Evaluation of the activity of antihypoxants with an isothiourea structure in a model of hypercapnic hypoxia with a shutdown of the cerebral hemispheres

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Изучение активности антигипоксантов, в том числе их защитного действия на мозг и отдельные его полушария, представляется чрезвычайно интересным и познавательным.

Ранее было исследовано влияние односторонней корковой распространяющейся депрессии на устойчивость самцов беспородных мышей к острой гипоксии с гиперкапнией [9]. Показано, что при активном правом полушарии продолжительность жизни животных была достоверно выше по сравнению с интактными, но не ложнооперированными (контрольными) особями. При активном левом полушарии были обнаружены достоверные различия по сравнению не только с интактными, но и контрольными животными. Таким образом, было выявлено левостороннее доминирование устойчивости мышей к гипоксии с гиперкапнией.

Для поддержания функционирования организма в условиях гипоксии применяют специальные средства — антигипоксанты. Один из лучших отечественных препаратов, защищающих от вредных гипоксических последствий, — амтизол [8]. Амтизол — препарат метаболического типа действия, как и большинство антигипоксантов [3], разработан в Военно-медицинской академии. Дальнейшие изыскания там же новых препаратов антигипоксической направленности привели к получению группы соединений тиазолоиндольного ряда, содержащих в своем строении изотиомочевинную группировку [7] и превосходящих по активности амтизол, например ВМ-606 [6]. Ранее было показано, что 2-аминобензотиазол, содержащий в своей структуре идентичный ВМ-606 и амтизолу фрагмент, также обладает антигипоксической активностью [5], причем превосходящей аналоги. Поэтому для исследования механизмов влияния гиперкапнической гипоксии на мозг мы выбрали 3 препарата моно-, би- и трициклической структуры, имеющие одинаковые фармакофорные фрагменты изотиомочевины в своем строении и обладающие высокой антигипоксической активностью. Структурные формулы соединений приведены на рис. 1.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 476 половозрелых самцах беспородных мышей. Гипоксию с гиперкапнией моделировали в стеклянных банках объемом 200 мл с герметичными крышками [12]. После завинчивания крышки банки переворачивали вверх дном и, чтобы избежать подсоса воздуха, опускали в кювету с водой. Регистрировали продолжительность жизни животных.

В опытах использовали следующие группы животных: интактные — 1-я группа, ложнооперированные (контрольные) — 2-я группа, мыши с выключением левого полушария — 3-я группа, с выключением правого полушария — 4-я группа; далее повторяют тот же набор с добавлением амтизола, 2-аминобензотиазола и ВМ-606. Препараты вводили внутрибрюшинно в эквимольных дозах 25, 32,5 и 50 мг/кг соответственно за 30 мин до гипоксического эпизода. В каждой группе было от 19 до 40 мышей.

Эксперименты выполняли сериями по 16–20 животных. В каждой серии все группы животных были представлены в равной степени. Все опыты выполнены в один и тот же период времени с 13.00 до 15.00, так как имеются указания на суточные колебания устойчивости к гипоксии белых крыс и мышей [1]. Временное выключение коры одного из полушарий или обеих гемисфер достигали путем эпидуральной аппликации фильтровальной бумажки, смоченной 25 % раствором хлорида калия [2, 9]. Для этого за 2 сут до эксперимента у животных под эфирным наркозом над одной или обеих гемисфер в кости черепа высверливали по отверстию диаметром около 1 мм. Аппликацию производили за 15 мин до тестирования. У ложнооперированных мышей, контрольных, проделывали все те же подготовительные операции, но без трепанации черепа и аппликации. Полученные данные подвергали компьютерной обработке с использованием стандартного статпакета GraphPad PRISM.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Результаты экспериментальных исследований приведены в табл. 1.

 

Таблица 1. Влияние односторонней корковой распространяющейся депрессии на продолжительность жизни мышей в условиях гипоксии с гиперкапнией до и после применения препаратов

Опыт	Группа	Неоперированные животные	Ложнооперированные (контроль)	Активно правое полушарие	Активно левое полушарие
Без препарата	Вся выборка	18,2 ± 0,57 (n = 51)	19,6 ± 0,84 (n = 20)	23,0 ± 1,05ИЛ (n = 22)	28,2 ± 2,49ИКП (n = 21)
	Низкоустойчивые	14,1 ± 0,31 (n = 17)	16,7 ± 0,55ИПЛ (n = 10)	19,0 ± 0,54ИКЛ (n = 10)	20,8 ± 0,93ИКП (n = 10)
	Высокоустойчивые	22,8 ± 0,71 (n = 17)	22,6 ± 0,83Л (n = 10)	27,1 ± 1,27Л (n = 10)	35,7 ± 3,96ИКП (n = 10)
Плацебо	Вся выборка	22,2 ± 0,55 (n = 55)	23,3 ± 1,47 (n = 20)	27,2 ± 1,58И (n = 20)	25,6 ± 1,55 (n = 20)
	Низкоустойчивые	17,7 ± 0,35 (n = 18)	18,1 ± 0,54 (n = 10)	21,7 ± 0,63ИК (n = 10)	20,8 ± 0,65ИК (n = 10)
	Высокоустойчивые	26,8 ± 0,61 (n = 18)	28,5 ± 1,72 (n = 10)	32,8 ± 1,83И (n = 10)	30,5 ± 2,10 (n = 10)
Амтизол	Вся выборка	27,2 ± 1,15 (n = 24)	25,2 ± 1,78П (n = 19)	37,9 ± 4,30ИКЛ (n = 19)	28,3 ± 1,72П (n = 19)
	Низкоустойчивые	22,9 ± 0,59 (n = 11)	19,8 ± 0,70ИПЛ (n = 9)	26,6 ± 1,14ИКЛ (n = 9)	22,2 ± 0,56КП (n = 9)
	Высокоустойчивые	31,6 ± 1,58 (n = 11)	30,8 ± 2,64 (n = 9)	49,7 ± 7,26ИКЛ (n = 9)	34,8 ± 1,88П (n = 9)
ВМ-606	Вся выборка	31,7 ± 2,17 (n = 24)	32,2 ± 1,67 (n = 24)	32,7 ± 1,62 (n = 25)	34,6 ± 1,83 (n = 25)
	Низкоустойчивые	24,2 ± 0,72 (n = 12)	25,9 ± 0,92 (n = 12)	26,3 ± 0,65 (n = 12)	26,9 ± 1,36 (n = 12)
	Высокоустойчивые	39,2 ± 2,98 (n = 12)	38,4 ± 1,92 (n = 12)	39,2 ± 1,98 (n = 12)	42,2 ± 1,65 (n = 12)
2-АБТ	Вся выборка	48,2 ± 2,52 (n = 23)	41,5 ± 2,97 (n = 25)	47,2 ± 2,94 (n = 25)	51,3 ± 3,73 (n = 25)
	Низкоустойчивые	38,4 ± 1,35К (n = 11)	29,5 ± 1,59ИПЛ (n = 12)	36,4 ± 1,90К (n = 12)	35,1 ± 1,99К (n = 12)
	Высокоустойчивые	57,2 ± 2,75 (n = 12)	54,0 ± 3,19Л (n = 12)	58,3 ± 3,71 (n = 12)	67,5 ± 3,43К (n = 12)

Примечание. Данные представлены в минутах. Буквами указаны достоверные различия с p < 0,01 по сравнению: И — с интактными, К — контрольными мышами; П — с животными с активным правым и Л — активным левым полушарием. Жирным шрифтом обозначено доминирующее полушарие.

 

Проведено сравнение влияния препаратов на различные экспериментальные группы животных по отношению к результатам, полученным с интактными группами соответственно (табл. 2).

 

Таблица 2. Влияние препаратов на продолжительность жизни по отношению к интактным животным по всем группам соответственно, %

Группа	Неоперированные животные	Ложнооперированные (контроль)	Активно правое полушарие	Активно левое полушарие
Амтизол
Вся выборка	146,2*	128,1*	164,8*	100,3
Низкоустойчивые	150,3*	120,4*	141,7*	105,1
Высокоустойчивые	143,1*	136,3*	186,1*	97,5
ВМ-606
Вся выборка	169,5*	164,8*	139,6*	128,0*
Низкоустойчивые	154,1*	150,9*	138,0*	140,8*
Высокоустойчивые	178,2*	174,3*	143,4*	120,2*
2-АБТ
Вся выборка	264,8*	211,7*	205,2*	181,9*
Низкоустойчивые	272,3*	176,6*	191,6*	168,8*
Высокоустойчивые	250,9*	238,9*	215,1*	189,1*

* Различия достоверны с p < 0,01.

 

Препараты увеличивают продолжительность жизни мышей при гиперкапнической гипоксии: амтизол в 1,46, ВМ-606 в 1,7, 2-АБТ в 2,65 раза. Ложная операция под воздействием препаратов скрадывает эффект прекондиции, существующий у интактных особей; оперативное вмешательство в разной степени уменьшает воздействие препаратов: ВМ-606 на 3,1 %, амтизола на 10,7 %, 2-АБТ на 20,0 %. Во всех группах исследованных препаратов при ложной операции более восприимчивыми к ее воздействию были высокоустойчивые (ВУ) особи.

Активация правого полушария для амтизола увеличивает силу воздействия на 12,7 %, для ВМ-606 и 2-АБТ уменьшает соответственно на 17,3 и 22,5 %. У всех препаратов при этой операции более восприимчивыми были ВУ-особи.

Активация левого полушария уменьшает силу воздействия для ВМ-606 и 2-АБТ соответственно на 24,5 и 31,3 %. Амтизол не оказал влияния при этой операции, отличий от интактной группы не было. У ВМ-606 более восприимчивыми при данной операции были низкоустойчивые (НУ) особи, а у 2-АБТ — ВУ-особи.

В табл. 3 приведены данные по продолжительности жизни по группам препаратов в отношении к группам плацебо соответственно.

 

Таблица 3. Влияние препаратов на продолжительность жизни опытных животных по отношению к плацебо, %

Группа	Неоперированные животные	Ложнооперированные (контроль)	Активно правое полушарие	Активно левое полушарие
Амтизол
Вся выборка	122,5	108,2	139,3	110,5
Низкоустойчивые	129,4	109,4	122,6	106,7
Высокоустойчивые	117,9	108,1	151,5	114,1
ВМ-606
Вся выборка	142,8	138,2	120,2	135,2
Низкоустойчивые	136,7	143,1	121,2	138,4
Высокоустойчивые	146,2	134,7	119,5	129,3
2-АБТ
Вся выборка	217,1	178,1	173,5	200,4
Низкоустойчивые	216,9	163,0	167,7	168,8
Высокоустойчивые	213,4	189,5	177,7	221,3

 

При сравнении действия групп препаратов с плацебо, который является контролем в наших исследованиях, выявили следующие закономерности. Препараты увеличивают продолжительность жизни мышей при гиперкапнической гипоксии по отношению к плацебо: амтизол в 1,22, ВМ-606 в 1,43, 2-АБТ в 2,17 раза. Во всех группах исследования манипуляций (по общей выборке) приводили к уменьшению действия препаратов, за исключением группы амтизола при активации правого полушария.

Ложная операция во всех исследуемых группах препаратов в разной степени уменьшила их воздействие: у амтизола на 14,3 %, у ВМ-606 на 4,6 %, у 2-АБТ на 39 %. В группах амтизола НУ- и ВУ-мыши отреагировали практически одинаково на операцию, в группе ВМ-606 на манипуляцию более положительно отозвались НУ-мыши, в группе 2-АБТ — ВУ-мыши.

Активация правого полушария в группе амтизола увеличивает продолжительность жизни опытных животных на 16,8 %, причем для ВУ особей это увеличение по отношению к неоперированным составило 33,6 %. В группе ВМ-606 НУ- и ВУ-особи отреагировали на активацию правого полушария практически идентично с потерей активности препарата на 22,6 %. Данная манипуляция в группе 2-АБТ тоже привела к потере активности на 43,6 %, колебания значений между НУ- и ВУ-особями были небольшими и составили 10 %.

Активация левого полушария уменьшает действие амтизола на 12 %, а особенно НУ-особей. Для группы ВМ-606 эта манипуляция понижает активность препарата на 22,6 %, причем ВУ- и НУ-мыши отреагировали на воздействие с небольшим разрывом в 9,1 %. Активация левого полушария в группе 2-АБТ приводит к меньшим потерям, чем активация правого, всего на 16,7 %, однако результаты для НУ- и ВУ-подгрупп разительно отличались, разрыв составил 52,5 %: НУ-особи «просели» относительно средних значений на 31,6 %, а ВУ — превысили уровень практически на 20 %. Препарат 2-АБТ в данном исследовании наивысший результат по антигипоксической защите проявил в группе ВУ-мышей при активации левого полушария.

В табл. 4 представлены данные, в которых мы рассматриваем как изменялась продолжительность жизни в опытных группах животных по каждому препарату по отношению к соответствующей группе неоперированных особей.

 

Таблица 4. Изменение продолжительности жизни мышей в различных экспериментальных группах по препаратам, %

Группа	Неоперированные животные	Ложнооперированные (контроль)	Активно правое полушарие	Активно левое полушарие
Амтизол
Вся выборка	100	92,6	139,3	104,0
Низкоустойчивые	100	86,5	116,2	96,9
Высокоустойчивые	100	97,5	157,3	110,1
ВМ-606
Вся выборка	100	101,6	103,2	109,1
Низкоустойчивые	100	107,0	108,7	111,2
Высокоустойчивые	100	98,0	100,0	107,7
2-АБТ
Вся выборка	100	86,1	97,9	106,4
Низкоустойчивые	100	76,8	94,5	91,4
Высокоустойчивые	100	94,4	101,9	118,0

 

По данным табл. 4 эффект прекондиционирования при ложной операции возник только в группе ВМ-606 у НУ-особей. В группе 2-АБТ ложная операция уменьшает продолжительность жизни на 13,9 %, в группе амтизола на 7,4 %. Активация правого полушария резко увеличивает продолжительность жизни в группе амтизола — на 39,3 %, в группах ВМ-606 и 2-АБТ незначительные колебания — на 3,2 и на 2,1 % соответственно. Активация левого полушария незначительно увеличивает продолжительность жизни во всех исследованных группах: амтизол на 4 %, ВМ-606 на 9,1 %, 2-АБТ на 6,4 %. Оперативные вмешательства в группах амтизола и 2-АБТ нашли положительный отклик у ВУ-особей, тогда как в группе ВМ-606 на препарат больше реагировали НУ-мыши. Причем наибольшее увеличение активности проявил амтизол при активации правого полушария в подгруппе ВУ-особей — превышение продолжительности жизни неоперированных животных на 57,3 %.

Логически вытекающим из изложенного выше было исследование активности изучаемых антигипоксантов при отключении обоих гемисфер. Полученные результаты приведены в табл. 5 и 6.

 

Таблица 5. Влияние односторонней и двусторонней корковой распространяющейся депрессии на продолжительность жизни мышей в условиях гипоксии с гиперкапнией до и после применения препаратов

Неоперированные животные	Ложнооперированные (контроль)	Активно правое полушарие	Активно левое полушарие	Оба полушария инактивированы
Без препарата
18,2 ± 0,57	19,6 ± 0,84Л	23,0 ± 1,05НЛО	28,2 ± 2,49НКП	29,4 ± 2,27НКП
Амтизол
27,2 ± 1,15	25,2 ± 1,78ПО	37,9 ± 4,30НКЛ	28,3 ± 1,72П	35,1 ± 2,12Л
ВМ-606
31,7 ± 2,17	32,2 ± 1,67	32,7 ± 1,62	34,6 ± 1,83	29,3 ± 1,19
2-АБТ
47,3 ± 2,22	40,5 ± 2,50	47,2 ± 2,94	51,3 ± 3,73	43,9 ± 3,23

Примечание. Данные представлены в минутах. Буквами указаны достоверные различия с p < 0,01 по сравнению: Н — с неоперированными, К — контрольными мышами; П — с животными с активным правым и Л — активным левым полушарием. Жирным шрифтом обозначено доминирующее полушарие.

Необходимо обратить внимание на два значения в табл. 6, равные 100 %. То есть амтизол при активном левом полушарии и ВМ-606 при выключении коры обеих гемисфер полностью (!) теряют свое антигипоксическое действие, которое было достаточно выраженным у животных без операции.

 

Таблица 6. Изменение продолжительности жизни мышей (%) в различных экспериментальных условиях под воздействием препаратов по отношению к соответствующей группе животных без препарата

Неоперированные животные	Ложнооперированные (контроль)	Активно правое полушарие	Активно левое полушарие	Оба полушария инактивированы
Амтизол
146,2*	128,1*	164,8*	100,3	119,4
ВМ-606
169,5*	164,8*	139,6*	128,0*	100,0
2-АБТ
257,1*	202,5*	205,2*	181,9*	149,3*

* Различия достоверны с p < 0,01.

 

Сравнение значений в первой (животные с интактным мозгом) и последней (полностью функционально декортицированные особи) колонках позволяет предположить, что:

1) амтизол имеет примерно равное антигипоксическое действие как в мозге, так и в организме (точнее 58 % — мозг, 42 % — остальной организм);

2) антигипоксическая активность 2-АБТ на 2/3 связана с мозгом и только на 1/3 с остальным организмом (69 против 31 %);

3) антигипоксическое действие ВМ-606 связано исключительно с мозгом.

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

В целом препарат 2-АБТ действовал сильнее амтизола и ВМ-606. Это объясняется частично тем, что, хотя препараты тестировались в эквимольных дозах, ЛД₅₀ у 2-АБТ самое низкое из всех соединений — 112,5 мг/кг и его доза составляет примерно 1/3 ЛД₅₀ (табл. 7).

 

Таблица 7. ЛД₅₀ соединений, рабочие дозы, водорастворимость

Препарат	ЛД50, мг/кг	Рабочая доза	Растворимость в воде
Амтизол	337	0,07 ЛД50	+
ВМ-606	1420	0,035 ЛД50	–
2-АБТ	112,5	0,289 ЛД50	+

 

Возможно, если использовать 2-АБТ в меньших дозах, то и эффект будет меньше. Однако для сравнения действия однотипных группировок в данной работе рассматривались эквимольные дозы. По литературным данным это соединение обладает гипогликемическим действием [4]. Несомненно, что оно, будучи высокоактивным антигипоксантом, обладает еще рядом фармакологических действий.

Все исследованные препараты имеют гетероциклическую структуру (рис. 1), поэтому, несмотря на различие физико-химических свойств, легко проникают через гематоэнцефалический барьер в мозг.

 

Рис. 1. Структурные формулы соединений: 1 — амтизол; 2 — 2-аминобензотиазол (препарат 2-АБТ); 3 — 2-амино-4-ацетилтиазоло[5,4-β]индол (препарат ВМ-606)

 

Для 2-АБТ и ВМ-606 наибольшие значения антигипоксической активности характерны при активном левом полушарии, а для амтизола — при активном правом полушарии, поэтому амтизол выгодно применять при инсультных отключениях левых полушарий, а ВМ-606 и 2-АБТ при отключениях любых полушарий, но лучшие результаты получены при отключении правых гемисфер (рис. 2).

 

Рис. 2. Изменение продолжительности жизни мышей в различных экспериментальных условиях при воздействии соединений по отношению к соответствующей группе животных без препарата. НО — неоперированные группы, ЛО — ложнооперированные группы, АПП — группы с активным правым полушарием, АЛП — группы с активным левым полушарием, ОПИ — группы с инактивацией обоих полушарий мозга

 

Ранее было показано аналогичное неравномерное воздействие амтизола на полушария мозга по биохимическим показателям [13], наше исследование полностью подтвердило их результат. Однако предложенная в данной статье методика исследования менее трудоемка и менее затратна.

Для амтизола и 2-АБТ при отключении полушарий наиболее восприимчивыми были ВУ-мыши, для ВМ-606 — НУ, у неоперированных животных — наоборот (табл. 3). Таким образом, препарат ВМ-606 должен лучше помогать ослабленной категории пациентов при инсультах.

На основании проведенных экспериментов можно обосновать выбор оптимального препарата — это ВМ-606. Тиазолоиндольное производное обладает самой большой терапевтической широтой действия, лучше и более равномерно потенцирует работу изолированных полушарий мозга (в противовес амтизолу), поскольку его антигипоксическое действие в этой модели связано исключительно с мозгом (табл. 6).

Препарат 2-АБТ при отключении полушарий (табл. 3) значительно теряет в антигипоксической активности, особенно у НУ-части особей. Если уменьшить рабочую дозу препарата в 4–5 раз, привести в соответствие с другими препаратами по ЛД₅₀, то, вероятнее всего, активность также значительно уменьшится.

Ранее мы провели сравнительные исследования [5] всех трех рассматриваемых препаратов на четырех экспериментальных моделях гипоксии, и в итоге более активным и перспективным был выбран ВМ-606. ВМ-606 отлично работает в моделях гипобарической, гистотоксической и гемической гипоксий, хотя там реализуются другие механизмы действия. Препарат обладает гепатопротекторной и актопротекторной активностью, высоким профилактическим противоэдематозным действием при затравке фосгеном [6]. В работе [11] показано психоседативное, стресс-протективное и потенцирующее снотворный эффект гексенала действие ВМ-606. Это позволяет говорить о влиянии препарата на центральную нервную систему, что вполне коррелирует с результатами, полученными в настоящем исследовании.

Использованная в данной работе экспериментальная модель позволяет достаточно легко оценить действие либо одного препарата, либо сравнить несколько лекарственных препаратов, их роль в работе полушарий мозга, на какую часть выборки — ВУ или НУ — они оказывают наибольшее воздействие. Достаточно универсальное антигипоксическое действие в данной модели оказывают соединение ВМ-606 и амтизол.

About the authors

Vera V. Marysheva

S.M. Kirov Military Medical Academy

Author for correspondence.
Email: vvmarysheva@yandex.ru

Dr. Biol. Sci. (Pharmacology), Assistant Professor

Russian Federation, 6 Acad. Lebedev str., Saint Petersburg, 194044

Vladimir V. Mikheev

S.M. Kirov Military Medical Academy

Email: vvmiheev@mail.ru

Dr. Sci. (Biol.)

Russian Federation, 6 Acad. Lebedev str., Saint Petersburg, 194044

Petr D. Shabanov

S.M. Kirov Military Medical Academy

Email: pdshabanov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1464-1127
SPIN-code: 8974-7477

Dr. Med. Sci. (Pharmacology), Professor

Russian Federation, 6 Acad. Lebedev str., Saint Petersburg, 194044

References