Mechanisms and triggers of adaptation to hypoxia

Full Text

Оптимальное производство и потребление энергоресурсных соединений в клетках и тканях обеспечивается системами доставки кислорода. Изменения концентрации кислорода в ту или иную сторону оказывают негативное воздействие на конечного «потребителя»: чрезмерно высокий уровень — гипероксия — токсичен, тогда как низкий уровень — гипоксия — в большинстве своем связан с развитием патологических состояний — ишемии органов и тканей, инициации и прогрессирования неопластических процессов. В то же время подпороговый (доклинический) уровень гипоксии обладает позитивным, тренирующим влиянием, адаптируя организм, находящийся в состоянии кислородного комфорта, к физическим нагрузкам. Под подпороговым уровнем гипоксии мы понимаем сохранение субъективного хорошего самочувствия пациента и отсутствие клинических проявлений по результатам его лабораторно-инструментального обследования.

На организменном уровне изменение концентрации кислорода во вдыхаемом воздухе компенсируется частотой и глубиной дыхания, системными и локальными изменениями скоростных характеристик кровотока. На клеточном и субклеточном уровнях изменения содержания кислорода могут инициировать ответы сетей сигнальных путей, которые приводят к изменениям в экспрессии определенных генов.

В настоящий момент принято считать, что отправной точкой адаптационных к гипоксии изменений служит группа факторов, относящихся к гипоксия-индуцируемым факторам (HIFs). Наиболее изученный представитель группы этих факторов — гипоксия-индуцируемый фактор-1 (HIF1).

HIF1 является транскрипционным фактором, который активируется при гипоксическом состоянии, состоящий из α- и β-субъединиц. В настоящий момент список мишеней HIF1 насчитывает более 70 генов и постоянно расширяется. Эти гены кодируют белки, которые задействованы во многих аспектах клеточной физиологии: клеточный метаболизм, пролиферация, деление и апоптоз, формирование и функционирование структур цитоскелета, адгезия, подвижность клеток, ангиогенез, эритропоэз, сосудистый тонус и т. д., вплоть до лекарственной устойчивости. Неудивительно, что HIF1 играет решающую роль в развитии как физиологических процессов, таких как адаптация и регенерация, так и патологических — неопластический рост, тканевая гипоксия и ишемия [1–3].

Первоначальные исследования показали, что в условиях нормоксии субъединица HIF1α подвергается быстрому разрушению, а в условиях гипоксии остается стабильной, тогда как субъединица HIF1β является структурной, так как экспрессируется в обоих случаях [4]. В нормоксических условиях в присутствии кислорода и железа субъединица HIF1α гидроксилируется ферментами пролилгидроксилазами. Затем модифицированной она распознается убиквитин-лигазным комплексом Е3, который содержит pVHL (опухолевый супрессор von Hippel-Lindau), полиубиквитинируется (рис. 1) и подвергается протеолизу.

 

Рис. 1. Протеолитическое убиквитинирование HIF1α [4]

 

В случае сниженной концентрации клеточного кислорода пролил-гидроксилирование естественным образом затормаживается, что приводит к увеличению уровня белка HIF1α [5–13]. Субъединица HIF1α гидроксилируется ферментом аспарагинилгидроксилазой в присутствии кислорода и железа [9, 14, 15]. При уменьшении концентрации кислорода аспарагинил-оксилирование белка HIF1α блокируется. Стабилизированный и активированный белок HIF1α транслоцирует в ядро, где он гетеродимеризуется с субъединицей HIF1β и связывается с HRE (hypoxia response elements), присутствующими на промоторах генов-мишеней HIF1 [16]. Этот комплекс запускает такие коактиваторы, как CBP/p300, и расширяет транскрипцию (рис. 2). В дополнение к гидроксилированию, активность HIF1 также регулируется другими посттрансляционными механизмами: фосфорилирование, ацетилирование, S-нитрозирование и убиквитинирование [17].

 

Рис. 2. Метаболиты HIF1.

SDF1 — стромальный клеточный фактор 1, SCF — комплекс SCF, EPO — эритропоэтин, PDGFB — субъединица В тромбоцитарного фактора роста, CXCR4 — хемокиновый рецептор, C-KIT — рецептор тирозинкиназы с-kit, VEGFR2 — рецептор васкулярного эндотелиального фактора роста, EPOR — рецептор эритропоэтина, TIE2 — тирозинкиназный рецептор 2, PDGFR — рецептор тромбоцитарного фактора роста, MSC — миелоциты, BMDAC — миелоидные дендритные клетки, EPC — эндотелиальные прогениторные клетки, EC — энтерохромаффинные клетки, SMC — васкулярные гладкомышечные клетки. Адапатировано G. Semensa

 

Использование HIF1 в качестве терапевтической мишени для профилактики и лечения ишемических повреждений и заболеваний представляет уникальную возможность кардинально изменить ситуацию с такими социально значимыми патологическими гипоксия-ассоциированными состояниями, как ишемическая болезнь сердца, ишемические повреждения головного мозга, и другими заболеваниями, связанными с недостаточностью снабжения органов и тканей кислородом.

Алкалоиды — производные аминокислот

Первым природным соединением, показавшим способность активировать HIF1, был дефероксамин (DFO) [18, 19]. Дефероксамин впервые был идентифицирован как сидерохром Streptomyces pilosus, который осуществляет хелацию ионов трехвалентного железа [Fe(III)] [8] (рис. 3).

 

Рис. 3. Дефероксамин

 

Дефероксаминовый мезилат (Desferal Mesylate®) используется в клинике в качестве антагониста тяжелых металлов при отравлениях железом и алюминием [20]. DFO индуцирует ДНК-связывающую активность HIF1 и увеличивает уровни мРНК эритропоэтина, одной из мишеней HIF1, в культивируемых клетках [эксперимент проведен на клетках Hep3B и клетках яичника китайского хомячка (CHO)] [18]. С этого момента DFO широко используется в качестве миметика гипоксии и активации HIF1. DFO относится к водорастворимым соединениям и имеет сродство к хелатированию ионов Fe³⁺. Вероятно, что при блокаде поглощения ионов внутриклеточного железа происходит ингибирование пролил- и аспарагинилгидроксилаз, что соответственно приводит к активации HIF1.

Для получения ионов железа от белков хозяина микобактерии туберкулеза выделяют десферри-экзохелины (DFE, сифилофоры с высоким содержанием железа) [21]. Использование DFE722 SM вызывает внутриклеточную индукцию белка HIF1α, что соответственно активирует комплекс HIF1, затем наблюдается экспрессия известных HIF1-мишеней, таких как VEGF (васкулярный эндотелиальный фактор роста) и NIP3 (активатор апоптоза) в клеточной линии MDA468 [22]. И DFO, и DFE, представляют собой высокоаффинные хелаторы Fe(III).

Циклопирокс оламин (Loprox®, 6-циклогексил-1-гидрокси-4-метил-2(1H)-пиридон 2-аминоэтанол) — широко известно противогрибковое средство, применяемое для лечения пациентов с инфекциями кожи и ногтей (рис. 4) [20, 23].

Циклопироксоламин стабилизируют белок HIF1α в клетках HepG2, индуцирует его транслокацию, облегчает связывание HIF1 с HRE, что способствует активации HIF1. Циклопироксоламин по меньшей мере в 10 раз более эффективен, чем дезферриоксамин при активации HIF1 in vitro. В то же время активация HIF1, индуцированная циклопироксоламином, может блокироваться ионами Fe²⁺ и Al²⁺. Вероятно, циклопироксоламин действует так же, как хелатор железа, и активирует HIF1 путем ингибирования HIF-пролил- и аспарагинилгидроксилаз. Известно, что циклопироксоламин индуцирует экспрессию мишеней HIF1, таких как VEGF, GLUT-1 (транспортер глюкозы-1) и альдолаза in vitro (клетки HepG2), и стимулирует ангиогенез, как следствие индукции VEGF in vivo [23–25].

Соединение 8-метилпиридоксатин, структурно связанное с циклопироксоламином, индуцирует экспрессию эритропоэтина в клетках Hep3B человека, активирует HIF1 по результатам отчетного анализа на основе CHO-клеток и индуцирует белок HIF1α в клетках HepG2 [24].

Известно, что уровень белка HIF1α снижается в течение длительной инкубации (24 ч) в условиях аноксии или жесткой гипоксии (0,1 % O₂) в клеточной линии RKO [26]. Это же исследование показало, что два производных индирубина (5-иодиндирубин-3'-оксим и 5-метилиндирубин-3'-оксим) препятствовали уменьшению концентрации белка HIF1α через механизм ингибирования киназы глюкогенсинтазы 3β (GSK3β) и увеличения трансляции белка HIF1α. Индирубин получают из растений рода индиго, он является действующим веществом в китайском растительном лекарственном средстве под названием «Dang Gui Long Hui Wan», которое используется в терапии хронического миелолейкоза.

Деполимеризаторы микротрубочек

Деполимеризаторы микротрубочек (MDA) разрушают микротубулярную сеть и блокируют деление опухолевых клеток. Алкалоиды растений винбластин и колхицин, а также синтетический MDA — нокодазол — индуцировали белок HIF1α в различных клеточных линиях: карцинома легких A549, MCF-7, Jurkat T-клеточная лейкемия и мышиный эмбриональный фибробласт NIH-3T3 [27–30]. В подтверждение этой теории, противоопухолевый препарат Таксол®, способствующий полимеризации и стабилизации микротрубочек, не вызывает активации HIF1.

 

Рис. 4. Циклопироксоламин

 

Фенольные соединения

Дибензоилметан (DBM), обнаруженный в лакрице (Glycyrrhiza glabra), стабилизирует белок HIF1α в нескольких клеточных линиях: карцинома предстательной железы человека LNCaP и PC-3, HEK 293 и первичные кардиомиоциты новорожденных крыс [31, 32]. Индукция белка HIF1α коррелировала с повышенной активностью HIF1 в линии HEK 293 и повышенной экспрессией VEGF на уровне секретируемого белка в линиях LNCaP и первичных кардиомиоцитов. В то же время два других структурно родственных соединения DBM (дибензоилпропан и куркумин) не вызывали индукцию белка HIF1α в клетках линии HEK 293. Вероятно, за счет ингибирования пролилгидроксилазы DBM может препятствовать разрушению белка HIF1α. На это указывает отсутствие убиквитинирования HIF1 α при индукции DBM.

Флавоноидный кверцетин встречается в красном вине, винограде и многих других растениях. Известно, что в нормоксических условиях кверцетин (3,3', 4', 5,7-пентагидроксифлавон) активирует HIF1 в клеточной линии HeLa и эндотелиальных клетках мозга мышей (MBEC) [33]. Кверцетин стабилизирует белок HIF1α в клетках HeLa, индуцирует его транслокацию и увеличивает экспрессию мишеней HIF1 (VEGF и GLUT-1) в клетках MBEC. Снижение активности HIF1 наблюдалось при применении кверцетина в условиях гипоксии. Недавнее исследование показало, что кверцетин также подавляет аспарагинилгидроксилазу, по своей сути являющуюся ингибитором HIF (FIH), в нормальных условиях [34].

Зеленый чай (сушеные свежие листья растения Camellia sinensis L. Ktze., семейства Theaceae) — один из самых популярных напитков во всем мире. Считается, что катехины зеленого чая [эпикатехин (ЕС), эпигаллокатехин (EGC), эпикатехин-3-галлат (ECG) и эпигаллокатехин-3-галлат (EGCG)] придают основные полезные свойства этому напитку. Было обнаружено, что в клетках T47D карциномы молочной железы человека ECG активирует HIF1 при высоких концентрациях (100 мкМ) [35]. Наиболее широко изучаемый катехин EGCG также показал умеренное увеличение активности HIF1. Несмотря на то что ECG и EGCG за исключением одной гидроксильной группы практически идентичны, EGCG относительно нестабилен в водном растворе [36, 37]. Дальнейшее исследование активации HIF1 показало, что ECG индуцирует накопление ядерного белка HIF1α и активирует экспрессию HIF1 мишеней, которые включают VEGF, GLUT-1 и CDKN1A (ингибитор циклически зависимости киназы 1A; p21^{waf1 / cip1}) [36].

Доноры оксида азота

Еще одна группа природных соединений, активаторов HIF1, полученных из аминокислот, — это доноры оксида азота (NO). Первоначальные исследования показали, что NO ингибирует активацию HIF1 в гипоксических условиях [38–43]. Сайт связывания HIF1 в VEGF-промоторе человека фактически определяет NO-индуцированную активацию транскрипции VEGF в условиях нормоксии [44]. NO-донор — S-нитрозо-N-ацетил-D, L-пеницилламин (SNAP) — индуцировал накопление белка HIF1α, повышал активность связывания димера HIF1 и активировал транскрипцию из промотора VEGF в клетках глиобластомы человека A-172 и клетках Hep3B. Другой донор NO, 3-[гидрокси-1-(1-метилэтил)-2-нитрозогидразино]-1-пропанамин (NOC5), также активировал промотор VEGF. В гладкомышечных клетках эндотелия легочной артерии и аорты крыс донор NO диазен-1-иум-1,2-диолат (NOC-18) индуцировал белок HIF1α, увеличивал экспрессию белка HIF1β и активировал экспрессию гена-мишени HIF1 — гем-оксигеназы-1 (HO-1) [45–47]. Степень индукции HIF1 NOC-18 имеет прямую дозо-временнýю зависимость (оптимальная индукция: 500 мкМ, 3–4 ч). Реверсированная NOC-18-индуцированная активация HIF1 дитиотреитолом (DTT) предполагает механизм, который включает внутриклеточное S-нитрозилирование или окисление белковых меркаптанов. Последующие исследования показали, что S-нитрозилирование стабилизирует белок HIF1α и способствует взаимодействию между белком HIF1α и коактиватором р300, тем самым усиливая активацию HIF1 [48, 49]. Биохимические исследования показывают, что в активных сайтах HIF-гидроксилаз NO может связываться с Fe²⁺, блокировать связывание O₂ и таким образом ингибировать реакцию гидроксилирования [50–52]. Ингибирование гидроксилаз, дестабилизирующих и инактивирующих белок HIF1α, также может способствовать NO-опосредованной активации HIF1 в экспериментальных условиях. Для активации различных сигнальных путей в нормальных условиях были протестированы различные пороги концентрации и время экспозиции NO, получаемого от структурно различных доноров [53]. Активация HIF1, вызванная NO, вероятно является результатом комбинированной модуляции различных сигнальных путей с подключением комбинации связанных между собой механизмов.

Терпены/стероиды

Эстроген 17β-эстрадиол (E2) метаболизируется в печени ферментом цитохромом P450 в 2-гидроксиэстрадиол (2-OHE2) и 4-гидроксиэстрадиол (4-OHE2). Соединение 4-OHE2 в клетках карциномы яичников человека OVCAR-3 и A2780-CP70 индуцирует белок HIF1α (оптимальная индукция наблюдалась при концентрации 100 мкМ и 3-часовой экспозиции). Наблюдалось также увеличение концентрации VEGF. Предположительно, 4-OHE2 индуцирует белок HIF1α и увеличивает секретируемый белок VEGF посредством сигнального пути PI3K/AKT/mTOR. В то же самое время E2 (100 нМ) ингибирует гипоксическую активацию HIF1 в клетках Hep3B [54].

Метаболит тестостерона дигидротестостерон (1 нМ) индуцирует белок HIF1α и активирует HIF1 в андрогензависимых клетках LNCaP [32]. Аналогичные эффекты наблюдались в присутствии метаболически стабильного синтетического андрогена метилтриенолона (R1881) при концентрации 0,1 нМ. Поскольку андрогены не являются прямыми стимуляторами HIF1, для его активации требуется значительно больше времени в отличие от действия таких прямых активаторов, как хелаторы железа или непосредственно гипоксии.

Углеводы и продукты гликолиза

Одна из групп генов-мишеней HIF1 представляет собой переносчики глюкозы и гликолитические ферменты, которые способствуют гликолизу [3]. Идентификация глюкозы и гликолитических конечных продуктов пирувата и лактата в качестве стимуляторов HIF1 помогла установить двустороннюю связь между гипоксией и аэробным гликолизом. Было показано, что в клетках глиомы человека (U87, U373 и U251) глюкоза, пируват и лактат в зависимости от дозы и экспозиции индуцируют ядерное накопление белка HIF1α. Дальнейшее исследование с использованием фармакологических ингибиторов определило пируват в качестве основного гликолитического метаболита, который индуцирует белок HIF1, предотвращая его разрушение. Активация мишеней HIF1, включающих VEGF, EPO, GLUT3 и альдолазу A, наблюдалась в присутствии и глюкозы, и пирувата [55]. Одно промежуточное звено цикла Кребса (TCA) — оксалоацетат — индуцирует белок HIF1α, активирует HIF1 и индуцирует экспрессию генов-мишеней HIF1 в клетках U87 и U251 [17].

Другие активаторы HIF1

К другим группам индукторов химической гипоксии относятся хелаторы железа и переходные металлы. Кобальт был первым переходным металлом, используемым для активации HIF1 [56–58]. Было показано, что никель, хром(VI) и медь активируют HIF1 [29, 59–63]. Органомеркулярное соединение мерсалил активирует HIF1 и его гены-мишени через инсулиноподобный рецептор фактора роста-1 и путь MAPK [64]. Было продемонстрировано, что кобальт и никель активируют HIF1, разрушая внутриклеточный аскорбат, кофактор для гидроксилаз HIF, дестабилизирующий и инактивирующий белок HIF1 [65].

Все больше появляется доказательств, что HIF1 выступает в роли общего регулятора клеточных реакций на внешние, а также внеклеточные и внутриклеточные сигналы [66]. Негипоксические физиологические стимулы, такие как факторы роста, цитокины и гормоны, так же могут индуцировать белок HIF1α и соответственно активировать HIF1. Активация HIF1 инсулином приводит к увеличению экспрессии генов-мишеней HIF1, таких как IGF-2, IGF-связывающий белок (IGFBP) 2 и IGFBP-3 [67, 68].

Перспективы использования прекондиционирования и HIF1 в качестве мишени воздействия

Вне зависимости от причин недостаточное поступление тканевого кислорода затормаживает или полностью останавливает энергетический обмен. На текущий момент в практической медицине нет универсального средства, способного запустить обходные пути бескислородного энергообмена. Одним из таких переходных тонких механизмов регуляции, саморегуляции и восстановления могут служить механизмы и пути энергообмена, отправной точкой которых является HIF1.

Доказательством этого может служить феномен прекондиционирования, в том числе его наиболее изученный вариант — ишемический, все чаще используемый в хирургическом лечении пациентов с заболеваниями, связанными с недостаточностью кровоснабжения, а следовательно, и локальной гипоксией, который по своей сути является умышленным «ухудшением» окружающих условий и вызывает активацию механизмов адаптации на базе именно HIF1. В одном из наших исследований мы показали изменение концентрации HIF1 в ответ на экзогенный стресс в головном мозге [69], что также можно отнести к «ухудшению» окружающих условий. Оба метода: и ишемическое прекондиционирование, и стрессогенное воздействие, вызывают количественное изменение концентрации HIF1. Однако они не могут быть широко применимы в клинической практике. Первый — из-за специфики применения методики и высокого риска возникновения дополнительных ишемических повреждений, второй — стрессогенное воздействие — по своей сути является экспериментальной моделью и невозможен к применению в практической медицине.

Отдельного упоминания заслуживают методики физической тренировки. Тренировочный процесс, безусловно, энергетически более затратен по сравнению с состоянием физиологического комфорта. При повышенной физической нагрузке организм находится в состоянии кислородного и энергетического «голода». И до определенного момента адаптация к нагрузке компенсируется на органном и системном уровнях в виде увеличения частоты дыхания, сердечных сокращений, перераспределении кровотока и изменении его скоростных характеристик. В обычной повседневной жизнедеятельности человека этого вполне достаточно. Однако у спортсменов высокого уровня наблюдается более сдержанная реакция сердечно-сосудистой и дыхательной систем на стрессовую физическую нагрузку. Вероятно, регулярный тренировочный процесс, стресс от максимальных физических нагрузок вызывают адаптацию на более тонком тканевом, клеточном и субклеточном уровнях. Особенно показательны в этом плане адаптационные возможности организма при тренировках в условиях естественной гипоксии — гипоксической гипоксии. Результаты спортсменов, прошедших спортивные сборы в высокогорье, значительно превышают аналогичные показатели в обычных условиях. Похожее явление мы наблюдали в ходе одного из наших исследований, в котором были смоделированы длительные условия нормоксической гипоксии. При этом снижение концентрации кислорода было обеспечено вытеснением его из дыхательной смеси азотом [70]. Является ли непосредственно азот или сама гипоксия активатором адаптационных изменений в данном исследовании еще предстоит изучить, однако с уверенностью можно сказать, что токсического влияния выбранной концентрации азот дыхательной смеси на умственную и физическую работоспособность, когнитивные функции, функционирование внутренних органов и систем не обнаружено. С учетом того, что метаболиты азота — это природные активаторы HIF1, применение его в качестве фармакологического агента, запускающего феномен прекондиционирования на базе HIF1, перспективно с точки зрения клинической медицины.

Большое количество сигнальных путей, регулирующих синтез и функционирование HIF1, их запутанность и многовекторность, представляют определенную проблему поиска новых активаторов HIF1, имеющих терапевтический потенциал. Ишемизированные ткани имеют нарушенную систему кровоснабжения и находятся в хрупком энергетическом балансе. Индукция белка HIF1α не обязательно приводит к активации HIF1 и адаптации к гипоксии: ингибиторы протеасом, такие как MG-132 и лактацистин, индуцируют белок HIF1α, препятствуя его разрушению, в то же время эти соединения фактически сами ингибируют активацию HIF1 [71]. Помимо самого фармакологического агента, ключевым решением может служить и способ доставки его к органам-мишеням. К принудительной активации HIF1 следует относиться с осторожностью и рассматривать каскады адаптивных реакций на его основе как тонко устроенный процесс, поскольку его чрезмерная активность может вызвать нежелательные системные патологические последствия. Вопрос о применении в профилактических целях феномена фармакологического прекондиционирования или в качестве лечебной методики остается открытым.

About the authors

Andrey V. Lyubimov

Institute of Experimental Medicine; S.M. Kirov Military Medical Academy

Email: lyubimov_av@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9829-4681

PhD (Med.)

Russian Federation, 12 Academika Pavlova str., 197376, Saint Petersburg; 6, Acad. Lebedeva street, Saint Petersburg, 194044

Dmitriy V. Cherkashin

Institute of Experimental Medicine; S.M. Kirov Military Medical Academy

Email: cherkashin-dmitr@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1363-6860
SPIN-code: 2781-9507

Doctor of Medical Sciences

Russian Federation, 12, Acad. Pavlov Street, Saint-Petersburg, 197376; 6, Acad. Lebedeva street, Saint Petersburg, 194044

Semen V. Efimov

Military Medical Academy. S. M. Kirov

Author for correspondence.
Email: sve03@rambler.ru

PhD, Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, 6, Acad. Lebedeva street, Saint Petersburg, 194044

Andrey E. Alanichev

Military Medical Academy. S. M. Kirov

Email: alanichevae80@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4135-5815

PhD, Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, 6, Acad. Lebedeva street, Saint Petersburg, 194044

Valeriy S. Ivanov

Military Medical Academy. S. M. Kirov

Email: ivanovmed84@mail.ru
SPIN-code: 1965-4741

Senior Clinic Resident

Russian Federation, 6, Acad. Lebedeva street, Saint Petersburg, 194044

Gennadiy G. Kutelev

Military Medical Academy. S. M. Kirov

Email: gena08@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-6489-9938
SPIN-code: 5139-8511

PhD, Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, 6, Acad. Lebedeva street, Saint Petersburg, 194044

References