Stress-protective effect of human lactoferrin on the model of experimental chronic stress in rats

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

В последние годы наблюдается тенденция к неуклонному росту стрессовых нагрузок, что приводит к увеличению частоты и интенсивности хронического стресса, обусловленного преимущественно психоэмоциональными факторами. Современный ритм жизни, характеризующийся высокой степенью напряженности, а также обилие нерешенных проблем, генерируемых динамикой социальных и профессиональных процессов, существенно влияют на психосоматическое состояние индивидов.

Стрессовые события могут вызывать многочисленные поведенческие, и нейрохимические изменения. Длительная стимуляция, вызванная стрессом, превышающим способность организма поддерживать гомеостаз, может приводить к психопатологическим событиям [1].

Роль стресса в психиатрических расстройствах хорошо продемонстрирована, в частности, эпидемиологические данные предоставили весомую поддержку идее о том, что стрессовые жизненные события играют роль в этиологии депрессии и тревожности [2].

Поиск путей коррекции таких нарушений — это актуальные задачи фундаментальной и клинической медицины.

В последнее время все чаще в качестве корректоров различных патологических процессов предлагается использовать эндогенные биорегуляторы, в частности, молекулярные факторы врожденного иммунитета.

Лактоферрин (ЛФ) – катионный гликопротеин с молекулярной массой около 80 кДа, относящийся к семейству трансферриновых железосвязывающих белков, ЛФ является одним из ключевых молекулярных компонентов системы врожденного иммунитета млекопитающих. Лактоферрин считается наиболее поливалентным белком, обнаруженным у позвоночных. В течение более чем 40 лет исследований для ЛФ было выявлено множество функциональных характеристик.

Помимо железосвязывающей функции, общей для всех белков трансферринового семейства, ЛФ обладает заметной как антимикробной, так и микробостатической активностью против широкого спектра микроорганизмов [3]. Наряду с этим, с ним связывают противовоспалительные, детоксицирующие и противоопухолевые эффекты in vivo [4].

В последнее время, появляются работы по стресс-протективному действию ЛФ. Так показано, что пероральное введение ЛФ крысам при постнатальном развитии улучшает их когнитивные способности в условиях стресса [5].

Наши исследования показали, что превентивное введение ЛФ человека экспериментальным животным нормализует стресс-индуцированные изменения числа нейтрофильных гранулоцитов в крови и снижает стресс-индуцированное повышение концентрации кортикостерона [6].

Цель настоящего исследования – оценка антистрессового действия лактоферрина человека на нарушение поведения лабораторных животных (крыс), вызванное хроническим стрессом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на самцах крыс линии Вистар. Условия содержания животных в виварии обеспечивали нормальный биологический фон и полностью соответствовали требованиям Санитарных правил по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) от 06.04.1973. Рацион животных соответствовал Приказу МЗ № 1179 от 1983 г. Эксперименты на лабораторных животных, выполненные в рамках данного исследования, отвечали требованиям нормативных документов, действующих в РФ и регламентирующих гуманное обращение с животными при проведении медико-биологических исследований, и были одобрены Локальным этическим комитетом при ФГБНУ «ИЭМ» (протокол заседания ЛЭК 6/20 от 21.10.2020).

Лактоферрин молока человека (чистота не менее 98% и насыщенность железом – 10-15%) был выделен методами ионообменной хроматографии и гель-фильтрации [7].

Модель хронического стресса

Для реализации стрессового воздействия на животных экспериментальной группы использовали модель хронического стресса у крыс, представляющая собой ежедневное принудительное плавание лабораторных животных в холодной воде [8, 9]. Экспериментальные животные – взрослые крысы-самцы породы Вистар весом около 200 г. – были разделены на четыре группы по 6 животных в каждой:

Группа 1 – интактные животные, без стрессового воздействия;

Группа 2 – животные, которым ежедневно в течение 11 дней перорально вводили ЛФ человека в дозе 200 мкг/кг веса;

Группа 3 – животные, которых поочередно подвергали принудительному плаванию в холодной воде (2–4 °С) в течение 2 мин ежедневно, в одно и то же время суток на протяжении 11 дней. Следующие 24 ч с лабораторными животными не проводили никаких манипуляций с целью исключения влияния эффектов другого вида стресса.

Группа 4 – животные, которых поочередно подвергали принудительному плаванию в холодной воде (2–4 °С) в течение 2 мин ежедневно в течение 11 дней и перорально вводили ЛФ человека в дозе 200 мкг/кг веса, перед плаванием.

На 12-й день после начала эксперимента исследовали поведенческие реакции животных.

Изучение поведенческих реакций животных

Регистрация поведенческих реакций животных проводилась в тесте «Открытое поле». Установка «Открытое поле» представляла собой открытую ярко-освещенную круглую арену диаметром 1 м с высотой стенок 40 см, расчерченную на центральные и периферические сектора, с отверстиями в дне. Животное помещали в центр арены и регистрировали поведение в течение 5 мин. Каждое животное помещалось в арену однократно с целью избежать эффекта привыкания к условиям теста. Поведенческие реакции, такие как, общая длина пройденного пути (дистанция), средняя скорость, а также показатели актов груминга, время нахождения в центре арены и ориентировочно-исследовательской реакции (заглядывание в «норки») регистрировали и анализировали с использованием программного обеспечения VideoMot 2 (TSESystems, Германия).

Статистическая обработка результатов

Сравнение полученных данных проводили с использованием пакета статистической обработки Statistica 10.0. На графиках представлены значения медиан и квартилей (рис. 1-3). Достоверность различий между группами оценивали с применением непараметрического U-критерия Манна – Уитни. За достоверный принимали уровень значимости 95 % (p < 0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование нарушений поведенческих реакций необходимо для понимания процессов, происходящих в мозге после стресса и выявления неврологического дефицита [10]. Тест «Открытое поле» также является стрессовым воздействием, и выявляет особенности реакции животных на новизну ситуации.

Анализ поведения животных в тесте «Открытое поле» показал, что в условиях использованной модели хронического стресса двигательная активность крыс по показателям дистанции, пройденной за время тестирования, и средней скорости передвижения не изменялась по сравнению с показателями двигательной активности контрольных животных, введение ЛФ также не оказывало существенного влияния на двигательную активность (рис. 1 и 2). Оценка локомоторной активности – неоднозначный показатель, поскольку увеличение пробега может трактоваться как увеличение стрессированности животных, а его уменьшение – как переход в оборонительную стратегию поведения [11]. Полученные нами данные могут свидетельствовать о том, что на фоне использованной модели стресса у крыс не развивается локомоторная дисфункция и астения. Что дает основание предполагать психоэмоциональную природу дальнейших изменений поведения. Отсутствие различий между группами 1 и 2 позволяет заключить, что ЛФ не оказывает влияния на мышечный потенциал.

Рис. 1. Двигательная активность крыс (дистанция, пройденная за время тестирования) после стрессового воздействия и введения ЛФ. Группы животных: 1 – интактные крысы; 2 – крысы, которым вводили ЛФ; 3 – стрессированные крысы; 4 – стрессированные крысы, которым вводили ЛФ.

Fig. 1. Motor activity of rats (running distance) after stress exposure and administration of LF. Animal groups: 1 – intact rats; 2 – rats administered LF; 3 – stressed rats; 4 – stressed rats administered LF.

 

Рис. 2. Двигательная активность крыс (средняя скорость передвижения) после стрессового воздействия и введения ЛФ. Группы животных: 1 – интактные крысы; 2 – крысы, которым вводили ЛФ; 3 – стрессированные крысы; 4 – стрессированные крысы, которым вводили ЛФ.

Fig. 2. Motor activity of rats (mean speed) after stress exposure and administration of LF. Animal groups: 1 – intact rats; 2 – rats administered LF; 3 – stressed rats; 4 – stressed rats administered LF.

 

Об эмоциональной реакции и состоянии скрытой тревожности у крыс судили по количеству актов груминга (рис. 3) и времени нахождения в центре арены (рис. 4). У стрессированных крыс количество актов груминга было достоверно больше, а время нахождения в центре меньше, чем у интактных животных, что свидетельствовало о повышении тревожности. Введение ЛФ на фоне стресса снижало количество актов груминга до уровня контроля, однако время нахождения в центре в этом случае достоверно не отличалось от показателей стрессированных и интактных животных. Введение ЛФ без стресса не влияло на эмоциональное состояние животных.

 

Рис. 3. Эмоциональная реакция крыс (по количеству актов груминга) после стрессового воздействия и введения ЛФ. Группы животных: 1 – интактные крысы; 2 – крысы, которым вводили ЛФ; 3 – стрессированные крысы; 4 – стрессированные крысы, которым вводили ЛФ. * Различия с группой 1 достоверны, U-критерий Манна – Уитни (p<0,05). # Различия с группой 4 достоверны, U-критерий Манна – Уитни (p<0,05).

Fig. 3. Emotional reaction of rats (by the number of grooming acts) after stress exposure and administration of LF. Animal groups: 1 – intact rats; 2 – rats administered LF; 3 – stressed rats; 4 – stressed rats administered LF. * Differences with the group 1 are significant, U-Mann–Whitney criterion (p<0.05). # Differences with the group 4 are significant, U-Mann–Whitney criterion (p<0.05).

 

Рис. 4. Эмоциональная реакция крыс (время в центре арены) после стрессового воздействия и введения ЛФ. Группы животных: 1 – интактные крысы; 2 – крысы, которым вводили ЛФ; 3 – стрессированные крысы; 4 – стрессированные крысы, которым вводили ЛФ. * Различия с группой 1 достоверны, U-критерий Манна – Уитни (p<0,05).

Fig. 4. Emotional reaction of rats (time in the center of the arena) after stress exposure and administration of LF. Animal groups: 1 – intact rats; 2 – rats administered LF; 3 – stressed rats; 4 – stressed rats administered LF. * Differences with the group 1 are significant, U-Mann–Whitney criterion (p<0.05).

 

Ориентировочно-исследовательскую реакцию (ОИР) у стрессированных крыс оценивали по числу заглядываний в «норки» (рис. 5). Показано, что у крыс после стресса ОИР по этому показателю была существенно угнетена, а введение ЛФ восстанавливало исследовательскую активность животных.

 

Рис. 5. Ориентировочно-исследовательская реакция крыс (по числу заглядывания в «норки») после стрессового воздействия и введения ЛФ. Группы животных: 1 – интактные крысы; 2 – крысы, которым вводили ЛФ; 3 – стрессированные крысы; 4 – стрессированные крысы, которым вводили ЛФ. * Различия с группой 1 достоверны, U-критерий Манна – Уитни (p<0,05). # Различия с группой 4 достоверны, U-критерий Манна – Уитни (p<0,05).

Fig. 5. Orienting-exploratory reaction of rats (by the number of looks into the "holes") after stress exposure and administration of LF. Animal groups: 1 – intact rats; 2 – rats administered LF; 3 – stressed rats; 4 – stressed rats administered LF. * Differences with the group 1 are significant, U-Mann–Whitney criterion (p<0.05). # Differences with the group 4 are significant, U-Mann–Whitney criterion (p<0.05).

ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные результаты дополняют данные, установленные другими исследователями на схожей модели хронического стресса у крыс. Было показано, что повторное принудительное плавание в теплой воде вызывает у животных депрессивно-подобное состояние, выражавшееся в снижении борьбы и увеличении времени неподвижности [12], что в нашей работе выражалось в увеличении количества актов груминга и уменьшении числа заглядываний в «норки».

На аналогичной модели принудительного плавания у мышей было показано, что добавление в рацион мышей ЛФ коровы в количестве 1% от коммерческого рациона в течение 14 дней уменьшало время неподвижности, вызванной стрессом [13]. Стоит отметить, что количество ЛФ человека (200 мкг/кг веса), вводимого перорально крысам в нашем эксперименте, значительно меньше 1% от рациона, но его достаточно, чтобы скорректировать депрессивно-подобное состояние животных.

Показано, что такое состояние у крыс может быть вызвано и другими хроническими воздействиями и купировано разными способами введения ЛФ. Так, внутрибрюшинная инъекция ЛФ коровы (100 мг/кг) крысам снизила стрессовое поведение в тесте условно-рефлекторного замирания, вызванного страхом, и в тесте приподнятого крестообразного лабиринта [14]. В вышеуказанном случае также можно отметить довольно высокую дозу вводимого препарата.

Интересный факт установили китайские исследователя, которые показали, что, если мышей дефицитных по ЛФ вскармливать после рождения молоком без ЛФ, то это впоследствии усиливает депрессивное поведение у взрослых мышей, подвергнутых хроническому непредсказуемому легкому стрессу, и этот механизм связан с повышенным повреждением нейронов [15].

Если говорить о возможных механизмах действия ЛФ, то не исключено прямое действие на уровне структур мозга. Есть данные по динамике поглощения и характеру накопления в тканях органов мышей ЛФ коровы. После перорального введения ЛФ переносился из кишечника в периферическую кровь в форме с неизмененной молекулярной массой (80 кДа) и локализовался в течение 10-20 мин в печени, почках, желчном пузыре, селезенке и головном мозге мышей [16]. Также обнаружены высокоспецифичные сайты связывания ЛФ человека в ядрах нейронов, астроцитов и микроглии в мозге мыши [17].

Локализация ЛФ человека в ядре не является неожиданной, так как для этого белка показана способность транслоцироваться в ядро, связываться с определенными последовательностями ДНК и активировать или ингибировать транскрипцию генов. Обычно это свойство связывают с наличием у ЛФ человека аминокислотной последовательности Gly-Arg-Arg-Arg-Arg, соответствующей области N-концевой части молекулы, богатой основными аминокислотами [18]. ЛФ коровы также является катионным белком, но однако у него в N-концевой части несколько другая последовательность основных аминокислотных остатков – Pro-Arg-Lys-Asn-Val-Arg, возможно такая разница в структуре и является причиной того, почему при использовании схожих моделей стресса требуется гораздо меньшее количество ЛФ человека по сравнению с ЛФ коровы, чтобы получить коррекцию депрессивно-подобного состояния у экспериментальных животных. Так, нами ранее было показано, что кортикостатическое действие ЛФ, выражающееся в коррекции стресс-индуцированного повышения концентрации кортикостерона в крови крыс, зависит от N-концевой аминокислотной последовательности [19].

Отдельно следует отметить, что в проведенном нами исследовании не выявлено специфического влияния ЛФ на исследованные показатели животных, не подвергавшихся стрессу. Что может свидетельствовать о некоторой степени безопасности использованных доз препарата в отношении нервной и опорно-двигательной систем.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование нарушений функций ЦНС после хронического стресса, вызванного многократным принудительным плаванием в холодной воде, на основе поведенческих тестов показало, что ориентировочно-исследовательская активность была значительно угнетена, также нарушался эмоциональный статус животных. Полученные данные свидетельствуют о том, что у стрессированных крыс развивался неврологический дефицит, который был частично компенсирован пероральным введением малых доз ЛФ человека (200 мкг/кг веса).

Таким образом, можно говорить о том, что ЛФ является не только эндогенным антимикробным и хелатирующим соединением. Кроме противоинфекционной защиты ЛФ вовлечен в более широкий круг защитных механизмов, в которых он может выполнять функцию эндогенного антидепрессанта, а также может служить многообещающим антидепрессантным препаратом.

 ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Т.А. Филатенкова, М.В. Шустов — проведение эксперимента, написание статьи, анализ данных; Г.М. Алешина — разработка общей концепции, анализ данных, написание статьи. Авторы одобрили версию для публикации, а также согласились нести ответственность за все аспекты работы, гарантируя надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой ее части.

Этическая экспертиза. Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» (протокол № 6/20 от 21.10.2020).

Источник финансирования. Работа выполнена в рамках государственного задания ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» FGWG-2025-0005.

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Оригинальность. При создании настоящей работы авторы не использовали ранее опубликованные сведения (текст, иллюстрации, данные).

Доступ к данным. Все данные, полученные в настоящем исследовании, доступны в статье.

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали.

ADDITIONAL INFO

Authors’ contribution. T.A. Filatenkova, M.V. Shustov — carrying out the experiments, article writing, data analyses; G.M. Aleshina — developing a general concept, data analyses, article writing. The authors have approved the version for publication and have also agreed to be responsible for all aspects of the work, ensuring that issues relating to the accuracy and integrity of any part of it are properly considered and addressed.

Ethics approval. The conduct of the study was approved by the local ethical committee of the Institute of Experimental Medicine (protocol No. 6/20 dated 21.10.2020).

Funding source. The work was carried out within the framework of the state assignment of the Institute of Experimental Medicine FGWG-2025-0005.

Disclosure of interests. The authors have no relationships, activities or interests for the last three years related with for-profit or not-for-profit third parties whose interests may be affected by the content of the article.

Statement of originality. The authors did not use previously published information (text, illustrations, data) to create this paper.

Data availability statement. All data obtained in the present study are available in the article.

Generative AI. Generative AI technologies were not used for this article creation.

 

About the authors

Galina M. Aleshina

Federal State Budgetary Scientific Institution ‘Institute of Experimental Medicine’

Author for correspondence.
Email: aleshina.gm@iemspb.ru
ORCID iD: 0000-0003-2886-7389
SPIN-code: 4479-0630

Doctor of Biological Sciences, Associate Professor, Head of the Laboratory of General Pathology of the Department of General Pathology and Pathophysiology, Institute of Experimental Medicine, Saint Petersburg, Russia.

Russian Federation, 12 Akademika Pavlova st., Saint Petersburg, 197022, Russia

Tatiana A. Filanenkova

FSBSI "Institute of Experimental Medicine"

Email: lero269@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-6911-7456
SPIN-code: 4198-3636
Russian Federation

Mark V. Shustov

Saint Petersburg State Chemical Pharmaceutical University

Email: shustovmark99@gmail.com
ORCID iD: 0009-0002-0105-7300
SPIN-code: 1918-0780
Russian Federation

References