующим параметрам [6, 7]: 1) продолжительность жизни в минутах (время от помещения животного в камеру до момента его гибели); 2) продолжительность жизни при критических концентрациях кислорода в мин (время от начала пребывания на площадке 6% кислорода до гибели животного); 3) выживаемость мышей при различных концентрациях кислорода (6 → 2%); 4) пороговая концентрация кислорода (ПКК) в процентах, при которой наступала гибель животного, определялась по формуле: ПКК=А–(Б/300), где: А — концентрация кислорода площадки, на которой зафиксировано агональное дыхание животного; Б — продолжительность жизни животного на площадке в секундах; 300 — длительность нахождения животного на площадке в секундах; 5) устойчивость к гипоксии по критерию ПКК (выражали в баллах путем присвоения 1 балла каждому временному промежутку пребывания на площадке длительностью 100 с. Например, при 6% кислорода, если мышь жила 100 с, присваивали 1 балл, если 200 с — 2 балла, если 300 с — 3 балла. При 5% кислорода эти данные составляли 4, 5 и 6 баллов соответственно, при 4% кислорода — 7, 8 и 9 баллов соответственно, при 3% кислорода — 10, 11 и 12 баллов соответственно, наконец, при 2% кислорода — 13, 14 и 15 баллов соответственно).

Все эксперименты были выполнены в соответствии с правилами, указанными в Директиве Европейского сообщества (2010/63/ЕС), Хельсинкской декларацией о гуманном отношении к животным (редакция 2000 г.), Женевской конвенцией «International Guiding Principals for Biomedical Involving Animals» (Geneva, 1990).

Статистические методы

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ GraphPad Prism 6. Сравнение экспериментальных групп выполняли с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA и t-критерия Стьюдента. Различия между группами считали статистически значимыми при p <0,05. Данные представлены в виде среднего арифметического и стандартной ошибки (M±SEM).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Полученные результаты свидетельствуют, что в условиях БГ соединение I в дозах 50 и 100 мг/кг значимо увеличивало продолжительность жизни мышей по сравнению с контролем на 21% (p=0,0309) и 13% (p=0,0182) соответственно. Продолжительность жизни мышей под действием соединения II в дозе 50 мг/кг значимо (p=0,0232) отличалась от контроля и превышала контрольные показатели на 16%. В дозе 100 мг/кг соединение II не оказывало антигипоксического эффекта. Разница между эффективностью соединений I и II была незначима (рис. 1).

Рис. 1. Влияние соединений I и II на продолжительность жизни мышей в условиях баночной пробы. Группы животных: 1 — контроль (гипоксия); 2 — гипоксия + соединение I 50 мг/кг; 3 — гипоксия+соединение I 100 мг/кг; 4 — гипоксия+соединение II 50 мг/кг; 5 — гипоксия+соединение II 100 мг/кг. * p <0,05 в сравнении с контролем.

На 2-м этапе исследований оценивали антигипоксическое действие соединений I и II в гипоксической камере. Продолжительность жизни мышей после в/б введения соединения I увеличивалась на 46%, а после соединения II — на 58%, статистических различий между этими значениями не отмечали (рис. 2).

Рис. 2. Влияние соединений I и II на продолжительность жизни мышей в условиях нормобарической гипоксической гипоксии. Группы животных: 1 — контроль (гипоксия); 2 — гипоксия+соединение I 100 мг/кг; 3 — гипоксия+соединение II 100 мг/кг. * p <0,05 в сравнении с контролем.

Время жизни животных при критических концентрациях кислорода, уменьшающихся от 6 до 2%, в этих группах соответственно увеличивалось на 108% (с 8,2±1,1 мин до 17,0±1,7 мин, р <0,05) после введения соединения I и на 135% (до 19,3±2,2 мин, р <0,01) после введения соединения II. Пороговая концентрация кислорода, до которой доживали мыши, напротив, снижалась с 4,56±0,16% в контроле до 3,23±0,26% после введения соединения I и до 2,97±0,30% — соединения II, то есть соответственно до 71±6% и 65±7% от исходных значений. Наконец, оценка устойчивости к гипоксии в баллах менялась с 4,0±0,5 в контроле до 8,8±0,7, что составило 220±18% (р <0,01) после введения соединения I, и до 9,5±0,8 баллов, что составило 238±20% (р <0,001) после введения соединения II. Подтверждением этой закономерности стали показатели выживаемости мышей на площадках с различной концентрацией кислорода (рис. 3).

Рис. 3. Выживаемость мышей на площадках с различной концентрацией кислорода в условиях нормобарической гипоксической гипоксии. 1 — контроль (гипоксия); 2 — гипоксия+соединение I 100 мг/кг; 3 — гипоксия+соединение II 100 мг/кг.

Следовательно, оба соединения (I и II) проявляют антигипоксическую активность в моделях БГ и НГГ на мышах при однократном использовании в дозах 50 и 100 мг/кг. Эти результаты подтверждаются по ряду характеристик, особенно в модели НГГ, позволяющей оценить не только выживаемость животных, но и другие параметры антигипоксической активности при дозированной нормобарической гипоксии.

ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнение антигипоксической активности двух солей 2-этилтиобензимидазола — соединения I (сукцинат) и соединения II (гидробромид) показало, что оба соединения проявляют заявленные свойства в двух моделях гипоксии — БГ и НГГ на мышах. Степень защиты от гипоксии колеблется в пределах +16–21% (р <0,05) в случае БГ и +46–135% (р <0,01) при НГГ. При этом соединение II по ряду показателей выглядит более активным, чем соединение I, хотя статистически значимых различий между ними в рамках настоящих исследований ни по одному из показателей не выявлено.

Прежде всего необходимо отметить, что в модели БГ у обоих соединений антигипоксический эффект был выше в дозе 50 мг/кг. Возможно, это связано с тем, что доза 100 мг/кг превышает 1/10 LD₅₀ (для мышей LD₅₀ соединения II составляет 650 мг/кг [5], в наших предварительных опытах — 450±35 мг/кг). Не исключено, что антигипоксическое действие обоих соединений может частично нивелироваться токсическим эффектом.

Проводить сравнение полученных нами данных в отношении антигипоксической активности соединений I и II с результатами других исследований сложно. Увеличение продолжительности жизни мышей по отношению к контролю в них колеблется от 0 до 70% и зависит от дозы соединения, способа введения и лаборатории, где проводили исследование, точнее, где осуществляли его химический синтез (табл. 1).

Таблица 1. Оценка антигипоксической активности соединения II по продолжительности жизни мышей в модели баночной гипоксии по данным разных авторов

Доза соединения II, способ введения	Продолжительность жизни в процентах к контролю	Город, учреждение	Источник химического соединения	Ссылка
50 мг/кг в/б однократно	+70%	Смоленск, СГМА	Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург	[8]
50 мг/кг в/б однократно	+5%	Уфа, БГМУ	Башкирский государственный медицинский университет, Уфа	[9]
50 мг/кг в/б однократно 100 мг/кг в/б однократно	0% +22%	Москва, Институт медико-биологических проблем РАН	Институт медико-биологических проблем РАН, Москва	[10]
50 мг/кг внутрь, 10 дней	+16%	Санкт-Петербург, СЗГМУ им. И.И. Мечникова	ЗАО «Сотекс», Москва	[11]
50 мг/кг однократно 100 мг/кг 200 мг/кг	0% +46% +95%	Беларусь, БГМУ, Минск	Белорусский государственный медицинский университет, Минск	[12]

Не исключено, что такой разброс может быть связан с разными условиями проведения эксперимента: временем года, возрастом и линией животных, объемом гермокамеры, временем введения, чистотой используемого вещества и другими внешними факторами. Ссылок на работу с соединением I в базах данных не найдено.

Возвращаясь к предисловию, в котором мы позиционировали соединение I как потенциально активное не только за счет самой молекулы 2-этилтиобензимидазола, но и за счет сукцината, следует пояснить логику наших рассуждений. Известно, что янтарная кислота и ее соли в водном растворе диссоциируют, в нашем случае соединение I с высвобождением сукцинат-аниона, а соединение II — с выделением анионов Br ^–. Условно можно связать антигипоксическое действие соединения I именно с сукцинат-анионом, ведь многие сукцинатсодержащие соединения проявляют, в том числе, и антигипоксические свойства [13]. В качестве примера приведем работу [14], в которой сравнивали эффективность лечения астенического симптомокомплекса у хирургических пациентов и пострадавших с сочетанными травмами, а также у больных с невротическими и стрессогенными расстройствами с помощью сукцинатнесодержащих и сукцинатсодержащих метаболических протекторов (Эмоксипин/Мексикор, Рибоксин/Цитофлавин®, Метапрот®/Метапрот® плюс). Было найдено, что сукцинатсодержащие препараты (Мексикор, Цитофлавин®, Метапрот® плюс) были более эффективны в устранении астении у больных в сравнении с сукцинатнесодержащими препаратами (Эмоксипин, Рибоксин, Метапрот®). И хотя понятие астенического синдрома не включает прямого антигипоксического действия, исключить антигипоксический компонент в нормализации соматических и нервно-психических функций рассматриваемых контингентов больных не представляется возможным.

Действие самого сукцинат-аниона может рассматриваться по крайней мере с двух позиций. Первая из них заключается в метаболическом действии, связанном с включением в цикл трикарбоновых кислот, где сукцинат является одним из интермедиатов. Такой механизм можно допустить, однако проникающая способность сукцината достаточно невелика, поэтому его свойство оптимизировать энергетический обмен за счет метаболического эффекта ограничен. В то же время в условиях гипоксии сукцинат способен активировать глюконеогенез, альтернативный путь образования глюкозы из недоокисленных продуктов распада, важный при кислородном голодании. Второй механизм заключается в прямой активации рецепторов SUCNR1, расположенных на внешней поверхности мембран клеток, хотя для этого необходима достаточно высокая концентрация сукцината [2, 15]. Учитывая, что различия в величине антигипоксического эффекта соединения I и II в наших опытах были незначительными, все же следует считать, что их антигипоксическое действие обусловлено самой молекулой 2-этилтиобензимидазола, а не ее анионной частью.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Соединения I и II в дозах 50 и 100 мг/кг оказывают выраженный антигипоксический эффект в двух моделях нормобарической гипоксии у мышей, при этом антигипоксическое действие сравнимо по величине у обоих соединений.

Механизм антигипоксического действия соединений I и II, по-видимому, сходный и связан с молекулой 2-этилтиобензимидазола, нежели с анионной частью молекулы.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Е.Н. Селина, И.Б. Крылова, А.В. Любимов — проведение экспериментов, анализ данных, написание статьи; А.И. Орлов, Е.В. Масловец — синтез соединений, П.Д. Шабанов — разработка общей концепции, написание статьи. Авторы одобрили версию для публикации, а также согласились нести ответственность за все аспекты работы, гарантируя надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой ее части.

Этическая экспертиза. Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом Института экспериментальной медицины (протокол № 2/23 от 15.06.2023).

Источники финансирования. Исследование выполнено в рамках государственного задания Минобрнауки России FGWG-2025-0020 «Поиск молекулярных мишеней для фармакологического воздействия при аддиктивных и нейроэндокринных нарушениях с целью создания новых фармакологически активных веществ, действующих на рецепторы ЦНС».

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Оригинальность. При создании настоящей работы авторы не использовали ранее опубликованные сведения (текст, данные, иллюстрации).

Доступ к данным. Все данные, полученные в настоящем исследовании, представлены в статье.

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали.

Рассмотрение и рецензирование. Настоящая работа подана в журнал в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре. В рецензировании участвовали два внешних рецензента, член редакционной коллегии и научный редактор издания.

ADDITIONAL INFO

Author contributions: E.N. Selina, I.B. Krylova, A.V. Lyubimov: investigation, formal analysis, writing—original draft, writing—review & editing; A.I. Orlov, E.V. Maslovets: resources; P.D. Shabanov: conceptualization, writing—original draft, writing—review & editing. All authors made significant contributions to the conception, conduct of the study and preparation of the article, and read and approved the final version before publication.

Ethics approval: The study was approved by the local ethics committee of the Institute of Experimental Medicine (protocol No. 2/23 dated Jun 15, 2023).

Funding sources: This study was part of the state assignment of the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation (FGWG-2025-0020), “Search for Molecular Targets for Pharmacological Intervention in Addictive and Neuroendocrine Disorders to Develop New Pharmacologically Active Compounds Acting on CNS Receptors.”

Disclosure of interests: The authors have no relationships, activities, or interests for the last three years related to for-profit or not-for-profit third parties whose interests may be affected by the content of the article.

Statement of originality: No previously obtained or published material (text, or data) was used in this study or article.

Data availability statement: All data obtained in this study are available in this article.

Generative AI: No generative artificial intelligence technologies were used to prepare this article.

Provenance and peer-review: This paper was submitted unsolicited and reviewed following the standard procedure. The peer review process involved two external reviewer, a member of the Editorial Board, and the in-house scientific editor.