Иммунотропные свойства полисахаридов, выделенных из побегов боярышника алма-атинского (Crataegus almaatensis Pojark.) и боярышника мягковатого (Crataegus submollis Sarg.)

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Род боярышника (Crataegus spp.) включает в себя более 380 видов и огромное количество форм и гибридов, только в России выделено около 50 видов и свыше 100 интродуцировано [1, 2]. Плоды, листья и цветы боярышника издавна используются в традиционной медицине для лечения астмы, бессонницы, гриппы, кашля и бронхита, головной боли, респираторных и сердечно-сосудистых заболеваний [3, 4, 5]. Показано также, что боярышник оказывает противодиабетическое, противомикробное, противовирусное, противовоспалительное, антитромботическое, антигиперлипидемическое, кардиоактивное, гепатопротекторное и гипотензивное действие [6, 7]. Многочисленные биохимические исследования показали, что боярышник является ценным источником биологически активных компонентов (минералов, сахарных спиртов, фенольных кислот, эфирного масла, органических кислот, дубильных веществ, витаминов, флавоноидов и полисахаридов) [7, 8]. Полисахариды и олигосахариды, экстрагированные из плодов и цветков различных видов Crataegus spp. проявляют антикоагулянтное и гиполипидемическое действие [8, 9]. Кроме этого, были продемонстрированы антиоксидантные и пробиотические свойства полисахаридов, экстрагированных из C. pinnatifida и C. azarolus [10, 11]. Однако в научной литературе практически отсутствуют сведения об иммунотропном действии полисахаридов, извлеченных из различных видов боярышника. Таким образом, представляется актуальным изучение влияния полисахаридов, выделенных из побегов боярышника алма-атинского и боярышника мягковатого на гуморальный и клеточный иммунный ответ и функциональную активность иммунокомпетентных клеток в эксперименте.

Цель исследования – изучение иммунотропного действия водорастворимых полисахаридов (ВРПС), выделенных из побегов боярышника алма-атинского (Crataegus almaatensis Pojark.) и боярышника мягковатого (Crataegus submollis Sarg.).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительными источниками полисахаридов являлись побеги двух видов рода Сrataegus L. – боярышника мягковатого Crataegus submollis Sarg. и боярышника алма-атинского Crataegus almaatensis Pojark. Побеги C. submollis заготовлены от культивируемых в Республике Башкортостан растений, побеги С. almaatensis – от дикорастущих растений в Кыргызской Республике в период цветения растений в 2020-22 гг. Собранное растительное сырье представляло собой верхушки побегов, содержащие также зеленые стебли, в том числе листья и соцветия. Для идентификации дикорастущего вида C. аlmaatensis использован определитель видов [12]. Побеги собирали с 10-15 летних деревьев вручную, срезая годичные побеги, сушили методом воздушно-теневой сушки, далее помещали в бумажные пакеты и хранили при температуре не выше 25°С и при влажности не выше 65%. 

Для выделения полисахаридов навеску сырья (10,0 г) заливали 200 мл воды очищенной (1:20) с рΗ=3,0 (подкисляли хлористоводородной кислотой), нагревали на кипящей водяной бане в течение 2 часов при периодическом перемешивании. Далее оставляли для охлаждения до комнатной температуры и отфильтровывали под вакуумом. Фильтрат упаривали на роторном испарителе при температуре не более 45°С до 50 мл. Сгущенный раствор приливали к 150 мл спирта этилового (1:3) (об. 96%) и оставляли на 12 часов при 4°С. Отстоявшийся раствор центрифугировали (10 минут 4400 об/мин), промывая 96%-ным спиртом этиловым. Затем осадок растворяли в 100 мл воды очищенной при быстром перемешивании на магнитной мешалке при комнатной температуре. Полученный раствор вновь центрифугировали (20 минут 4400 об/мин) и упаривали до 50 мл, диализировали с использованием полупроницаемой мембраны SnakeSkin^ТМ (Thermo Scientific, США) с размером пор 3,5 кДа в течение 48 часов против воды очищенной при комнатной температуре, заменяя воду на свежую каждые 12 часов. После диализа раствор замораживали и высушивали на лиофилизаторе IlShin BioBase MCFD8508 (Roshtec Life Science, Индия).

Для химической характеристики полисахаридов определяли содержание гексоз, уроновых кислот и примесей белка спектрофотометрическими методами [13, 14].

В экспериментах in vivo использовали 80 мышей-самцов линии C57BL/6 в возрасте 6-8 недель, массой 19-23 г. Случайным образом были сформированы 8 экспериментальных групп по 10 животных в каждой: 2 группы контроля (для исследования гуморального и клеточного иммунного ответа) получали внутрибрюшинно физиологический раствор в объеме 0,2 мл в течение 10 суток, 2 группы мышей – ВРПС из побегов боярышника алма-атинского в дозе 10 мг/кг (доза была подобрана в предварительных экспериментах), 2 группы мышей – ВРПС из побегов боярышника мягковатого в дозе 10 мг/кг, 2 группы животных получали препарат сравнения – глюкозаминилмурамилдипептид (ГМДП) в дозе 2 мг/кг (Ликопид, АО ПЕПТЕК, Россия).

В качестве источника перитонеальных макрофагов и спленоцитов в экспериментах in vitro использовали 48 мышей-самок линии C57BL/6 в возрасте 6-8 недель, массой 18-22 г. Все животные были  получены из отдела экспериментальных биологических моделей НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ (протокол биоэтического комитета НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга № 227012024 от 01.02.2024). Все процедуры (содержание, введение исследуемого вещества, умерщвление) проведены в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета ЕС по охране животных, используемых в научных целях, ГОСТ 34088-2017 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными».

Гуморальный иммунный ответ моделировали у мышей однократной внутрибрюшинной инъекцией 5´10⁷ эритроцитов барана (ЭБ) (ЗАО ЭКОлаб, Россия). Исследуемые полисахариды в объёме 0,2 мл вводили внутрибрюшинно за 5 дней до и 5 дней после иммунизации. Животных забивали на 5-е сутки после иммунизации эритроцитами барана, селезёнки извлекали, измельчали в стеклянном гомогенизаторе, после чего клеточную взвесь фильтровали через 4-слойный капрон, трижды промывали холодным физиологическим раствором (ФР) (ООО Гротекс, Россия), ресуспендировали в 4 мл среды 199 (ООО НПП ПанЭко, Россия) и подсчитывали количество жизнеспособных клеток. В пробирки, предварительно нагретые до 49-53°С, вносили 0,9 мл среды культивирования (среда 199 и 0,7% агар Difco, США), 0,2 мл 20%-ой взвеси эритроцитов барана, 0,2 мл взвеси спленоцитов и 0,1 мл комплемента (ФГУП НПО Микроген, Россия). После ресуспендирования данной смесью заполняли камеры Горяева, помещали их во влажную камеру, инкубировали 2 ч при 37°С, затем подсчитывали зоны гемолиза при помощи светового микроскопа. Каждая зона гемолиза соответствовала антителообразующей клетке (АОК). Уровень гемагглютининов в сыворотке крови определяли по способности антител, содержащихся в сыворотке крови иммунизированных животных, агглютинировать эритроциты барана, используемые в качестве антигена. Для этого сыворотку крови мышей, полученную на 5-е сутки после иммунизации, прогревали при 56°С 30 мин (для инактивации комплемента), вносили по 0,05 мл в 96-луночный круглодонный планшет, раститровывали с шагом 1/2, добавляли 0,025 мл 1% суспензии эритроцитов барана, инкубировали при 37ºС 2 часа, затем оценивали реакцию. За титр принимали последнее разведение исследуемой сыворотки, при котором ещё наблюдается агглютинация антигена. Титр выражали величиной log₂Т.

Клеточный иммунный ответ мышей оценивали по интенсивности реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), индуцированную подкожным введением эритроцитов барана (1х10⁷). Исследуемые полисахариды в объёме 0,2 мл вводили внутрибрюшинно за 5 дней до и 5 дней после первого введения ЭБ. На 5-е сутки после иммунизации эритроцитами барана животным проводили вторую (разрешающую) инъекцию ЭБ (1,0´10⁸ эритроцитов барана в 0,05 мл ФР) в подушечку задней лапы – опытная лапа. В контрлатеральную лапу вводили 0,05 мл стерильного ФР (контрольная лапа). Местную воспалительную реакцию оценивали через 24 ч по разнице массы опытной (Мо) и контрольной (Мк) лап. Животных забивали, обе лапы отрезали по выступу кости ниже сочленения мало- и большеберцовой кости и выше пяточного сустава. Величину реакции оценивали как разницу массы между контрольной и опытной лапой и выражали в мг.

В опытах in vitro ВРПС добавляли в культуру клеток в концентрации 20 мкг/мл, предварительно растворяя в полной культуральной среде (ПКС) следующего состава: RPMI 1640 (Sigma, США), 10% эмбриональной телячьй сыворотки (ЭТС, Cytiva, США), 20 мМ HEPES (Sigma, США), 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола (Sigma, США), смесь антибиотиков (препарат Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B, 100X, MP Biomedicals, США) и 2 мМ L-глютамина (Sigma, США).

Перитонеальные макрофаги (МФ) получали промыванием брюшной полости мышей ледяным ФР. Из полученной клеточной взвеси выделяли зрелые макрофаги с помощью набора EasySep™ Biotin Positive Selection Kit и антител специфических к макрофагальным рецепторам Anti-Mouse F4/80 Antibody (STEM CELL, США). Перитонеальные МФ (2,5-3,0×10⁶ клеток/мл) культивировали в ПКС в 96-луночных плоскодонных планшетах 48 ч при 37°С в атмосфере с 5% СО₂ и абсолютной влажности с добавлением ВРПС боярышника алма-атинского и боярышника мягковатого (20 мкг/мл), либо стандартного активатора макрофагов – липополисахарида (ЛПС) E.coli (1 мкг/мл, серотип О111:В4, Sigma, США). При изучении пролиферативной активности перитонеальных МФ клетки культивировали 72 ч в вышеуказанных условиях, а при исследовании продукции цитокинов – 24 ч.

Продукцию NO оценивали по содержанию нитритов в супернатантах МФ при помощи реактива Грисса (Sigma-Aldrich, США) [15]. Реактив (0,1 мл) смешивали с эквивалентным объёмом надосадка, абсорбцию замеряли с использованием многоканального спектрофотометра Titertek Multiskan® MCC (Labsystems, Финляндия) при длине волны 540 нм. Концентрацию нитритов определяли по калибровочной кривой, построенной с использованием стандартных растворов нитрита натрия.

Активность аргиназы определяли по методике M. Munder и соавт. (1998) в нашей модификации в клеточном лизате перитонеальных МФ по величине концентрации мочевины с помощью тест-системы «Мочевина-450» (Био-ЛА-Тест, Erba Rus, Россия) согласно приложенному к тест-системе протоколу с использованием многоканального спектрофотометра Titertek Multiskan® MCC (Labsystems, Финляндия) при длине волны 540 нм [16, 17]. За 1 единицу активности (ЕА) фермента принимали количество аргиназы, катализирующей образование 1 мкМ мочевины в минуту.

Для изучения возможной примеси эндотоксина в исследуемых образцах полисахаридов в 96-луночный плоскодонный планшет помещали исследуемые образцы полисахаридов или 1 мкг/мл ЛПС (в качестве контроля метода) и полимиксин Б (InvivoGen, США) в концентрации 10 мкг/мл, инкубировали в ПКС при 37°С в атмосфере с 5% СО₂ и абсолютной влажности в течение 1 ч. Затем в лунки добавляли перитонеальные макрофаги (2,5-3,0×10⁶ клеток/мл), культивировали 48 ч в указанных выше условиях, собирали из лунок надосадок и определяли концентрацию в нём нитритов.

Оценку пролиферации перитонеальных МФ колориметрическим методом проводили при помощи 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, Sigma, США), растворяя осадок диметилсульфоксидом (Sigma, США) по окончании инкубации клеток с изучаемыми веществами [18]. Абсорбцию полученных растворов замеряли при помощи многоканального спектрофотометра Titertek Multiskan® MCC (Labsystems, Финляндия) при длине волны 540 нм. Значения показателя пролиферативной активности клеток выражали в единицах оптической плотности.

Спленоциты мышей получали двукратной отмывкой ФР гомогената селезёнки. Селезёнки извлекали, измельчали в стеклянном гомогенизаторе, клеточную взвесь фильтровали через 4-слойный капрон, дважды промывали холодным ФР, ресуспендировали в ПКС и инкубировали в ПКС 24 ч без и с добавление конканавалина А (КонА, 4 мкг/мл, Sigma, США).

Для определения числа клеток в суспензии и их жизнеспособности использовали 0,1% раствор трипанового синего, применяемого для селективного окрашивания мертвых клеток. Число клеток определяли в камере Горяева при помощи светового микроскопа. Для постановки экспериментов использовали суспензии клеток, жизнеспособность которых превышала 90%.

Концентрацию цитокинов ИЛ-1β, ФНО-α, ИЛ-2, ИФН-γ определяли иммуноферментным методом в супернатантах макрофагов и спленоцитов после 24 часовой инкубации при помощи тест-систем согласно прилагаемым протоколам (InvitroGen, США).

Полученные в ходе исследования данные обрабатывали с помощью пакета статистических программ Statistica 13.3, используя критерий Шапиро-Уилка для проверки нормальности распределения, однофакторный дисперсионный анализ и критерий Даннета. Результаты представлены в виде M±SEM, где M  – среднее значение; SEM – стандартная ошибка среднего. Уровень статистической значимости различий p < 0,05, объем выборки n = 10.

Результаты

Полисахариды, выделенные из побегов боярышника алма-атинского  и боярышника мягковатого, по содержанию уроновых кислот (более 30%) можно отнести к кислым водорастворимых полисахаридам, содержание примесей белка не превышало 10 % в обоих образцах (табл. 1). Сравнительный анализ результатов не выявил значимых отличий в химическом составе полисахаридов изучаемых видов.

Таблица 1. Химическая характеристика водорастворимых полисахаридов, выделенных из побегов боярышника алма-атинского (CrАl) и боярышника мягковатого (CrSu) (M±SEM)

Table 1. Chemical characteristics of water-soluble polysaccharides isolated from shoots of Alma-Ata hawthorn (CrАl) and soft hawthorn (CrSu) (M±SEM)

Источник полисаха-ридов	Выход полисаха-ридов, % (в пересчете на воздушно сухое сырье)	Гексозы, %		Уроновые кислоты, %		Белок, %
		Фенол-серный метод	Антрон-серный метод	3,5-диметил-фенол-серный метод	Карбазол-серный метод
CrAl	1,76±0,05	52,47±4,30	39,25±1,48	32,23±0,75	34,94±0,76	6,10±0,93
CrSu	1,33±0,12	41,53±7,10	25,73±0,60	36,09±1,06	38,40±1,00	8,47±2,20

 

Курсовое введение ВРПС, выделенных из побегов боярышника алма-атинского и боярышника мягковатого, вызывало достоверное увеличение общего количества спленоцитов и числа антителообразующих клеток в селезенках иммунизированных мышей по сравнению с соответствующими показателями контрольной группы, а в группе животных, получивших полисахариды боярышника алма-атинского курсом, наблюдалось к тому же статистически значимое повышение АОК и относительно значения в группе сравнения (табл. 2). Однако повышение числа АОК не сопровождалось усилением их функциональной активности – титр специфических гемагглютининов в сыворотке крови мышей, получивших курсом исследуемые полисахариды, достоверно не отличался от показателя в группе

Таблица 2. Влияние водорастворимых полисахаридов, выделенных из побегов боярышника алма-атинского (ВРПС CrАl) и боярышника мягковатого (ВРПС CrSu), на гуморальный и клеточный иммунный ответ мышей линии C57BL/6 (M±SEM)

Table 2. Effect of water-soluble polysaccharides isolated from shoots of hawthorn Alma-ata hawthorn (WSPS CrAl) and soft hawthorn (WSPS CrSu) on the humoral and cellular immune response of C57BL/6 mice (M±SEM)

Исследуемое вещество	Общее количество спленоцитов, млн	Количество АОК, тыс./селезёнка	Титр антител, log2T	Величина реакции ГЗТ, мг
Контроль (ФР)	195,20±12,10	201,14±23,93	5,40±0,24	16,86±0,91
ГМДП (2 мг/кг)	279,04±25,55*	315,43±25,34*	4,20±0,20*	20,43±1,17*
ВРПС CrАl (10 мг/кг)	318,08±19,74*	406,86±34,46*●	4,80±0,37	15,00±1,31●
ВРПС CrSu (10 мг/кг)	262,40±4,53*	323,43±33,21*	5,20±0,20●	14,57±1,53●

Примечание. * р<0,05 к группе контроля; ^● – р<0,05 к группе сравнения (ГМДП).

Note.  * p<0.05 to control group; ^● – р<0,05 to comparison group (GMDP).

контроля. Также, применение ВРПС, выделенных из побегов боярышника алма-атинского и

боярышника мягковатого, курсом не оказывало влияния на клеточный иммунный ответ – величина реакции ГЗТ была на уровне контрольных значений, а по сравнению с группой сравнения отмечалось даже снижение исследуемого показателя (табл. 2).

Оценка NO-активирующих свойств происходила в эксперименте с использованием полисахаридов, экстрагированных из побегов боярышника алма-атинского и боярышника мягковатого, с концентрацией 20 мкг/мл (табл. 3). ЛПС был использован в качестве стандартного активатора МФ (контроль 2). Он увеличивал продукцию оксида азота в 19,1

Таблица 3. Влияние водорастворимых полисахаридов, выделенных из побегов боярышника алма-атинского (ВРПС CrАl) и боярышника мягковатого (ВРПС CrSu), на продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами в отсутствии и присутствии полимиксина Б и пролиферацию перитонеальных макрофагов интактных мышей линии C57BL/6 (M±SEM)

Table 3. Effect of water-soluble polysaccharides isolated from shoots of Alma-ata hawthorn (WSPS CrAl) and soft hawthorn (WSPS CrSu) on the production of nitric oxide by peritoneal macrophages in the absence and presence of polymyxin B and the proliferation of peritoneal macrophages in intact C57BL/6 mice (M±SEM)

Исследуемое вещество	Концен-трация, мкг/мл	Пролиферация, ед. опт. плотности, 10-3	Концентрация нитритов, мкМ
			без полимиксина Б	с полимиксином Б
ПКС (контроль 1)	–	521±11	5,53±0,22	5,28±0,13
ЛПС (контроль 2)	1	471±6	105,61±0,64*	15,10±0,10*▲
ВРПС CrАl	20	463±10	110,44±0,12*#	105,04±0,69*#▲
ВРПС CrSu	20	454±11	115,34±0,75*#	116,23±0,21*#

Примечание. * р<0,05 к группе контроль 1; # р<0,05 к группе контроль 2; ^▲ р<0,05 к группе без полимиксина Б; n (количество выборки на каждую группу) = 10. Концентрация полимиксина Б 50 мкМ.

Note. * p<0.05 to control group 1; # p<0.05 to control group 2; ^▲ р<0,05 to group without polymyxin B;  n (number of samples for each group)=10. Polymyxin B concentration is 50 μM.

раза. Под влиянием полисахаридов боярышника алма-атинского, продукция оксида азота возрастала в 20 раз. Полисахариды, выделенные из побегов боярышника мягковатого, усиливали продукцию оксида азота в 20,9 раз. Обнаруженный эффект был на уровне с активацией макрофагов ЛПС.

Растительные полисахариды могут содержать бактериальный эндотоксин – ЛПС, что является нежелательным и ограничивает дальнейшее использование веществ в инъекционных лекарственных формах. Значимым преимуществом полисахаридов, экстрагируемых из растительного сырья, является отсутствие бактериального эндотоксина. В связи с этим, был проведен эксперимент по выявлению примеси ЛПС.

Для обнаружения примеси бактериального эндотоксина были использованы полисахариды с концентрацией 20 мкг/мл. При добавлении полимиксина Б к ЛПС-стимулированному контролю, продукция оксида азота снижалась в 7 раз. Внесение полимиксина Б к ВРПС, выделенных из побегов боярышника мягковатого, несущественно изменяло продукцию оксида азота, что свидетельствует об отсутствии примеси эндотоксина в исследуемых полисахаридах. Добавление полимиксина Б к полисахаридам, извлеченных из побегов боярышника алма-атинского, достоверно снижало выработку NO перитонеальными макрофагами, однако не столь существенно, как в случае совместной инкубации полимиксина Б и ЛПС.

Не было зафиксировано статистически значимого изменения пролиферации перитонеальных макрофагов мышей под действие исследуемых ВРПС, по сравнению с контролем, что свидетельствует об отсутствия цитотоксического эффект изучаемых полисахаридов (табл. 3).

При изучении аргиназной активности в лизатах макрофагов было выявлено, что в культурах клеток с добавлением ЛПС и растительных полисахаридов, активность аргиназы была достоверно снижена по сравнению с показателем в группе интактных клеток (контроль 1). В культуре клеток с добавлением ЛПС, активность аргиназы снижалась в 1,2 раза. А при добавлении полисахаридов боярышника алма-атинского и мягковатого, аргиназная активность в макрофагах снижалась в 2 и 1,7 соответственно (табл. 4).

Таблица 4. Влияние водорастворимых полисахаридов, выделенных из побегов боярышника алма-атинского (ВРПС CrАl) и боярышника мягковатого (ВРПС CrSu), на активность NO-синтазы (продукция нитритов) и аргиназы (ферментация мочевины) в перитонеальных макрофагах интактных мышей линии C57BL/6, (M±SEM)

Table 4. Effect of water-soluble polysaccharides isolated from shoots of Alma-ata hawthorn (WSPS CrAl) and soft hawthorn (WSPS CrSu) on the activity of NO synthase (nitrite production) and arginase (urea fermentation) in peritoneal macrophages of intact C57BL/6 mice, (M±SEM)

Исследуемое вещество	Концентрация, мкг/мл	Концентрация нитритов, мкМ	Активность аргиназы, ЕА
ПКС (контроль 1)	–	3,66±0,04	85,33±0,19
ЛПС (контроль 2)	1	61,27±0,20*	71,06±0,21*
ВРПС CrАl	20	73,38±0,57*#	43,27±0,11*#
ВРПС CrSu	20	63,15±0,58*	49,53±0,24*#

Примечание. * р<0,05 к группе контроль 1; #  р<0,05 к группе контроль 2; n=10.

Note. * p<0.05 to control group 1; # p<0.05 to control group 2; n=10.

При добавлении ВРПС, выделенных из побегов боярышника алма-атинского и боярышника мягковатого, в культуру перитонеальных макрофагов интактных мышей линии C57BL/6 наблюдалось достоверное повышение продукции ИЛ-1β и ФНО-α как по сравнению с соответствующими показателями выработки цитокинов макрофагами, культивируемых в ПКС, так и при добавлении митогена – ЛПС (табл. 5).

Таблица 5. Влияние водорастворимых полисахаридов, выделенных из побегов боярышника алма-атинского (ВРПС CrАl) и боярышника мягковатого (ВРПС CrSu), на продукцию ИЛ-1β и ФНО-α перитонеальными макрофагами интактных мышей линии C57BL/6, (M±SEM)

Table 5. Effect of water-soluble polysaccharides isolated from shoots of Alma-ata hawthorn (WSPS CrAl) and soft hawthorn (WSPS CrSu) on the production of IL-1β and TNF-α by peritoneal macrophages of intact C57BL/6 mice, (M±SEM)

Исследуемое вещество	Концентрация, мкг/мл	Концентрация ИЛ-1β, пг/мл	Концентрация ФНО-α, пг/мл
ПКС (контроль 1)	–	39,77±4,54	469,89±37,56
ЛПС (контроль 2)	1	81,74±4,47*	2443,74±59,55*
ВРПС CrАl	20	182,02±4,96*#	4120,00±45,96*#
ВРПС CrSu	20	129,34±5,32*#	3820,54±54,64*#

Примечание. * р<0,05 к группе контроль 1; #  р<0,05 к группе контроль 2; n=10.

Note. * p<0.05 to control group 1; # p<0.05 to control group 2; n=10.

 

Инкубация спленоцитов мышей совместно с изучаемыми растительными полисахаридами приводила к статистически значимому усилению спонтанной выработки ИЛ-2 по сравнению с показателем контрольной группы и не влияла на стимулированную продукцию (при добавлении КонА) (табл. 6). Добавление ВРПС, выделенных из побегов боярышника алма-атинского, в культуру спленоцитов мышей достоверно снижала выработку ИФН-γ относительно значения в группе контроля и не влияло в случае использования полисахаридов боярышника мягковатого (табл. 6). При стимуляции спленоцитов митогеном – КонА, наблюдалось статистически значимое усиление продукции ИФН-γ при добавлении

изучаемых растительных полисахаридов по сравнению с показателем контрольной группы.

Таблица 6. Влияние водорастворимых полисахаридов, выделенных из побегов боярышника алма-атинского (ВРПС CrАl) и боярышника мягковатого (ВРПС CrSu), на спонтанную и стимулированную продукцию ИЛ-2 и ИФН-γ спленоцитами интактных мышей линии C57BL/6, (M±SEM)

Table 6. Effect of water-soluble polysaccharides isolated from shoots of Alma-ata hawthorn (WSPS CrAl) and soft hawthorn (WSPS CrSu) on the production of IL-2 and IFN-γ by splenocytes of intact C57BL/6 mice, (M±SEM)

Исследуемое вещество	Концентра-ция, мкг/мл	Концентрация ИЛ-2, пг/мл		Концентрация ИФН-γ, пг/мл
		спонтанная	+КонА	спонтанная	+КонА
ПКС (контроль)	–	1,47±0,17	1670,42±4,20	4,67±0,34	271,04±19,04
ВРПС CrАl	20	3,68±0,23*	1905,45±14,89	3,33±0,25*	1998,90±18,46*
ВРПС CrSu	20	3,38±0,27*	1461,06±13,46	4,80±0,40	1591,94±20,48*

Примечание. * р<0,05 к группе контроль; n=10.

Note. * p<0.05 to control group; n=10.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Полисахариды являются одним из важнейших компонентов высших растений. Полисахариды проявляют широкий спектр биологических свойств, включая антиоксидантное, противоопухолевое, антимутагенное, противовоспалительное, противомикробное, антикоагулянтное, гипогликемическое, гиполипидемическое  и гепатопротекторное действие [19]. Также есть данные об иммуномодулирующем потенциале растительных полисахаридов [20].

Многочисленные исследования показали, что растительные полисахариды могут регулировать иммунную систему несколькими способами и на нескольких уровнях. Они не только активируют иммунные клетки, включая Т-клетки, В-лимфоциты, макрофаги и естественные клетки-киллеры, но также активируют комплемент и способствуют выработке цитокинов, таким образом, демонстрируя регуляторные эффекты на иммунную систему несколькими способами [21,  22].

При изучении иммунотропных свойств водорастворимых полисахаридов, выделенных из побегов боярышника алма-атинского и боярышника мягковатого, было показано, что изучаемые полисахариды при курсовом введении мышам линии С57BL/6 стимулировали гуморальный иммунный ответ без повышения функциональной активности антителообразующих клеток и не влияли на развитие клеточного иммунного ответа.

Известно, что растительные водорастворимые полисахариды (ВРПС) взаимодействуя с Toll-like рецепторами макрофагов, запускают внутриклеточные сигнальные пути MAP-киназ и NF-κB, приводящие к значительному усилению экспрессии генов как прововоспалительных цитокинов (ФНО-α, ИЛ-6), так и индуцибельной NO-синтазы (iNOS) [23]. Многочисленными исследованиями доказано, что молекула оксида азота (NO) является универсальным трансмиттером различных патологических процессов, играющим важную роль в регуляции нервной, эндокринной и репродуктивной систем. NO вызывает расслабление гладких мышц сосудов, регламентирует апоптоз и пролиферацию, участвует в развитии адаптивных иммунных реакций, ингибирует репликацию патогенов. Антигенпрезентирующие клетки при контакте с антигеном секретируют NO, который регулирует функциональную активность, деление и гибель многих типов иммунных и воспалительных клеток, включая макрофаги, Т-лимфоциты, нейтрофилы, тучные и естественные киллерные клетки [24, 25].

Большинство растительных полисахаридов преимущественно взаимодействуют как с врожденной, так и с адаптивной иммунной системой, тем самым усиливая иммунитет хозяина и косвенно оказывая подавляющее действие на опухоли [26, 27]. В частности, растительные полисахариды оказывают значительное влияние на регуляцию иммунных реакций, изменяя активность и деятельность макрофагов. Полисахариды Astragalus, Panax и Dendrobium officinale оказывают иммуностимулирующее или активирующее действие на макрофаги, в первую очередь, затрагивая секрецию цитокинов, продукцию активных форм кислорода (ROS) и оксида азота (NO) и регуляцию многочисленных сигнальных путей [28].

В ходе проведенного исследования иммунотропной активности полисахаридов, выделенных из побегов боярышника алма-атинского и боярышника мягковатого, были обнаружены их значительные NO-стимулирующие свойства при добавлении в культуру перитонеальных макрофагов. При этом, NO-стимулирующая активность в основном не была связана с бактериальным эндотоксином. Исходя из полученной информации, можно сделать вывод о способности, исследованных полисахаридов боярышника мягковатого и алма-атинского, индуцировать активацию макрофагов по классическому пути, благодаря значительному увеличению активности NO-синтазы и подавлению индукции аргиназы.

Кроме этого, ВРПС, выделенные из побегов боярышника алма-атинского и боярышника мягковатого, стимулировали выработку провоспалительных цитокинов – ИЛ-1β и ФНО-α – макрофагами мышей даже более эффективно, чем стандартный активатор ЛПС, что свидетельствует о поляризации макрофагов в сторону М1.

Изучаемые растительные полисахариды активировали не только макрофаги, но и повышали спонтанную выработку ИЛ-2 и стимулированную продукцию ИФН-γ спленоцитами мышей.

Таким образом,  было показано, что ВРПС, выделенные из побегов боярышника алма-атинского и боярышника мягковатого, стимулируют реакции не только врожденного иммунитета, но и оказывают активирующее влияние на проявления адаптивного иммунитета, что свидетельствует о широком спектре иммунотропного действия изученных полисахаридов.

ВЫВОДЫ

1. Полисахариды, выделенные из побегов боярышника алма-атинского и боярышника мягковатого, стимулируют гуморальный иммунный ответ у экспериментальных животных, не влияя на протекание клеточного иммунного ответа.
2. Полисахариды, выделенные из побегов боярышника алма-атинского и боярышника мягковатого, способствуют поляризации макрофагов по классическому пути, благодаря увеличению активности NO-синтазы, подавлению индукции аргиназы и стимуляции выработки провоспалительных цитокинов – ИЛ-1β и ФНО-α.
3. Изучаемые растительные полисахариды оказывают стимулирующее воздействие не только на макрофаги, но и повышают спонтанную выработку ИЛ-2 и стимулированную продукцию ИФН-γ спленоцитами мышей.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Личный вклад каждого автора: Е.Ю. Шерстобоев – анализ полученных данных, обзор литературы, написание текста статьи; А.Д. Гирин – получение образцов, их стандартизация, оценка биологической активности изучаемых веществ; Е.С. Трофимова – концепция и дизайн исследования, оценка биологической активности изучаемых веществ, культуральные исследования; А.А. Лигачёва – оценка биологической активности изучаемых веществ, культуральные исследования, статистическая обработка данных; М.Г. Данилец –  оценка биологической активности изучаемых веществ, культуральные исследования; Н.С. Селиванова – оценка биологической активности изучаемых веществ, культуральные исследования; Е.И. Гулина – получение образцов, их стандартизация; А.Н. Савельева – получение образцов, их стандартизация; Н.В. Кудашкина – заготовка и подготовка сырья; С.Р. Хасанова – заготовка и подготовка сырья;  М.В. Белоусов – анализ полученных данных, написание текста статьи.

Финансирование. Работа выполнена за счет средств федерального бюджета Российской Федерации, выделенных на выполнение фундаментальных научных исследований в НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ № FGWM-2022-0017 (номер государственного учета НИР № 122020200058-6).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.

Этический комитет. Протокол исследования был одобрен биоэтическим комитетом НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ (протокол № 227012024 от 01.02.2024 г.).

Об авторах

Евгений Юрьевич Шерстобоев

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук, Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга"

Автор, ответственный за переписку.
Email: sherstoboev_eu@pharmso.ru
ORCID iD: 0000-0002-6178-5329

профессор, доктор медицинских наук, заведующий отделом иммунофармакологии 

Россия, Томск, Россия, 634028, пр. Ленина, д. 3

Александр Денисович Гирин

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук», Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга»

Email: sanya.girin.90@yandex.kz
ORCID iD: 0009-0005-0840-9569

аспирант лаборатории иммунофармакологии

Россия, Томск, Россия, 634028, пр. Ленина, д. 3

Евгения Сергеевна Трофимова

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук», Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга»; Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства
здравоохранения Российской Федерации

Email: eugenie76@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5367-715X

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории иммунофармакологии

Россия, Томск, Россия, 634028, пр. Ленина, д. 3; Томск, Россия, 634050, Московский тракт, д. 2

Анастасия Александровна Лигачёва

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук», Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга»

Email: vitelli@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3337-1516

кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории иммунофармакологии

Россия, Томск, Россия, 634028, пр. Ленина, д. 3

Марина Григорьевна Данилец

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук», Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга»

Email: m.danilets@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7862-4778

доктор биологических наук, заведующий отделом экспериментальных биологических моделей

Россия, Томск, Россия, 634028, пр. Ленина, д. 3

Наталья Сергеевна Селиванова

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук», Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга»;
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства
здравоохранения Российской Федерации

Email: selivan.ns@gmail.com
ORCID iD: 0009-0006-6218-3051

младший научный сотрудник лаборатории иммунофармакологии

Россия, Томск, Россия, 634028, пр. Ленина, д. 3; Томск, Россия, 634050, Московский тракт, д. 2

Екатерина Игоревна Гулина

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: e.gulina1@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3234-6845

кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры фармацевтического анализа

Россия, Томск, Россия, 634050, Московский тракт, д. 2

Анастасия Николаевна Савельева

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: violet.feel.2000@mail.ru
ORCID iD: 0009-0009-5726-9610

старший лаборант кафедры фармацевтического анализа

Россия, Томск, Россия, 634050, Московский тракт, д. 2

Наталья Владимировна Кудашкина

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: phytoart@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0280-143X

доктор фармацевтических наук, профессор, заведующий кафедрой фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии

Россия, Уфа, Россия, 450008, ул. Ленина, д. 3

Светлана Рашитовна Хасанова

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: svet-khasanova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7000-8014

доктор фармацевтических наук, профессор, профессор кафедры фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии

Россия, Уфа, Россия, 450008, ул. Ленина, д. 3

Михаил Валерьевич Белоусов

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: mvb63@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2153-7945

доктор фармацевтических наук, профессор, заведующий кафедрой фармацевтического анализа

Россия, Томск, Россия, 634050, Московский тракт, д. 2

Список литературы